Menyiasat mekanisme di mana Cistanche Desertacola merawat penyakit Alzheimer menggunakan farmakologi rangkaian dan pengesahan eksperimen

[Abstrak]

 

Objektif: Untuk menerokaMekanisme berpotensi Cistanche Deserticola pada Penyakit Alzheimer (AD)melaluiFarmakologi Rangkaiandan eksperimen haiwan.

Kaedah:MeramalkanSasaran berkaitan penyakit Cistanche dan Alzheimer menggunakan farmakologi rangkaian; 40 lelaki 7- tikus SAMP8 bulan yang rawak dibahagikan kepada kumpulan kawalan model (model), dosis rendah (L-GCs), kumpulan rawatan sederhana (M-GCs), dan kumpulan rawatan dos (H-GCs) yang sama. Selepas 30 d pentadbiran intragastrik GC, maze air Morris dan eksperimen maze Y digunakan untuk menguji kebolehan pembelajaran dan memori setiap kumpulan tikus. Pewarnaan Nissl digunakan untuk melihat bilangan dan morfologi neuron di rantau CA1 hippocampal tikus. Pewarnaan imunohistokimia dan eksperimen blot Barat digunakan untuk mengesan ekspresi PI3K, P-AKT, dan P-Tau dalam hippocampus tikus. Keputusan: 8 Komponen yang berkesan termasuk verbascoside telah ditayangkan dari Cistanche deserticola, dan gen teras yang terlibat dalam rawatan AD adalah Akt1, TNF, CASP3, dan lain-lain. Laluan isyarat yang berkaitan dengan rawatan AD oleh Cistanche Desertacola termasuk PI3K-Akt, laluan TNF, dan laluan Rage Umur. Eksperimen haiwan menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan model, latensi melarikan diri dan jarak jauh dalam ujian navigasi maze air Morris berkurangan dengan ketara (p<0.05), and the number of platform crossings significantly increased (P<0.05) in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments, the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group significantly increased (P<0.05), while the expression of P-Tau/Tau significantly decreased (P<0.05). Conclusion: GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.

[Kata kunci]Farmakologi rangkaian;Penyakit Alzheimer; Cistanche Desertacola; Tikus SAMP8; Apoptosis

 

 

 

Suplemen herba cistanche berkualiti tinggi

 

1 Bahan dan Kaedah

1.1 Bahan

1.1.1 Platform Pangkalan Data dan Analisis

Pangkalan data utama dan platform analisis yang digunakan dalam kajian ini (Jadual 1).

 

Tab 1 platform analisis dan pangkalan data yang berkaitan yang digunakan dalam kajian ini

Nama	Laman web	Versi
Pangkalan Data Farmakologi Sistem Perubatan Cina Tradisional (TCMSP)	https://www.tcmsp-e.com/	2.3
Uniprot	https://www.uniprot.org/
Pubchem	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Venny	https://bioinfo.cis.cornell.edu/tools/venn/
Genecards	https://www.genecards.org/
Pangkalan Data NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
KELUARGA	https://omim.org/
Pangkalan Data String	https://cytoscape.org/	11
Perisian Cytoscape	https://cytoscape.org/	3.8.0 - 3.9.1
Metascape	https://metascape.org/

 

1.1.2 Haiwan Eksperimen

Haiwan eksperimen yang digunakan dalam eksperimen ini adalah tikus tikus SPF-gred yang dipercepatkan pada tikus 8 (SAMP8) tikus, yang dibesarkan dari usia 2 bulan hingga 7 bulan dan dimasukkan ke dalam eksperimen. Semua haiwan dibesarkan di ruang haiwan gred SPF pusat percubaan haiwan Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology [SYXK (Meng) 2018-0001], dengan suhu (24. {9}} ± 1. Suapan dan air minuman yang mencukupi disediakan, dan tikus bebas makan dan minum. Kitaran cahaya/gelap adalah 12 h/12h untuk memastikan irama tikus biasa. Semua operasi haiwan dan protokol eksperimen yang terlibat dalam eksperimen ini dijalankan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Eksperimental Baotou Medical College (Baoyi Ethics 2018 No. 011).

