Suplemen Besi Melambatkan Penuaan Dan Memanjangkan Jangka Hayat Selular Melalui Potensiasi Fungsi Mitokondria

Kata kunci:besi;penuaan kronologi; lanjutan jangka hayat selular; mitokondria; AMPK; Saccharomyces cerevisiae

Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Maklumat Mengenai Cistanche Untuk Anti-Penuaan

1. Pengenalan

Thependuduk yang semakin tuaberkembang secara mendadak di seluruh dunia [1–3]. Penuaanadalah faktor risiko terbesar untuk beberapa penyakit kronik termasuk kanser, kemerosotan saraf, penyakit jantung, diabetes, gangguan kognitif, dan penurunan sistem imun.4–8]. Penurunan secara beransur-ansur dalam fungsi metabolik meningkatkan kerentanan kepada patologi berkaitan usia dalam populasi yang lebih tua yang menjejaskan kesihatan sepanjang hayat. Penyelidikan terkini dalam organisma yang berbeza, daripada yis bersel tunggal kepada sistem model haiwan, telah menunjukkan bahawa mekanisme penuaan dipelihara dan dikawal oleh rangkaian interaksi gen dan protein yang sangat saling berkaitan dan berlebihan secara fungsian bagi metabolisme selular [9–11]. Yis tunasSaccharomyces cerevisiaeialah organisma model yang berkuasa untuk mengkaji biologi penuaan kerana banyak proses selularnya dipelihara dalam manusia. Yis mempunyai jangka hayat yang pendek dan boleh digunakan untuk penapisan pemprosesan tinggi di bawah pelbagai keadaan persekitaran [9–12]. Yis telah digunakan secara meluas untuk mengkaji penuaan replikatif dan kronologi manusia dengan menganalisis jangka hayat replikatif (RLS) dan jangka hayat kronologi (CLS) [13–15]. RLS menganalisis bilangan kali sel ibu membahagi untuk membentuk sel anak, model penuaan manusia replikatif untuk sel mitosis seperti sel stem. CLS ialah tempoh masa sel tidak membahagi berdaya maju dalam fasa pegun, model penuaan manusia kronologi untuk sel selepas mitosis seperti neuron. Usaha berterusan dalam penyelidikan biologi penuaan telah menunjukkan bahawa penangguhan penuaan boleh dilaksanakan dengan memodulasi proses biologi penuaan [11,16]. Pada masa ini, intervensi anti-penuaan yang paling menjanjikan ialah ubat rapamycin dan metformin [11,16]. Rapamycin menghalang sasaran pengawal selia metabolik protein kinase yang sangat terpelihara daripada kompleks rapamycin 1 (TORC1). Metformin meningkatkan aktiviti kinase protein diaktifkan adenosin monofosfat (AMPK). TORC1 menggalakkan proses anabolik selular seperti sintesis protein, nukleotida, dan lipid [17,18]. Sebaliknya, TORC1 menghalang proses katabolik, termasuk fosforilasi oksidatif dan autophagy. Walau bagaimanapun, AMPK mempunyai fungsi metabolik yang bertentangan kerana ia mempotensikan proses katabolik dan menghalang proses anabolik.19]. Di bawah keadaan terhad nutrien, AMPK diaktifkan dan menghalang TORC1. Tindak balas metabolik yang terhasil meningkatkan pengeluaran tenaga selular dengan mendorong proses katabolik yang menyelaras dengan penurunan penggunaan ATP dalam proses anabolik [19–21]. Rapamycin dan metformin sedang dalam ujian klinikal untuk kegunaannya sebagai terapeutik anti-penuaan [16,22]. Besi adalah nutrien penting dan penting untuk hampir semua organisma, termasuk manusia [23–26]. Ia memainkan peranan penting dalam metabolisme selular dan berfungsi sebagai kofaktor untuk beberapa tindak balas enzim. Memandangkan metabolisme selular adalah penentu utama penuaan dan zat besi adalah penting untuk beberapa fungsi metabolik yang pelbagai, kami menyiasat kesan suplemen zat besi terhadap penuaan. Kami mengkaji kesan suplemen besi pada CLS yis. Kami mendapati bahawa suplemen zat besi melambatkan penuaan dan meningkatkan jangka hayat selular. Kami seterusnya mendedahkan bahawa mekanisme anti-penuaan suplemen zat besi adalah melalui peningkatan fungsi mitokondria. Kami mendapati bahawa suplemen zat besi meningkatkan fungsi mitokondria dan menyelamatkan jangka hayat pendek mutan AMPK.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Terikan Yis dan Penghapusan Gen

Yang prototropikSaccharomyces cerevisiaeStrain jenis liar CEN.PK digunakan dalam semua eksperimen untuk mengelakkan kesan auxotrophy asid amino pada pertumbuhan dan kemandirian sel [27,28]. Strain kalah mati gen dijana oleh penggabungan semula homolog pengantara PCR di mana keseluruhan lokus digantikan dengan penanda pemilihan yang diperkuatkan yang mengandungi jujukan mengapit hulu dan hilir gen sasaran [29]. PCR mengesahkan integrasi stabil penanda pemilihan yang diperkuatkan.2.2. Komposisi Sederhana dan Bahan KimiaMedium kaya YPD mengandungi 1 peratus ekstrak yis, 2 peratus pepton, dan 2 peratus glukosa, YPD agar (2.5 peratus Bacto agar), dan medium SD mengandungi 6.7 g/L yis nitrogen bes dengan ammonium sulfat tanpa asid amino (Difco) dan 2 peratus glukosa. FeSO4.7H2O, FeCl3, CaSO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, dan BPS telah dibeli daripada Sigma, dan penyelesaian stok mereka disediakan dalam air. Antimycin A (Sigma, St. Louis, MO, USA), DiOC6(3) (3,30 -Dihexyloxacarbocyanine Iodide) (Invitrogen™, Waltham, MA, USA), dan larutan stok Merah Dalam MitoTracker™ (Invitrogen™) telah disediakan dalam dimetil sulfoksida (Sigma). Kepekatan akhir DMSO tidak melebihi 1 peratus dalam sebarang ujian.

2.3. Keadaan Pertumbuhan Yis

Strain jenis liar dan pemadaman telah diperolehi daripada stok gliserol beku pada YPDmedium agar pada 30◦C. Sel yis ditanam dalam medium SD semalaman pada 30◦C denganbergegar pada 220 rpm. Kultur sel yang ditanam semalaman telah dicairkan kepada OD600nm~0.2 dalam medium SD segar untuk memulakan ujian pertumbuhan dalam 96-plat perigi atau kelalang dengan atau tanpabahan kimia dan diinkubasi pada 30◦C. Pertumbuhan sel (OD600nm) diukur pada berbezatitik masa menggunakan pembaca plat mikro atau spektrofotometer.

2.4. Ujian Penuaan Kronologi

Penuaan kronologi ditentukan dengan mengukur jangka hayat kronologi (CLS) sel yis, seperti yang dilaporkan sebelum ini dengan sedikit pengubahsuaian [30,31]. Percubaan CLS telah dijalankan pada plat telaga {{0}}. Kultur sel semalaman telah dicairkan kepada OD600nm~0.2 dalam medium SD segar dan dipindahkan ke dalam 96-plat perigi yang mengandungi kepekatan bahan kimia yang berbeza dan diinkubasi pada 30◦C. Sel telah ditanam kepada fasa pegun yang dianggap Hari 1 (100 peratus survival sel) untuk analisis CLS. Kemandirian sel yis dikira pada pelbagai titik masa umur dengan ujian pertumbuhan. Sel-sel yang berumur secara kronologi (3µL) pada titik masa umur yang berbeza telah dipindahkan ke 96-plat perigi kedua. Sederhana YPD (200µL) telah ditambahkan pada 96-plat perigi dan diinkubasi selama 24 jam pada 30◦C. Pertumbuhan sel diukur dengan penyerapan (OD600nm) menggunakan pembaca plat mikro. Kemandirian sel untuk titik umur yang berbeza dikira secara relatif kepada Hari 1 (dianggap 100 peratus kemandirian sel) menggunakan formula pengiraan: Peratus kemandirian=[Keluaran OD600nm (titik umur)/Keluaran OD600nm (Hari1)]× 100 2.5. Ujian Rintangan OksidatifSel yis telah ditanam ke peringkat fasa pegun (72 jam) dalam medium SD. Selepas itu, sel telah dibasuh dan dicairkan kepada OD600nm~0.2 dalam medium YPD dengan kepekatan H yang berbeza.2O2 dan berkembang pada 30◦C. Rintangan tegasan oksidatif dianalisis dengan membandingkan pertumbuhan sel sel yang dirawat H2O2-dengan kawalan yang tidak dirawat.

2.6. Pengekstrakan RNA, Sintesis cDNA, dan Kuantitatif

PCR Masa NyataJumlah RNA diekstrak daripada sel menggunakan kit mini RNeasy (Qiagen, Hilden, Ger many) mengikut protokol gangguan mekanikal pengeluar. Kepekatan dan kualiti RNA ditentukan oleh spektrofotometer (NanoDrop 2000 Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Biasanya, 1µg jumlah RNA telah ditranskripsikan secara terbalik ke dalam cDNA menggunakan Kit Transkripsi Terbalik QuantiTect (Qiagen). Semasa sintesis cDNA, dua kawalan negatif termasuk tanpa transkripase terbalik dan templat RNA juga dilakukan. Semua RT-PCR telah dilakukan dalam jilid akhir sebanyak 20µL yang mengandungi 20 ng cDNA menggunakan SYBR Fast Universal qPCR Kit (Kapa Biosystems, Boston, MA, USA) dan dianalisis menggunakan sistem Quant Studio 6 Flex (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Keadaan RT-PCR adalah satu pegangan pada {95◦C, 180 s}, diikuti oleh 40 kitaran {95◦C, 1 s} dan {60◦C, 20 s} langkah. Selepas penguatan, lengkung lebur dilakukan untuk mengesahkan kekhususan PCR dan ketiadaan dimer primer. Kelimpahan kuantitatif setiap gen ditentukan berbanding dengan transkrip pengemasan ACT1. Ekspresi gen relatif antara kawalan dan keadaan yang dirawat dikira menggunakan 2−∆∆Ctkaedah [32]. Senarai primer yang digunakan untuk RT-PCR disediakan dalam Jadual Tambahan S1.

2.7. Analisis Potensi dan Struktur Membran Mitokondria

Kultur yis dibasuh dengan 1× PBS (phosphate buffered saline) dan diinkubasidengan DiOC6(3) (100 nM) selama 30 minit dalam gelap. Selepas pengeraman, sel dibasuh dandigantung semula dalam 1× PBS. Bacaan pendarfluor (pengujaan pada 482 nm, pelepasan pada 504 nm)sampel diukur oleh pembaca plat mikro. Keamatan pendarfluor setiap satusampel telah dinormalkan dengan OD600nm. Untuk analisis struktur mitokondria, sel telahdibasuh dengan 1× PBS dan diinkubasi dengan MitoTracker merah dalam (100 nM) selama 30 minit dalamgelap. Sampel telah divisualisasikan dengan mikroskop pendarfluor FL pada 100× pembesarandan imej telah diproses oleh perisian ImageJ.

2.8. Analisis ATP

150 µL 5 peratus asid trikloroasettik, dan dilisiskan dengan manik kaca pada Precellys® 24 penghomogen(Bertin Technologies, Montiny Le Bretonne, Perancis). Tahap ATP diukur menggunakan kit reagen Enliten luciferin/luciferase (Promega, Madison, WI, USA) dalam luminometer(Biotek, Winusky, VT, Amerika Syarikat). Kepekatan protein dianggarkan dengan reagen Bradford(Bio-rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Tahap ATP dalam sampel telah dinormalkan kepada jumlah proteinpenumpuan.

2.9. Analisis statistik

3. Keputusan

3.1. Suplemen Besi Memanjangkan Jangka Hayat Selular Yis

Kami menyiasat kesan Besi(II) sulfat (FeSO4) suplemen pada jangka hayat kronologi (CLS) yis dalam 96-plat perigi. Pertama, sel telah diinkubasi dengan kepekatan FeSO yang berbeza4 dalam medium yang ditakrifkan sintetik (SD), dan pertumbuhan dianalisis pada titik masa yang berbeza (16 jam, 24 jam, dan 48 jam). Pertumbuhan sel mencapai tepu kira-kira 24 jam selepas mengeram dengan FeSO4 kepekatan (Tambahan Rajah S1a, b). Seterusnya, kami menentukan CLS sel yang diinkubasi dengan kepekatan FeSO yang berbeza4. Kami menganggap kultur sel fasa pegun 48 jam sebagai Hari 1 untuk analisis CLS. Daya maju sel tua pada titik yang berbeza telah dinormalisasi dengan Hari 1 (100 peratus berdaya maju) dan diplot pada graf kemandirian. Kami mendapati bahawa kepekatan FeSO yang berbeza4 suplemen dalam medium memanjangkan CLS yis (Rajah1a dan S1c). Kami juga menguji Besi(III) klorida (FeCl3) dan menemui hasil yang serupa dengan FeSO4 (Angka1b dan S2a). Untuk menjelaskan sama ada FeSO4 dan FeCl3 garam, komponennya Besi(II) dan Besi(III), atau sulfat dan klorida memanjangkan CLS, kami memeriksa garam sulfat dan klorida yang lain. Sel yis diinkubasi dengan CaSO4, MgSO4, CaCl2, danMgCl2 termasuk FeSO4, dan FeCl3 dalam medium SD. Pertumbuhan sel yang diinkubasi dengan garam yang berbeza mencapai ketepuan selepas 24 jam (Tambahan Rajah S2b). Kami seterusnya mengukur survival dan mendapati bahawa kecuali FeSO4 dan FeCl3, garam lain yang mengandungi sulfat atau klorida tidak memanjangkan jangka hayat yis (Rajah1c). Keputusan ini mendedahkan bahawa besi, tetapi bukan sulfat dan klorida, memanjangkan CLS yis. Untuk pengesahan lanjut, kami menghabiskan besi dan menganalisis CLS yis. Bathophe nanthrolinedisulfonic acid (BPS) ialah sebatian chelator besi khusus yang mengasingkan besi dan membawa kepada kekurangan zat besi dalam sel.33]. Sel yis diinkubasi dengan besi dan kepekatan BPS yang berbeza dalam medium SD. Pertumbuhan sel kepekatan yang berbeza mencapai tepu selepas 24 jam (Tambahan Rajah S2c). Kami selanjutnya mengukur kelangsungan hidup sel dan mendapati penambahan BPS mengurangkan jangka hayat sel yang diberi zat besi (Rajah1d). Secara keseluruhannya, keputusan ini mengesahkan bahawa suplemen zat besi meningkatkan jangka hayat yis.

Rajah 1.Suplemen besi meningkatkan jangka hayat kronologi yis. Strain yis prototropik diinkubasi dengan keadaan kimia yang berbeza dalam medium takrifan sintetik (SD) dan ditanam dalam {{0}}plat perigi pada 30 ◦C. Sel yang tumbuh kepada fasa pegun dianggap Hari1 (100 peratus survival sel) untuk analisis jangka hayat kronologi (CLS). Kelangsungan hidup sel dikira pada pelbagai titik masa umur dengan ujian pertumbuhan. (a) CLS sel ditambah dengan kepekatan FeSO4 yang berbeza. (b) CLS sel ditambah dengan kepekatan FeSO4 dan FeCl3 yang berbeza. (c) CLS sel ditambah dengan 100 µM FeSO4, FeCl3, CaSO4, MgSO4, CaCl2, dan MgCl2. (d) CLS sel ditambah dengan 100 µM FeSO4 dengan kehadiran kepekatan BPS yang berbeza. Kepentingan statistik (* p < 0.05) ditentukan oleh ujian-t Pelajar.