Pengasingan Ekstrak Daripada Mikroorganisma Simbiotik Karang Lembut Salinispora Arenicola Mengenakan Kesan Sitoprotektif Dan Anti-Penuaan Bahagian 1

Abstrak: Sel telah membangunkan sistem yang sangat bersepadu yang bertanggungjawab untuk kestabilan proteom, iaitu rangkaian proteostasis (PN). Oleh kerana kehilangan proteostasis adalah ciri penuaan dan penyakit berkaitan usia, pengaktifan modul PN berkemungkinan boleh memanjangkan tempoh kesihatan. Di sini, kami membentangkan data tentang bioaktiviti ekstrak (SA223-S2BM) yang disucikan daripada strain Salinispora arenicola TM223-S2 yang diasingkan daripada karang lembut Scleronephthya lewinsohni; karang ini dikumpulkan pada kedalaman 65 m dari ekosistem Laut Merah mesofotik EAPC (Eilat selatan, Israel). Rawatan sel manusia dengan modul proteostatik SA223-S2BM yang diaktifkan mengurangkan beban oksidatif dan memberikan perlindungan terhadap tekanan oksidatif dan genotoksik. Tambahan pula, SA223-S2BM meningkatkan aktiviti proteasome dan lisosom-cathepsin dalam lalat Drosophila dan mempamerkan kesan perlindungan kulit seperti yang dibuktikan oleh perencatan berkesan terhadap enzim, elastase dan tyrosinase yang berkaitan dengan penuaan kulit. Kami mencadangkan bahawa ekstrak SA223-S2BM merupakan sumber yang mungkin menjanjikan untuk mengutamakan molekul dengan sifat anti-penuaan.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan mempunyai keupayaan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik pada cistanches herba

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Kata kunci: penuaan; tindak balas antioksidan; mikroorganisma marin; rangkaian proteostasis; Salinispora arenicola

1. Pengenalan

Penuaan dicirikan oleh penurunan yang bergantung pada masa dalam kapasiti fungsi dan rintangan tekanan, serta peningkatan kadar kematian dan morbiditi [1]. Penuaan bukan sekadar proses pasif, kerana ia dikawal oleh peristiwa isyarat molekul dan selular yang dipelihara evolusi [2,3]. Organisma sentiasa dicabar oleh kedua-dua tekanan dalaman (berkaitan metabolik) dan luaran (diet atau alam sekitar), yang boleh membawa kepada pengumpulan beransur-ansur biomolekul yang rosak dan akhirnya menjejaskan homeostasis selular [4,5]. Protein terlibat dalam semua fungsi selular yang penting dan oleh itu, homeostasis proteom (proteostasis) adalah penting untuk kefungsian selular dan kelangsungan hidup [6].

Integriti protein dikekalkan oleh rangkaian proteostasis (PN), yang meluas ke semua petak subselular dan dikawal pada tahap selular, tisu, dan organisma untuk memastikan kesihatan organisma dan umur panjang [7]. Mengekalkan proteostasis memerlukan sel untuk menyelaras dan mengawal selia fungsi sintesis, lipatan, pengasingan, pengangkutan, dan degradasi semua polipeptida [8,9]. Fungsi selular ini kebanyakannya dijalankan oleh tiga cabang utama PN yang saling berkaitan, iaitu rangkaian pendamping molekul, laluan proteolitik ubiquitin-proteasome-(UPP), dan autophagy-lysosome-(ALP) [10,11].

Pendamping molekul memastikan lipatan protein yang betul dan penyelenggaraan konformasi, dan mereka juga bekerjasama dengan laluan degradasi [12]. UPP ialah tapak utama kawalan kualiti sintesis protein dan terlibat dalam kitar semula protein jangka pendek biasa dan protein tersalah lipat atau tidak boleh diperbaiki yang tidak boleh diperbaiki [6], manakala ALP bertanggungjawab untuk pengiktirafan dan penyingkiran agregat protein dan organel yang rosak. [13]. Kehilangan proteostasis adalah ciri penuaan [14], serta faktor risiko utama untuk banyak patologi manusia yang berkaitan dengan usia, termasuk kanser, diabetes, gangguan kardiovaskular, dan penyakit neurodegeneratif [15]. Oleh itu, pengaktifan PN dianggap sebagai pendekatan yang menjanjikan untuk melambatkan permulaan dan/atau perkembangan penuaan dan penyakit berkaitan usia [16-18].

Penuaan kulit dicirikan oleh perubahan struktur dan fungsi dalam (antara lain) komponen matriks ekstraselular, seperti elastin [19]. Elastase adalah enzim yang terlibat dalam degradasi elastin, mengakibatkan perkembangan kedutan dan kehilangan keanjalan [20]. Tyrosinase adalah enzim utama dalam sintesis melanin, yang bertanggungjawab untuk pigmentasi (antara lain) kulit manusia [21,22]. Walau bagaimanapun, pengaktifan tyrosinase yang berlebihan dikaitkan dengan beberapa gangguan kulit, seperti hiperpigmentasi dan melanoma [22,23]. Oleh itu, perencatan elastase dan tyrosinase merupakan pendekatan yang menonjol terhadap penuaan kulit.

Produk semula jadi (NPs) mempunyai sejarah yang panjang-didokumentasikan dengan baik, sebelum kelahiran sains dan teknologi moden, dalam pelbagai budaya-mengubati penyakit manusia [24-26]. Oleh itu, NP boleh berfungsi sebagai bahan permulaan dan perancah yang sangat diperkaya untuk pembangunan dadah; sesungguhnya, lebih separuh daripada semua ubat adalah sama ada NPs, NPs-derived, atau NPs-inspired [27-29]. Dunia marin, yang mempunyai paling banyak biodiversiti, sebahagian besarnya belum diterokai dan oleh itu mungkin merupakan sumber terluas untuk menemui NP baru [30]. Di antara organisma yang hidup dalam persekitaran marin, karang lembut merupakan penyedia NP bioaktif yang menjanjikan dan diketahui menjadi tuan rumah kepada banyak mikroorganisma yang pelbagai [31,32].

Memandangkan fakta ini, kami sedang melakukan pemeriksaan NP yang meluas untuk mengenal pasti molekul bioaktif yang berpotensi melambatkan penuaan selular dan/atau penuaan dalam vivo. Dalam kajian yang dibentangkan di sini, kami meneliti ekstrak metanol, iaitu SA223-S2BM, strain Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 dengan menggunakan ujian in vitro, serta berasaskan sel dan pendekatan berpandukan bio in vivo. Strain S. arenicola TM223-S2 diasingkan daripada karang lembut Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (pada mulanya dinamakan sebagai Scleronephthya lewinsohni oleh Verseveldt dan Benayahu, 1978), yang diperoleh secara mampan daripada mesofotik Laut Merah (Ekosistem EAPC). selatan Eilat, Israel) pada kedalaman 65 m. Ekstrak metanol SA223-S2BM mengaktifkan mekanisme sitoprotektif dalam kedua-dua sel manusia dan Drosophila melanogaster (D. melanogaster) terbang dan menggunakan sifat perlindungan kulit secara in vitro. Oleh itu, ekstrak SA223-S2BM boleh menjadi sumber bagi kemungkinan pengenalpastian molekul yang berpotensi mempunyai sifat sitoprotektif dan anti-penuaan.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. SA223-Asal Asal dan Pengasingan Ekstrak S2BM

2.1.1. Koleksi Karang

Karang lembut S. Levinson telah dikumpul oleh ROV H800 (ECA Robotics) yang dikendalikan oleh Sam Rothberg R/V dari Interuniversity Institute for Marine Sciences di Eilat (IUI). Di situ, fotografi dijalankan oleh kamera hitam dan putih cahaya rendah VS300 (ECA Robotics) dan kamera 1CAM Alpha HD (Pengimejan SubC). Sampel diperolehi oleh lengan ROV dari terumbu mesofotik Eilat, di luar terminal jeti minyak (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), pada 65 m, pada 7 Mac 2017. Tapak pengumpulan dicirikan oleh cerun sederhana dengan tompok berbatu yang dikelilingi oleh dasar laut berpasir. Selepas pengumpulan, bahan itu segera dibekukan pada −80 ◦C. Satu spesimen baucar telah dipelihara dalam 70 peratus etanol untuk pengecaman taksonomi dan disimpan di Muzium Sejarah Semula Jadi Steinhardt, Universiti Tel Aviv (SMNHTAU_Co_37500).

2.1.2. Pengasingan dan Pengenalpastian Terikan

S. arenicola TM223-S2 telah diasingkan daripada sampel 1 mL S. Levinson. Sampel karang lembut yang dikumpul dikisar dalam air laut steril dan dipanaskan pada suhu 50 ◦C selama 1 jam. Suspensi yang terhasil dicairkan secara bersiri, disalut pada medium agar pengasingan terpilih, dan diinkubasi pada suhu 28 ◦C selama sekurang-kurangnya 6 minggu. Strain Salinispora telah diasingkan, dan koloni telah disucikan pada agar sup marin (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) dan dipelihara pada -20 ◦C dalam larutan gliserol 10 peratus.

2.1.3. Penyiasatan Filogeni

Analisis filogenik dilakukan menggunakan serpihan gen 16S rRNA yang dikuatkan daripada DNA genom S. arenicola TM223-S2. DNA genom bagi strain TM223-S2 telah diasingkan menggunakan Kit Darah dan Tisu (Qiagen) DNeasy, mengikut arahan pengilang. Serpihan RNA ribosom 16S telah dikuatkan oleh PCR menggunakan primer 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56.3 ◦C), dan 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57.5 ◦C). Amplicons telah disusun oleh penjujukan Sanger dan urutan itu diselaraskan dengan pangkalan data RNA ribosom 16S projek Loci Sasaran NCBI menggunakan MUSCLE. Penjajaran telah diperiksa secara manual, dan jurang telah dialih keluar. Sejarah evolusi telah disimpulkan dengan menggunakan kaedah kemungkinan maksimum dan model Tamura-Nei [33] dengan 1000 ulangan. Pohon awal untuk carian heuristik diperoleh secara automatik dengan menggunakan algoritma jiran-cantum dan BioNJ pada matriks jarak berpasangan yang dianggarkan menggunakan pendekatan kemungkinan komposit maksimum (MCL) dan kemudian memilih topologi dengan nilai kemungkinan log yang unggul. Analisis evolusi telah dijalankan dalam MEGA X versi 10.1.7 [34].

2.1.4. Syarat Penanaman

S. arenicola TM223-Spora S2 dipelihara pada −20 ◦C dalam 10 peratus gliserol. Sebelum penanaman, terikan dihidupkan semula selama 15 hari pada plat Petri 15 cm yang mengandungi MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ditambah dengan 2 peratus Agar (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , USA). Air laut steril (4 × 10 mL) dituangkan ke atas permukaan plat, dan spora dan miselium diperoleh semula daripada plat dengan mencakar lembut permukaan dengan pisau bedah untuk menghasilkan inokulum. Penapaian keadaan cecair (LSF) telah dijalankan dalam kelalang Erlenmeyer 2 L selama 20 hari pada 28 ◦C dan pengadukan 130 rpm. Resin Amberlite XAD16 (30 g/L) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Belanda) telah ditambah sebelum pensterilan untuk membolehkan perangkap in situ metabolit mikrob. Lima mililiter inokulum telah digunakan untuk menyuntik 1 L pada MB yang mengandungi 30 g resin Amberlite XAD16. Penapaian keadaan agar ditambah dengan pengekstrakan fasa pepejal (SPE) [35] dilakukan pada medium MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ditambah dengan 2 peratus Agar (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) selama 20 hari pada 28 ◦C. Amberlite XAD16 yang telah disterilkan (35 g) dicampur dengan 35 mL inokulum disebarkan secara homogen pada permukaan plat Petri 1 MB agar (25 cm × 25 cm).

Untuk LSF, resin XAD16 diasingkan daripada kultur sup melalui penapisan dan dibasuh dengan air sebelum dicairkan dengan etil asetat (100 mL) dan kemudian dengan metanol (100 mL). eluat telah tertumpu kepada kekeringan dalam vakuo dan terlarut dalam DMSO pada kepekatan 10 mg/mL. Ekstrak yang terhasil, SA223-S2LAE (diekstrak menggunakan etil asetat), telah digunakan untuk penilaian biologi.

Untuk SPE, resin XAD16 telah dipulihkan dengan mencakar permukaan plat agar-agar dengan berhati-hati. Resin yang diperolehi telah dibasuh dengan air untuk menghilangkan biojisim sebelum dicairkan dengan etil asetat (100 mL) dan kemudian dengan metanol (100 mL). eluat telah tertumpu kepada kekeringan dalam vakuo dan terlarut dalam DMSO pada kepekatan 10 mg/mL. Ekstrak yang terhasil, SA223-S2BAE (diekstrak menggunakan etil asetat) dan SA223-S2BM (diekstrak menggunakan metanol), telah digunakan untuk penilaian biologi.

2.2. Aktiviti Perencatan Elastase dan Tirosinase

Aktiviti perencatan elastase ekstrak yang diutamakan dinilai menggunakan elastase daripada pankreas babi (PPE) jenis IV (Merck KGaA, Darmstadt, Jerman) dan substrat N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Merck KGaA, Darmstadt, Jerman), seperti yang diterangkan sebelum ini [36]. Kapasiti ekstrak untuk menghalang tindakan pemangkin tyrosinase dalam pengoksidaan L-DOPA kepada dopachrome telah ditentukan, seperti yang dilaporkan sebelum ini [37].

2.3. Talian Sel, Keadaan Kultur Sel dan Ujian Daya Tahan Sel

Fibroblas kulup manusia (sel BJ) dibeli daripada American Tissue Culture Collection (ATCC), manakala keratinosit manusia yang diabadikan (sel HaCaT) diperoleh daripada Elabscience, Inc. Kedua-dua talian sel telah dikultur dalam Medium Helang Modified Dulbecco (DMEM) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) ditambah dengan 10 peratus (v/v) fetal bovine serum (FBS) dan 1 peratus (v/v) asid amino bukan penting dan dikekalkan dalam keadaan 5 peratus CO2, 95 peratus kelembapan dan 37 ◦C. Dalam semua prosedur eksperimen yang digunakan, sel telah disubkultur dengan menggunakan penyelesaian trypsin/EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Kesan ekstrak SA223-S2BM pada daya maju sel dianggarkan menggunakan ujian MTT, seperti yang dilaporkan sebelum ini [38]. Rawatan sel dengan hidrogen peroksida (H2O2) dan doxorubicin (DXR) telah dilakukan seperti yang diterangkan dalam legenda angka; H2O2 dan DXR diperoleh daripada Merck KGaA (Darmstadt, Jerman).

2.4. Garisan Drosophila dan Ujian Panjang Umur

Dalam kajian ini, kami menggunakan strain Drosophila w1118 yang dibeli daripada Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, USA). Lalat dikekalkan pada 25 ◦C dan kelembapan 60 peratus pada cahaya 12 jam: 12 jam kitaran gelap. Dalam semua eksperimen yang dibentangkan, hanya tisu somatik (kepala dan toraks) lalat dianalisis, kerana tisu pembiakan memaparkan peraturan mekanisme proteostatik dan kadar penuaan yang berbeza berbanding dengan tisu somatik [39].

Jangka hayat lalat telah diuji seperti yang diterangkan sebelum [40] dengan menggunakan lalat betina dan jantan (bilangan yang sama setiap jantina) yang dibiakkan dalam botol yang mengandungi (atau tidak) ekstrak yang dikaji. Lalat dipindahkan ke botol dengan makanan segar setiap dua hari dan kematian dicatat setiap hari. Untuk lengkung kelangsungan hidup dan analisis statistik, prosedur Kaplan-Meier dan ujian log-rank (Mantel-Cox) digunakan; signifikan telah diterima pada p <0.05.

2.5. Pengukuran Spesies Oksigen Reaktif (ROS)

Sel atau tisu lalat diinkubasi dengan pewarna CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) pada kepekatan 10 µM dalam PBS selama 30 minit dalam keadaan gelap (37 ◦C dan 25 ◦C, masing-masing). Selepas penyingkiran pewarna, sel atau tisu lalat diinkubasi dengan PBS selama 15 minit dalam gelap (masing-masing 37 ◦C dan 25 ◦C), dilisekan dalam penimbal lisis [150 mM NaCl, 1 peratus (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8.0] dan, kemudian disentrifugasi pada 14,000 g selama 15 min (4 ◦C). Selepas itu, kandungan protein diukur dengan ujian Bradford (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), dan pendarfluor yang dihasilkan diukur dalam pembaca plat mikro multimod Spark® (Tecan Trading AG, Männedorf, Switzerland) pada pengujaan dan panjang gelombang pelepasan 490 dan 540 nm, masing-masing. Hidrogen peroksida (H2O2) digunakan sebagai kawalan positif, kerana ia diketahui secara meluas menyebabkan kerosakan/tekanan oksidatif [41].

2.6. Pengekstrakan RNA, Sintesis cDNA, dan Analisis PCR Masa Nyata Kuantitatif (Q-RT-PCR)

Jumlah RNA diekstrak daripada sel menggunakan RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Jepun) dan dikira dengan spektrofotometer BioSpec-nano (Shimadzu Inc., Kyoto, Jepun). Selepas itu, 1 µg RNA telah ditukar kepada cDNA menggunakan Kit cDNA FastGene Scriptase II (NIPPON Genetics, Düren, Jerman). Untuk menjalankan analisis PCR Masa Nyata Kuantitatif, 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estonia) dan Sistem PCR Masa Nyata PikoRealTM (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) telah digunakan. Primer khusus untuk gen manusia yang dikaji adalah seperti yang diterangkan sebelum [42]. Gen HMBS digunakan sebagai normalizer.

2.7. Analisis dan Pengukuran Immunoblotting Aktiviti Proteasome dan Cathepsin

Kajian imunoblotting telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini [43]. Antibodi sekunder konjugasi peroksidase primer dan lobak digunakan selama 1 jam pada suhu bilik dan imunoblot dibangunkan menggunakan kit reagen chemiluminescence yang dipertingkatkan (ClarityTM Western ECL Substrat, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Kuantiti immunoblots dilakukan dengan mengimbas densitometri dan perisian ImageJ [44].

Aktiviti enzimatik proteasome dan cathepsin dalam sel atau tisu lalat diukur pada Sistem Fluorometer VersaFluor™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) menggunakan Suc-LLVY-AMC (aktiviti seperti chymotrypsin, CT-L) dan fluoropeptida Z-FR-AMC (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA), masing-masing, seperti yang diterangkan sebelum ini [42,45,46]. 6-bromoindirubin-30 -oxime (6BIO) telah digunakan sebagai kawalan positif, kerana ia diketahui mengaktifkan UPP kedua-dua dalam sel manusia dan lalat Drosophila [42,47]; dadah Rapamycin, digunakan sebagai kawalan positif untuk induksi ALP dan cathepsin [48].

2.8. Antibodi Digunakan

Antibodi utama terhadap 5 (sc-55009) subunit proteasom, NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) dan GAPDH (sc{12}}), serta antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak pedas, telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Antibodi utama terhadap 53BP1 (4937), phospho-Histone H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) dan fosfor-p53Ser15 (9286) diperoleh daripada Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Antibodi terhadap SQSTM1/p62 (BML-PW9860) telah dibeli daripada Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA).

2.9. Analisis Statistik

Percubaan telah dilakukan sekurang-kurangnya dalam pendua. MS Excel digunakan untuk analisis statistik. Kepentingan statistik dinilai menggunakan ujian-t Pelajar (ujian-t). Titik data sepadan dengan min eksperimen bebas dan bar ralat menandakan sisihan piawai (SD); kepentingan pada p < 0.05 atau p < 0.01 ditunjukkan dalam graf dengan satu atau dua asterisk, masing-masing.

3. Keputusan

3.1. Pengenalpastian Actinomycete Berkaitan dengan Soft Coral S. Levinson

Strain mikrob yang disasarkan telah diasingkan daripada karang S. Levinson, yang merupakan endemik karang lembut di Laut Merah. Koloni karang ini biasanya ditemui di tapak dalam, baik di ekosistem terumbu karang mesofotik atas (30–60 m) dan di ekosistem terumbu karang mesofotik bawah (60–105 m) [49]. Lebih-lebih lagi, ia adalah karang lembut azooxanthellate yang memperoleh keperluan tenaganya dengan memberi makan penapis dan, oleh itu, ia ditemui di habitat yang terdedah kepada arus air yang kuat.

Daripada analisis filogenetik berdasarkan jujukan rRNA 16S, TM223-S2 terpencil didapati tergolong dalam genus Salinispora (Rajah 1).

Memandangkan S. arenicola boleh dibezakan daripada S. Pacifica dan S. tropica berdasarkan jujukan rRNA 16S [50], kami menamakan pencilan ini S. arenicola TM223-S2 dengan nombor penyertaan Genbank MW446171. Strain telah ditanam seperti yang dilaporkan dalam Bahagian Bahan dan Kaedah dan masing-masing diekstrak oleh etil asetat dan metanol. Penyiasatan biologi awal menunjukkan bahawa ekstrak daripada kultur cecair, SA223-S2BAE, dan ekstrak etil asetat daripada kultur pepejal, SA223-S2LAE, tidak mempunyai sebarang aktiviti biologi yang ketara (Rajah S1). Oleh itu, hanya ekstrak metanol daripada kultur pepejal yang dikaitkan dengan pengekstrakan fasa pepejal, SA223-S2BM, digunakan dalam kajian ini.

3.2. Ekstrak SA223-S2BM Tidak Menunjukkan Ketoksikan dalam Sel Manusia dan Mengaktifkan Komponen Utama PN

Pertama sekali, kami mengkaji kesan SA223-S2BM pada daya maju fibroblas BJ kulit normal dan keratinosit HaCaT yang diabadikan manusia dengan melakukan ujian ketoksikan MTT. Untuk tujuan ini, sel diinkubasi selama 24 jam dengan peningkatan kepekatan ekstrak dan, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A1, A2, ekstrak tidak memberikan kesan sitotoksik pada salah satu daripada dua garisan sel yang diperiksa pada kepekatan sehingga 10 µg/mL ; pada kepekatan yang lebih tinggi (melebihi 10 µg/mL), ekstrak mengurangkan daya maju sel kebanyakannya dalam sel HaCaT.

Kami kemudian mengkaji kesan ekstrak pada laluan selular, yang memastikan kestabilan proteom sel. Kami mendapati bahawa pendedahan jangka pendek (24 jam) fibroblas BJ kepada ekstrak yang dikaji dengan ketara mendorong ekspresi gen proteasom PSMB7 (pada kepekatan 10 µg/mL), manakala secara selari, ia cenderung untuk meningkatkan ekspresi gen Gen PSMB6 pada kepekatan yang sama (Rajah 2B1). Di samping itu, ekstrak tersebut mendorong ekspresi gen proteasom 20S, PSMB6, dan gen proteasom 19S, RPN11 pada kepekatan 1 µg/mL dalam sel HaCaT (Rajah 2B2). Tambahan pula, rawatan fibroblas BJ dengan ekstrak selama 24 jam membawa kepada induksi ringan tahap ekspresi subunit proteasome 20S 5 pada kepekatan 1 µg/mL (Rajah 2C). Sebagai menyokong penemuan kami, pendedahan kepada ekstrak dengan ketara meningkatkan aktiviti proteasom seperti chymotrypsin dalam kedua-dua fibroblas BJ dan keratinosit HaCaT selepas pengeraman 24 jam (Rajah 2D1, D2); keputusan berbeza kepekatan ekstrak yang diperiksa di kalangan sel BJ dan HaCaT boleh dikaitkan dengan kesan khusus jenis sel.

Selain itu, analisis ekspresi Q-RT-PCR mendedahkan bahawa rawatan fibroblas BJ dengan ekstrak selama 24 jam menyebabkan tahap ekspresi gen berkaitan ALP, dinamakan CTSB, CTSL, CTSD, dan SQSTM1, pada kepekatan 10 µg/mL ( Rajah 3A1). Selanjutnya, kami mendapati bahawa pendedahan sel HaCaT kepada ekstrak selama 24 jam membawa kepada induksi tahap ekspresi gen yang terlibat dalam fungsi ALP (CTSB, CTSL, CTSD, dan SQSTM1) (Rajah 3A2).

Selaras dengan penemuan ini, kami mencatat regulasi protein berkaitan autophagy BECN1 dan SQSTM1 / p62 selepas pendedahan fibroblas BJ kepada ekstrak pada kepekatan 1 μg / mL (Rajah 3B1); peningkatan tahap ekspresi protein BECN1 dan SQSTM1/p62 juga, diperhatikan dalam keratinosit HaCaT pada kedua-dua kepekatan yang dikaji (Rajah 3B2). Selaras dengan itu, kami mendapati bahawa ekstrak meningkatkan aktiviti enzimatik cathepsin lisosom dalam kedua-dua sel BJ dan HaCaT (Rajah 3C1, C2); sekali lagi, keputusan berbeza kepekatan ekstrak yang diperiksa di kalangan sel BJ dan HaCaT boleh dikaitkan dengan kesan khusus jenis sel.

Tambahan pula, kami mengkaji kesan ekstrak pada tahap ekspresi pendamping molekul utama. Oleh itu, analisis immunoblotting mendedahkan bahawa ekstrak tersebut mendorong tahap ekspresi molekul pendamping CLU (pada kedua-dua kepekatan yang dikaji) dalam sel BJ (Rajah 3D1), serta HSP27 (1 µg/mL) dan HSP70 (pada kedua-dua kepekatan yang dikaji) dalam sel HaCaT (Rajah 3D2).

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】