Fixative Karnovsky Mencegah Artifak Muncul Sebagai Vakuolasi Terhasil Daripada Pemprosesan Tisu dalam Buah Pinggang yang Dirawat Dengan Antisense Oligonucleotide Ⅰ

Abstrak: Oligonukleotida antisenseTerapi (ASO) telah dikenal pasti sebagai modaliti rawatan baharu untukpenyakit sukar dikawal. Dalambuah pinggang dirawat dengan ASO, vakuol, sebagai tambahan kepada granul basofilik, sering diperhatikan dalam tubul proksimal. Beberapa laporan telah menerangkan bahawa vakuol ini berkemungkinan merupakan fenomena sekunder yang terhasil daripadapengekstrakan ASOsemasa pemprosesan tisu. Dalam kajian ini, kami membandingkan morfologi buah pinggang selepas penetapan dengan fiksatif Karnovsky atau penimbal fosfat paraformaldehid 4% (PFA) dengan 10% larutan formaldehid terpenampan neutral (NBF). Tikus Sprague-Dawley betina, dirawat secara intravena empat kali dengan asid nukleik terkunci 50 mg/kg yang mengandungi antisense oligonucleotides (LNA-ASOs) selama 1 atau 2 minggu, telah diperiksa. Secara mikroskopik, vakuol dan granul basofilik dalam tubul proksimal diperhatikan dalam buah pinggang yang diperbaiki dengan NBF. Granul basofilik menunjukkan pengumpulan ASO. Selain itu, beberapa vakuol juga mengandungi butiran basofilik yang lemah, menunjukkan bahawa vakuol itu berkaitan dengan pengumpulan ASO. Walaupun vakuolasi sederhana diperhatikan dalam tubul proksimal, sebahagian besar epithelia yang dikosongkan adalah negatif untuk molekul kecederaan buah pinggang-1 pada pewarnaan imunohistokimia. Vakuol dalam tubul proksimal tidak diperhatikan dalam sampel yang tertakluk kepada penetapan Karnovsky, walaupun butiran basofilik diperhatikan. Dalam sampel yang tertakluk kepada penetapan PFA, vakuol dan granul basofilik diperhatikan dalam tubul proksimal, serupa dengan sampel yang tertakluk kepada penetapan NBF. Secara keseluruhannya, penemuan kami menunjukkan kemungkinan terlalu banyak anggaran vakuolasi disebabkan oleh artifak semasa pemprosesan tisu apabila menggunakan penetapan NBF konvensional. Fiksatif Karnovsky dianggap sebagai alternatif yang berguna untuk membezakan vakuol tiruan daripada nefrotoksisiti sebenar. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Kata kunci:oligonukleotida antisense, artifak,Fiksatif Karnovsky, vakuolasi, granul basofilik, buah pinggang

Suplemen Cistanche Suplemen Sokongan Fungsi Ginjal PhGs75% Ech 30% Bertindak 12%

Baru-baru ini, terapi antisense oligonucleotide (ASO) telah ditubuhkan sebagai modaliti baharu untuk rawatan penyakit sukar dikawal1, 2. ASO ialah oligodeoksinukleotida bertali tunggal yang pendek, sintetik, yang mengikat asid ribonukleik dan menyekat ekspresi gen3.

Dari segi toksikologi, ketoksikan yang disebabkan oleh ASO dikategorikan kepada ketoksikan bergantung kepada hibridisasi, yang berkaitan dengan jujukan ASO, dan ketoksikan bebas hibridisasi, yang berkaitan dengan pengubahsuaian kimia. Ketoksikan bebas hibridisasi disebabkan oleh tiga mekanisme utama: 1) Pengumpulan ASO, 2) kesan pro-radang, dan 3) kesan pengikatan aptamerik4. Pengumpulan ASO terutamanya diperhatikan dalam hati dan buah pinggang, dan pengumpulan yang berlebihan membawa kepada disfungsi organ-organ ini5. Kesan pro-radang disebabkan oleh rangsangan sistem imun semula jadi melalui pengikatan kepada reseptor seperti Tol dalam tikus dan monyet atau pengaktifan laluan pelengkap alternatif melalui perencatan faktor H oleh ASO dalam monyet6. Kesan pengikatan aptamerik mendorong pengaktifan platelet dan pengagregatan/trombositopenia untuk mengikat reseptor khusus platelet7. Selain itu, pengikatan aptamerik kepada protein intraselular dalam hepatosit dianggap sebagai salah satu punca hepatotoksisiti8-10. Untuk mengesan ketoksikan ini, penyelidik telah membangunkan beberapa ujian bukan klinikal; antaranya, pemeriksaan histopatologi adalah salah satu ujian yang paling sensitif untuk mengesan pengumpulan ASO.

Secara histopatologi, pengumpulan ASO biasanya diperhatikan sebagai granul basofilik dalam sitoplasma sel Kupffer dalam hati atau tubul proksimal buah pinggang. Pengumpulan butiran basofilik yang ketara dikaitkan dengan peningkatan kejadian atau keterukan perubahan degeneratif, biasanya diperhatikan sebagai vakuolasi atau degenerasi/nekrosis epitelium tiub proksimal dalam buah pinggang4. Butiran basofilik sahaja tidak dianggap penting secara toksikologi11; oleh itu, pembezaan pengumpulan granul basofilik daripada perubahan degeneratif adalah penting untuk menilai ketoksikan berkaitan ASO.

