Fixative Karnovsky Mencegah Artifak Muncul Sebagai Vakuolasi Terhasil Daripada Pemprosesan Tisu dalam Buah Pinggang yang Dirawat Dengan Antisense Oligonucleotide Ⅱ

Secara makroskopik, tiada perubahan abnormal diperhatikan. Selain itu, dalam kimia darah, parameter buah pinggang (iaitu, BUN dan CRE) tidak menunjukkan perubahan ketara dalam mana-mana kumpulan (Jadual 1).

Suplemen Cistanche Suplemen Sokongan Fungsi Ginjal PhGs75% Ech 30% Bertindak 12%

Ringkasan penemuan histopatologi dalam buah pinggang tetap dengan 10% NBF ditunjukkan dalam Jadual 2. Secara mikroskopik, granul basofilik dan vakuol dalam tubul proksimal, terutamanya dalam segmen S1 dan S2, diperhatikan dalam kedua-dua ASO-1W dan kumpulan ASO-2W untuk buah pinggang tetap dengan 10% NBF (Rajah 1A). Perubahan ini lebih teruk dalam kumpulan ASO-2W berbanding kumpulan ASO-1W. Pengumpulan granul basofilik kebanyakannya diperhatikan pada sempadan berus tubul proksimal sebagai agregat dan/atau struktur punctate. Oleh kerana butiran basofilik dilaporkan terdapat dalam kedua-dua endosom atau lisosom dan bebas dalam sitoplasma epitelium tiub proksimal14, bentuk yang berbeza ini mungkin mencerminkan kawasan terkumpulnya; iaitu, agregat dan struktur tanda baca boleh terkumpul dalam lisosom dan sitoplasma, masing-masing. Vakuol dalam tubul proksimal berbentuk bulat dan kasar, dan kebanyakannya bercantum dengan vakuol bersebelahan. Selain itu, beberapa vakuol mengandungi butiran basofilik yang lemah (Rajah 1E), menunjukkan bahawa vakuol adalah berkaitan dengan pengumpulan ASO. Secara imunohistokimia, LAMP{12}} adalah positif pada permukaan membran vakuol (Rajah 1G dan 1H). Keputusan menunjukkan bahawa vakuolasi adalah dilatasi lisosom. Perbezaan dalam keterukan vakuolasi antara kumpulan ASO-1W dan ASO-2W mungkin menunjukkan perbezaan dalam bilangan ASO yang terkumpul dalam lisosom. Kami membuat spekulasi bahawa jumlah ASO terkumpul dalam lisosom meningkat dengan peningkatan masa pendedahan kepada ASO. Akibatnya, pengembangan lisosom muncul sebagai vakuolasi kerana pemprosesan tisu.

Jadual 1. Data Kimia Darah

Jadual 2. Penemuan Histopatologi dalam Buah Pinggang Tetap dengan 10% N

Walaupun vakuolasi sederhana diperhatikan, degenerasi tubular proksimal tidak nyata dan majoriti epithelia yang dikosongkan adalah negatif untuk KIM-1 dalam pewarnaan imunohistokimia (Rajah 1D). Sebaliknya, bagi sampel yang ditetapkan dalam fiksatif Karnovsky, vakuol dalam tubul proksimal tidak terdapat pada semua individu, manakala butiran basofilik sering diperhatikan (Rajah 1B). Butiran basofilik adalah lebih menonjol berbanding dalam sampel yang tertakluk kepada penetapan NBF 10% kerana struktur sel telah dipelihara dengan baik (Rajah 1F). Dalam sampel yang tertakluk kepada penetapan PFA 4%, vakuol dan granul basofilik diperhatikan; bagaimanapun, keterukan vakuolasi adalah lebih rendah sedikit daripada sampel yang tertakluk kepada penetapan NBF 10% (Rajah 1C).

Oligonukleotida adalah molekul yang sangat larut dalam air dan diekstrak daripada tisu semasa pemprosesan kerana kegagalan untuk memaut silang sepenuhnya komponen selular.

Berdasarkan keputusan ini, kami menyimpulkan bahawa vakuol dalam tubul proksimal dipengaruhi oleh kaedah penetapan dan perubahan morfologi yang diperhatikan dalam tisu yang tertakluk kepada penetapan 10% NBF dan 4% PFA mungkin merupakan artifak di kawasan pengumpulan ASO semasa pemprosesan tisu. Dalam erti kata lain, vakuolasi mungkin tidak ketara secara toksikologi kerana tiada degenerasi tiub, peningkatan ekspresi KIM-1 atau perubahan abnormal dalam parameter buah pinggang diperhatikan. Oleh itu, kami mencadangkan menggunakan fiksatif Karnovsky sebagai kaedah penetapan pilihan untuk pemeriksaan patologi tepat buah pinggang dalam haiwan yang dirawat ASO.

Kesimpulannya, penemuan semasa kami mendedahkan kemungkinan anggaran berlebihan vakuolasi apabila menggunakan kaedah penetapan NBF konvensional. Fiksatif Karnovsky mungkin merupakan alat yang berguna untuk membezakan vakuol tiruan daripada nefrotoksisiti sebenar.

Rajah 1. Fotomikrograf perwakilan buah pinggang yang dirawat dengan antisense oligonucleotide (ASO). Perubahan histopatologi dalam 2-minggu asid nukleik terkunci yang mengandungi kumpulan rawatan antisense oligonucleotide (LNA-ASO) (ASO-2W) untuk buah pinggang yang ditetapkan dengan (A) 10% larutan neutralbuffered formaldehyde (NBF), ( B) Fiksatif Karnovsky, atau (C) 4% paraformaldehyde phosphate buffer (PFA). (D) Pewarnaan imunohistokimia untuk molekul kecederaan buah pinggang-1 (KIM-1) ​​ASO-2W untuk buah pinggang tetap dengan 10% NBF.Perubahan histopatologi dalam kumpulan 1-minggu yang dirawat LNA-ASO (ASO-1W) untuk buah pinggang yang diperbaiki dengan (E) 10% NBF dan (F) fiksatif Karnovsky. Pewarnaan imunohistokimia untuk protein membran berkaitan lisosom 2 (LAMP-2) daripada (G) ASO-1W dan (H) ASO-2W untuk buah pinggang tetap dengan 10% NBF. (A) Butiran basofilik (anak panah hitam) dan vakuol (anak panah hitam) diperhatikan dalam tubul proksimal. Pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E). Bar{11}} μm. (B) Vakuol tidak diperhatikan, tetapi granul basofilik (anak panah hitam) diperhatikan. pewarnaan H&E. Bar{12}} μm. (C) Butiran basofilik (anak panah hitam) dan vakuol (anak panah hitam) diperhatikan. Walau bagaimanapun, keterukan vakuolasi adalah lebih rendah daripada sampel yang tertakluk kepada penetapan NBF 10%. pewarnaan H&E. Bar{14}} μm. (D) Majoriti tubul proksimal yang dikosongkan adalah negatif untuk KIM-1. Bar{16}} μm. (E, F) Beberapa vakuol yang diperhatikan dalam tubul proksimal mengandungi butiran basofilik dengan samar-samar (anak panah hijau). Butiran basofilik diperhatikan dengan jelas, dan struktur sel dipelihara (anak panah hijau). pewarnaan H&E. Bar{17}} μm. (G, H) Permukaan membran vakuol adalah positif untuk LAMP-2 (anak panah biru). Bar{19}} mm.

Pendedahan Potensi Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai konflik kepentingan.

Penghargaan: Penulis berterima kasih kepada Keisuke Yoshikawa dan Tetsuya Ohta atas nasihat baik mereka.

Rujukan

1. Rinaldi C, dan Wood MJA. Oligonukleotida antisense: sempadan seterusnya untuk rawatan gangguan neurologi. Nat Rev Neurol. 14: 9–21. 2018. [Medline] [CrossRef]

2. Uemura Y, dan Kobayashi K. Menyasarkan makrofaj alveolar murine oleh pentadbiran intratrakeal asid nukleik terkunci yang mengandungi oligonukleotida antisense. Dadah Deliv. 26: 803–811. 2019. [Medline] [CrossRef]

3. Bennett CF. Oligonukleotida antisense terapeutik semakin meningkat usia. Annu Rev Med. 70: 307–321. 2019. [Medline] [CrossRef]

4. Frazier KS. Terapi oligonukleotida antisense: janji dan cabaran dari perspektif ahli patologi toksikologi. Toxicol Pathol. 43: 78–89. 2015. [Medline] [CrossRef]

5. Engelhardt JA. Toksiopatologi buah pinggang perbandingan oligonukleotida antisense. Asid Nukleik Ada. 26: 199–209. 2016. [Medline] [CrossRef]

6. Frazier KS, Sobry C, Derr V, Adams MJ, Besten CD, De Kimpe S, Francis I, Gales TL, Haworth R, Maguire SR, Mirabile RC, Mullins D, Palate B, Doorten YPS, Ridings JE, Scicchitano MS , Silvano J, dan Woodfine J. Tindak balas keradangan khusus spesies sebagai komponen utama untuk pembangunan lesi glomerular pada tikus dan monyet berikutan pentadbiran kronik oligonukleotida antisense generasi kedua. Toxicol Pathol. 42: 923–935. 2014. [Medline] [CrossRef]

7. Jahit S, Gubler M, Gérard R, Avignon B, Mueller Y, Braendli-Baiocco A, Odin M, dan Moisan A. Konjugasi GalNAc melemahkan sitotoksisiti ubat oligonukleotida antisense dalam sel tubular renal. Asid Nukleik Mol Ther. 14: 67–79. 2019. [Medline] [CrossRef]

8. Kakiuchi-Kiyota S, Koza-Taylor PH, Mantena SR, Nelms LF, Enayetallah AE, Hollingshead BD, Burdick AD, Reed LA, Warneke JA, Whiteley LO, Ryan AM dan Mathialagan N. Perbandingan profil transkripsi hepatik terkunci oligonukleotida antisense asid ribonukleik: bukti laluan berbeza yang menyumbang kepada ketoksikan pengantara bukan sasaran pada tikus. Sains Toksik. 138: 234–248. 2014. [Medline] [CrossRef]

9. Hagedorn PH, Yakimov V, Ottosen S, Kammler S, Nielsen NF, Høg AM, Hedtjärn M, Meldgaard M, Møller MR, Ørum H, Koch T, dan Lindow M. Potensi hepatotoksik oligonukleotida terapeutik boleh diramalkan daripada urutannya dan corak pengubahsuaian. Asid Nukleik Ada. 23: 302–310. 2013. [Medline] [CrossRef]