1.1.3 Reagen dan Instrumen Utama

Penampan Lysis RIPA kecekapan tinggi (R0010), ECL ditambah larutan luminescent ultra sensitif (PE0010), penampan elektroforesis (T1070), penampan pemindahan (D1060), penampan pemuatan protein (p1015), dan lain-lain. Kit Immunohistochemistry (pv -9000) dibeli dari Beijing Zhongshan Jinqiao; Kit Pengesanan Protein BCA (23227) dibeli dari Thermo Scientific, Amerika Syarikat. Phosphoinositide 3- kinase (PI3K) antibodi, protein kinase B protein kinase B (Akt) antibodi (AF0016), antibodi P -Akt (AF6261) Antibodi sekunder anti-arnab kambing (SA 00001-2) telah dibeli dari ProteIntech, Amerika Syarikat.
Parafin slicer (Leica, Jerman), mikroskop optik (Leica, Jerman), ruang ujian lapangan terbuka (Shanghai xinruan), maze maze maze {}} Shaker (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), Sistem Analisis Pengimejan Gel Protein (Shanghai Tanon Technology), dan pembaca mikroplat (Thermo Fisher, Amerika Syarikat).

 

1.2 Kaedah

1.2.1 Analisis Farmakologi Rangkaian

1.2.1.1 Penyaringan bahan -bahan aktif dan titik sasaran Cistanche Deserticola

Pemeriksaan titik sasaran Cistanche desertacola: semua bahan-bahan aktif kimia dicari dalam pangkalan data TCMSP (https://www.tcmsp-e.com) dengan Cistanche deserticola sebagai kata kunci, dan kebolehmampetan yang lebih besar daripada sebatian yang dikumpulkan; Platform Swiss Adme digunakan untuk menambah bahan -bahan kimia yang tidak terdapat di platform TCMSP dengan skor penyerapan gastrousus (penyerapan GI) skor "tinggi" dan rupa dadah sekurang -kurangnya 2 "ya"
(https://www.uniprot.org) [10].

 

1.2.1.2 Pengambilalihan sasaran penyakit AD

Menggunakan "penyakit Alzheimer" sebagai istilah carian, cari sasaran penyakit di OMIM, Genecards, dan pangkalan data NCBI.

 

1.2.1.3 Penciptaan Rajah Venn dan Rangkaian Interaksi Protein Protein (PPI)

Masukkan sasaran dadah dan sasaran penyakit di laman web Venny Diagram, buat gambarajah Venn, dan dapatkan persimpangan sasaran. Import pangkalan data rentetan untuk membina rangkaian interaksi protein, tetapkan spesies biologi kepada "homo sapiens", dan dapatkan rajah rangkaian interaksi protein. Gunakan perisian Cytoscape untuk menapis sasaran teras berdasarkan tahap, kedekatan, dan nilai antara sasaran, dan gunakan analisis plug-in untuk menarik graf.

1.2.1.4 Pergi dan analisis KEGG

Gunakan platform dalam talian David dan platform dalam talian metascape untuk melaksanakan analisis GO dan KEGG pengayaan pada sasaran teras yang disebutkan di atas, dan skrin item dengan P kurang daripada atau sama dengan 0. 05. Gambarajah gelembung GO dan analisis pengayaan KEGG telah diambil menggunakan maklumat mikro platform lukisan dalam talian.

 

1.2.2 Pengumpulan Haiwan Eksperimen dan Penyediaan Model

40 tikus SAMP8 secara rawak dibahagikan kepada kumpulan model, kumpulan cistanche cistanche destercola (L-GCS), kumpulan cistanche desertacola (M-GCs), dan kumpulan cistanche cistanche yang tinggi (H-GCS), dengan 10 tikus dalam setiap kumpulan; 10 tikus SAMR1 seks dan berat yang sama digunakan sebagai kumpulan kawalan SAMR1. Kumpulan L-GCS, kumpulan M-GCS, dan kumpulan H-GCS telah diadakan dengan GCS pada dos 25 mg/(kg · d), 50 mg/
(kg · d), dan 100 mg/(kg · d), masing -masing. Kumpulan SAMR1 dan kumpulan model diberi dos yang sama dengan garam normal, dan semua kumpulan telah dialihkan selama 30 hari berturut -turut.

 

1.2.3 Eksperimen tingkah laku

1.2.3.1 Eksperimen Maze Air Morris

Eksperimen navigasi lokasi: Pada hari ke -24 hingga ke -30 pentadbiran GCS, eksperimen navigasi lokasi dijalankan dalam 1 hingga 5 hari pertama. Maze air dibahagikan kepada empat kuadran, dan platform diletakkan di kuadran ketiga, sedikit lebih tinggi daripada permukaan air sebanyak 2 cm. Tikus diletakkan di dalam air dengan kepalanya menghadap dinding kolam, dan ia diperhatikan sama ada ia dapat mencari platform dalam 60 saat yang ditentukan dan tinggal di platform selama 2 hingga 3 saat. Kekerapan latihan untuk setiap tetikus adalah empat kali sehari, dan titik permulaan setiap kali adalah kuadran yang berbeza. Selang masa antara setiap dua latihan tidak seharusnya kurang dari 15 minit. Sekiranya tetikus tidak menemui platform dalam masa 60 saat, ia dipandu untuk kekal di platform selama 3 hingga 5 saat. Semasa eksperimen, latensi melarikan diri dan panjang laluan setiap kumpulan tikus dicatatkan; Selepas 6-7 hari, eksperimen penerokaan spatial digunakan: platform dalam kuadran ketiga telah dikeluarkan, dan tikus memulakan eksperimen penerokaan dari kuadran pertama. Waktu penerokaan adalah 60 s, dan bilangan lintasan platform dan peratusan masa dalam kuadran sasaran setiap kumpulan tikus dicatatkan.

 

1.2.3.2 Y-MAZE Eksperimen

Y-maze terdiri daripada tiga lengan saiz dan bentuk yang sama: lengan awal, lengan novel, dan lengan yang lain. Sebelum percubaan, pintu masuk lengan novel telah disekat, membolehkan tikus secara bebas meneroka dua tangan yang tinggal selama 10 minit. 1 jam selepas penerokaan, pintu masuk ke lengan novel dibuka, dan tetikus diletakkan pada permulaan lengan awal. Masa tetikus meneroka lengan novel dalam masa 5 minit telah direkodkan, dan bilangan kali tetikus berjaya memasuki dan keluar dari lengan novel dikira. Kadar penggantian spontan tetikus dikira [kadar penggantian (%)=bilangan penggantian yang berjaya/(jumlah bilangan penyertaan lengan -2) × 100%] [14].

 

1.2.4 NISSL Pewarnaan

Selepas 30 hari pentadbiran dadah, tikus telah dibius dan diperbetulkan dengan garam di dalam hati. Selepas darah dikeringkan, tikus terbunuh dan tisu otak diambil. Tisu otak tikus telah ditetapkan oleh rendaman dalam 4% paraformaldehyde untuk 24-48 H, dehidrasi dengan alkohol kecerunan menaik, transparan dengan xilena, dan tertanam dalam parafin. Ketebalan kepingan adalah 5 μm. Dewaxing rutin ke air, pewarnaan metilena biru, pembezaan, dehidrasi etanol, telus xilena, dan pengedap resin. Morfologi dan bilangan neuron di rantau CA1 hippocampus tetikus diperhatikan di bawah mikroskop pada 200 kali.

1.2.5 Pewarnaan imunohistokimia

Bahagian-bahagian tisu otak secara rutin disegarkan ke dalam air, diletakkan dalam larutan pembaikan antigen sitrat sitrat dan dipanaskan oleh microwave tekanan tinggi, dibilas dengan penampan PBS selama 5 minit × 3 kali, menambah penyekat peroksidase endogen, dibasuh dengan PBS selama 5 min × 3 kali. Keesokan harinya, dibilas dengan penampan PBS selama 5 minit × 3 kali, kemudian menambah penyelesaian peningkatan tindak balas, dibasuh lagi dengan PBS selama 5 minit × 3 kali, diinkubasi dengan antibodi sekunder pada 37 darjah selama 20 minit, dibilas dengan PBS selama 5 minit Transparentisasi dengan xilena.

 

1.2.6 Blot Barat

Sebahagian daripada tisu hippocampal tetikus telah ditambah kepada penampan lisis RipA protein, sepenuhnya dengan batang pengisaran, homogenisasi oleh ultrasound dalam mandi ais, dan ditinggalkan di atas ais selama 30 minit. Kemudian gunakan ultracentrifuge suhu rendah untuk centrifuge pada 12, 000 r/min selama 15 minit, ambil supernatan, dan gunakan kaedah BCA untuk menentukan kepekatan proteinnya. Ambil 20 ug protein dan tambahkannya ke penampan pemuatan protein, denaturnya pada 100 darjah selama 5 minit, pasang gel pekat dan pemisahan yang telah dikonfigurasikan dalam tangki elektroforesis, dan lakukan elektroforesis voltan tetap 80 V. Kemudian gunakan arus berterusan 300 mA dan pindahkan membran selama 130 minit. Blok dengan susu skim pada suhu bilik selama 2 jam, cairkan antibodi utama pada 1: 1 500 kali, masukkannya dalam peti sejuk pada 4 darjah semalaman, basuh membran, dan inkubasi antibodi sekunder pada suhu bilik selama 2 jam. Selepas membangun dengan sistem analisis pengimejan, analisis nilai kelabu setiap kumpulan band.

 

1.2.7 Analisis Statistik

Semua data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (x  s), dan SPSS 25. 0 dan perisian GraphPad Prism9.5 digunakan untuk analisis data dan grafik. Ujian SNK-Q digunakan untuk perbandingan pasangan, dan satu arah Anona digunakan untuk perbandingan sampel berganda. P<0.05 indicated statistically significant differences.