Vakuol, yang sering diperhatikan dalam tubul proksimal buah pinggang monyet cynomolgus yang dirawat dengan ASO, mengandungi bahan basofilik dan mempamerkan pengedaran umum yang sama dalam sel sebagai granul basofilik11, 12. Beberapa laporan telah mencadangkan bahawa proses penetapan boleh mempengaruhi penampilan pengumpulan ASO dalam petak phagolysosomal5, 11. Selain itu, Henry et al. dan Engelhardt menyifatkan bahawa vakuol dalam tubul proksimal berkemungkinan merupakan fenomena sekunder yang terhasil daripada pengekstrakan ASO semasa pemprosesan kerana vakuol tidak terdapat dalam buah pinggang tetap perfusi paraformaldehid/glutaralde hid5, 11. Vakuol dalam tubul proksimal monyet cynomoledgus yang dirawat. dengan mipomersen telah spekulasi muncul semasa proses penetapan13.

Oleh itu, walaupun vakuolasi akibat rawatan ASO mungkin merupakan artifak dalam beberapa kes, hipotesis ini belum terbukti dengan jelas, dan tiada laporan telah mengenal pasti kaedah penetapan yang sesuai untuk penilaian toksikologi. Sehubungan itu, dalam kajian ini, kami membandingkan morfologi buah pinggang selepas penetapan dengan fiksatif Karnovsky atau 4% paraformaldehyde phosphate buffer (PFA) dengan 10% neutral-buffered formaldehyde solution (NBF). Selain itu, kami menunjukkan kegunaan fiksatif Karnovsky sebagai penetap alternatif untuk menghalang vakuolasi yang diperolehi artifak.

Tikus Sprague-Dawley betina berusia empat minggu telah dibeli dari Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Jepun) dan disesuaikan dengan keadaan makmal. Haiwan itu dipelihara di bawah keadaan terkawal (12-kitaran cahaya/gelap jam, suhu 23 ± 2 darjah, kelembapan relatif 50 ± 25%) dan dibenarkan akses percuma kepada diet komersial standard (CR-LPF autoklaf; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Jepun) dan air paip. Dua puluh haiwan telah diperuntukkan kepada empat kumpulan berikut (dengan lima ekor setiap satu): kumpulan 1-minggu yang dirawat dengan garam (Kawalan- 1W), 2-kumpulan yang dirawat dengan garam minggu (Kawalan{ {14}}W), 1-asid nukleik terkunci minggu yang mengandungi kumpulan dirawat antisense oligonucleotide (LNA-ASO) (ASO-1W) dan 2-kumpulan dirawat LNA ASO minggu (ASO-2W). Haiwan itu berumur 5 minggu pada masa permulaan pentadbiran 50 mg/kg LNA-ASO. LNA-ASO ditadbir secara intravena sebanyak empat kali mengikut rejimen berikut: hari 1, 4, 8 dan 11 dalam kumpulan ASO-2W; dan hari 1, 2, 3 dan 4 dalam kumpulan ASO-1W. Haiwan dalam kumpulan-1W dan ASO-1W telah dikorbankan pada hari ke-7. Haiwan dalam kumpulan-2W dan ASO-2W telah dikorbankan pada hari 14. Pada setiap nekropsi terminal, sampel darah untuk patologi klinikal dikumpul dari vena kava perut di bawah bius dalam dengan isoflurane. Selepas pensampelan darah, semua tikus dimatikan secara exsanguination dengan segera memotong aorta abdomen. Permukaan badan luar, rongga toraks dan perut, dan viscera diperiksa secara makroskopik, dan buah pinggang kiri dikeluarkan dan diproses untuk pemeriksaan mikroskopik. Semua prosedur telah dilakukan mengikut Peraturan Pemberian Makanan dan Penyimpanan Haiwan Eksperimen dan Eksperimen Haiwan Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Sampel serum diperoleh melalui sentrifugasi sampel darah pada 4 darjah . Analisis biokimia serum dilakukan menggunakan instrumen TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Jepun) untuk menilai paras nitrogen urea darah (BUN) dan kreatinin (CRE)

Buah pinggang telah dibetulkan menggunakan tiga penyelesaian fiksatif seperti berikut: Selepas membahagikan buah pinggang secara melintang kepada tiga segmen, bahagian tengah termasuk pelvis buah pinggang, telah ditetapkan dalam 10% NBF selama 5 hari; bahagian tengkorak telah ditetapkan dalam fiksatif Karnovsky (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Jepun); dan bahagian ekor telah ditetapkan dalam 4% PFA selama 17 jam pada 4 darjah dan kemudian diletakkan dalam 10% NBF selama 24 jam. Setiap sampel tetap telah dehidrasi dan tertanam dalam parafin. Bahagian tisu telah disediakan untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E). Pewarnaan imunohistokimia dilakukan menggunakan antibodi yang menyasarkan molekul kecederaan buah pinggang-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, Amerika Syarikat; pencairan 1:300) dan protein membran 2 berkaitan lisosom (LAMP{{ 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA; 1:1000 pencairan) selepas pengambilan antigen (penampan sitrat, pH 6.0, dipanaskan selama 10 minit atau dipanaskan di bawah tekanan selama 20 minit). Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Jepun) telah digunakan sebagai antibodi sekunder.

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop