Perlindungan Usus Oleh Proanthocyanidins Melibatkan Tindakan Anti-oksidatif Dan Anti-radang dalam Gabungan Dengan Penambahbaikan Sensitiviti Insulin, Lipid Dan Homeostasis Glukosa Bahagian 2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Ungkapan tein menggunakan Western blot. Rajah 6 menunjukkan bahawa penambahan Fe/Asc kepada sel Caco-2/15 meningkatkan tahap dua enzim penting, tetapi PAC mengimbangi regulasi yang disebabkan oleh Fe/Asc.

Memandangkan isyarat insulin memodulasi proses lipogenesis, FA -pengoksidaan, dan glukoneogenesis, adalah penting untuk menyiasat pengaruh Fe/Asc dan PAC pada MAPK dan PI3K/Akt, dua laluan isyarat insulin utama. Untuk tujuan ini, sel Caco-2/15 telah diinkubasi dengan insulin sebelum sel Caco-2/15 yang lain

Rajah6.Kesan PAC terhadap glukogenesis dalam sel Caco-2/15. Proanthocyanidins(PACs, 250 ug/mL) telah ditambahkan pada petak sel apikal selama 24 jam sebelum rawatan dengan Fe/Asc （200μM/2 mM） selama 6j pada 37 darjah . Ekspresi protein (A) G6Pase dan (B)PEPCK dinilai oleh Western blot.serbuk cistancheKeputusan mewakili min±SEM bagi 3 eksperimen bebas, setiap satu dalam tiga kali ganda. Satu tompok Barat yang mewakili ditunjukkan, menggambarkan eksperimen dalam tiga kali ganda pada gel yang sama dan pada pendedahan yang sama.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">akar cistancheG6Pase glukosa-6-fosfatase, PEPCK phosphoenolpyruvate carboxykinase.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

rawatan untuk mengaktifkan laluan isyarat. Walaupun Fe/Asc menaikkan p38-ungkapan protein MAPK dan nisbah fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, PAC menghalang tindakan ini (Gamb.7A-C). Sebaliknya, manakala Fe / Asc menurunkan jisim protein fosfo Akt (pAkt) dan nisbah Akt / Akt, PAC menunjukkan keupayaan untuk mengekalkan tahap normal mereka. Trend yang sama telah diperhatikan untuk PI3K (Rajah 7D-I. Oleh itu, pemerhatian ini menyokong peranan PAC yang menggalakkan dalam isyarat insulin.

Perbincangan

Polifenol terkenal dengan kesan biologi dan perubatan pleiotropiknya, yang menerangkan tarikan ramai saintis dan industri makanan kepada produk semula jadi terbitan tumbuhan yang menarik ini. PAC menonjol daripada kepelbagaian dan bilangan polifenol yang tinggi kerana kesan farmakologi dan terapeutiknya terhadap gangguan kronik2021. Walaupun ciri-cirinya yang patut dipuji, masih banyak yang tidak diketahui tentang pengaruhnya pada saluran GI, yang menggunakan rangkaian penghadaman, imunologi, neuron dan metagenomik yang diperluas2.tidur cistancheAtas sebab ini, usaha telah didedikasikan dalam penyiasatan ini untuk menjelaskan peranan PAC dalam OxS usus, pertahanan antioksidan, keradangan, pengoksidaan FA, lipogenesis, dan glukoneogenesis, sementara pada masa yang sama cuba untuk menjelaskan mekanisme asas seperti isyarat insulin. dan status faktor transkripsi.

Untuk menyiasat kesan PAC, kami menggunakan barisan sel Caco-2/15, model usus popular yang kebanyakannya dihargai oleh komuniti saintifik2 dan diiktiraf oleh Pentadbiran Makanan dan Ubat untuk proses pengambilan dan pengangkutan4. Bukan sahaja sel Caco-2/15 secara spontan membezakan kepada enterosit manusia secara fungsional dan morfologi3,25, tetapi ia juga berfungsi untuk penerokaan penyerapan dan interaksi usus yang cekap, pemakanan, toksikologi, mikrobiologi makanan, ujian bioavailabiliti dan penyaringan kebolehtelapan dadah dalam program penemuan2²627. Seperti dalam laporan kami sebelum ini mengenai pelbagai topik28-3】, barisan sel Caco-2/15 telah memainkan peranan penting dalam kajian semasa untuk membongkar potensi PAC untuk mengawal selia laluan metabolik yang pelbagai. Yang penting, dalam kajian ini, sel-sel telah disemai pada penapis berliang, membenarkan akses kepada kedua-dua belah epitelium usus bipolar: petak apikal dan basolateral yang sepadan dengan lumen usus atau peredaran serosal, masing-masing Selain itu, kami pra-inkubasi Caco-2 /15 sel dengan Fe/Asc, kerana sistem ini sangat relevan di makmal kami untuk mendorong OxS dan keradangan yang kuat, yang seterusnya dicabar oleh spektrum besar kesan17,1932-3 Perlu diberi perhatian, Fe/Asc sebagai oksigen yang kuat -sistem penjanaan radikal menyebabkan kerosakan oksidatif kepada makromolekul biologi, mengubah persekitaran redoks intraselular dan terlibat dalam pelbagai keadaan patologi2.35,56. Penemuan kami menunjukkan peningkatan ketara peroksidasi lipid (paras MDA yang tinggi) bersama-sama dengan pertahanan antioksidan yang terdedah (GPx rendah dan Ekspresi protein SOD2).faedah cistanche tubulosaTambahan pula, berdasarkan keupayaannya untuk menghasilkan lipid peroksida, kompleks Fe/Asc menggalakkan keradangan seperti yang dibuktikan oleh peningkatan ekspresi TNFa, COX2, dan NF-is. Secara kolektif, keputusan sekarang mengesahkan penjanaan radikal dan keradangan sebagai tindak balas kepada Fe / Asc

Kehadiran PAC mengatasi peroksidasi lipid pengantara Fe/Asc. Oleh kerana kegagalan pertahanan antioksidan dapat menjelaskan induksi OCS, kami meneliti tindakannya terhadap enzim antioksidan endogen. Malah, PAC dapat memulihkan penurunan SOD2 dan GPx yang dimediasi Fe/Asc. Untuk menggambarkan mekanisme pemburukan OxS oleh Fe/Asc dan pengurangan oleh PAC, kami menilai laluan isyarat Keap1-NRF2-elemen tindak balas antioksidan (ARE), yang dianggap sebagai antioksidan endogen paling berkuasa. pengawal selia37.teh cistancheNRF2 ialah sensor OCS selular yang berfungsi untuk mengekalkan homeostasis redoks. Dalam keadaan biasa. NRF2 secara berterusan di mana-mana dan disasarkan untuk kemerosotan proteasomal oleh pengawal selia terikat negatifnya Keap18. Dengan kehadiran pengesan endogen dan eksogen, Keapl dinyahaktifkan dan dikurangkan, dengan itu mengganggu interaksi Keapl-NRF2 dan melepaskan NRF2, yang dipindahkan ke nukleus sel, mengikat kepada promoter yang mengandungi

Rajah 7. Kesan PAC pada kepekaan insulin dalam barisan sel Caco{1}}/15. Proanthocyanidins(PACs, 250 ug/mL) telah ditambah pada petak sel apikal selama 24 jam sebelum rawatan dengan Fe/Asc（200μM/2 mM） selama 6j pada 37 darjah . Dua jam sebelum tamat 6h-inkubasi dengan campuran Fe/Asc, insulin (100 nM) telah ditambah untuk menilai sensitiviti insulin. Ungkapan protein bagi(A) p38-MAPK,(B) fosfor p38-MAPK,(D)Akt,(E)phospho Akt,(G) PI3k dan (H) fosfo PI3k ialah dinilai oleh Western blot. Nisbah(C) fosfo p38-MAPK/p38-MAPK,(F)phospho Akt/Akt dan (Dphospho PI3k/PI3k kemudiannya dikira. Keputusan mewakili min±SEM bagi 3 eksperimen bebas setiap satu dalam pendua. Satu tompok Barat yang mewakili ditunjukkan, menggambarkan eksperimen dalam tiga kali ganda pada gel yang sama dan dengan pendedahan yang sama.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE, dan mempercepatkan transkripsi enzim antioksidan39. Menurut data kami, rawatan sel Caco-2/15 dengan PAC menindas Keapl dan berkemungkinan membenarkan NRF2 dipindahkan ke nukleus yang membenarkan pengikatan kepada ARE (jujukan teras: 5'TGACnnnGC3') dalam kawasan promoter gen antioksidan (SOD2 dan GPx), mengakibatkan rangsangan transkripsi mereka dan peraturan naik yang diselaraskan. Selaras dengan data ini, sebatian resveratrol fenolik menghalang OxS dalam synoviosit seperti fibroblast arthritis rheumatoid H, O, yang dirawat dengan mempromosikan ekspresi NRF2 dan mengurangkan ekspresi Keap12. Selain itu, menurut Kanzaki et al, pengaktifan enzim antioksidan dan sitoprotektif boleh dikaitkan dengan nisbah NRF2/Keapl1.

Seperti yang dijangkakan daripada pemulihan OCS, PAC merendahkan keradangan dengan ketara seperti yang dibuktikan oleh penurunan peraturan TNFa dan COX2. Oleh kerana NF-KB ialah pengawal selia utama sitokin proinflamasi, kami memeriksa tindak balasnya terhadap PAC. Selaras dengan trend agen keradangan, PAC membatalkan induksi NF-KB pengantara Fe/Asc dan nisbah NF-KB/IikB yang dikurangkan. Oleh itu, kita boleh menganggap secara munasabah bahawa PAC membantu mengawal keradangan yang membahayakan fungsi sel usus melalui kawalan NF-kB, pengawal selia utama tindak balas keradangan. Perlu dinyatakan bahawa PAC boleh melindungi daripada keradangan dengan merangsang mekanisme pertahanan antioksidan selular kerana wujud hubungan rapat antara biomarker ketidakseimbangan redoks dan keradangan2.

Kajian ini bertujuan untuk menyiasat kesan Pac pada homeostasis lipid usus. Penemuan menarik kami menunjukkan bahawa PAC mengimbangi CPTla, di satu pihak, dan menurunkan FAS, yang masing-masing mewakili biomarker FA -pengoksidaan dan lipogenesis. Oleh itu, enzim ini adalah sasaran berpotensi PAC, yang menunjukkan potensi polifenol untuk mencegah pengumpulan lipid, dianggap sebagai manifestasi patologi keradangan OxSand dalam banyak tisu*3. Mekanisme molekul mungkin berkaitan dengan upregulation PPARa dan downregulation SREBPlc, dua faktor transkripsi yang mengawal metabolisme lipid. FAS ialah enzim pusat dalam lipogenesis, bertanggungjawab untuk memangkinkan penukaran malonyl-CoA kepada FAs45. Di sisinya, ACC memangkinkan pembentukan malonyl-CoA, substrat penting untuk FAS. Selaras dengan penemuan kami, polifenol Solanum nigrum juga didapati mengurangkan FAS dan SREBP, sambil meningkatkan CPTla dan PPARa dalam hepatosit yang dirawat asid oleik"6.

Mekanisme tindakan polifenol secara amnya dikaitkan dengan pengaktifan fosforilasi AMPKa7. Yang penting, AMPKa terfosforilasi dalam kajian kami telah diturunkan oleh Fe / Asc, tetapi dirangsang oleh PAC, yang menerangkan penurunan regulasi fosfo ACC, mengakibatkan lipogenesis yang menghalang dan peningkatan metabolisme tenaga. Walau bagaimanapun, ekspresi protein AMPKa telah meningkat oleh OxS yang disebabkan oleh Fe / Asc dalam sel Caco2/15. Oleh itu, ROS dan OxS boleh mendorong AMPKa melalui kinase hulu yang berbeza8.

OCS dan keradangan sangat mendorong rintangan insulin dan gangguan metabolik tambahan9,50, yang mendorong kami untuk menilai keupayaan Pac untuk mengawal selia beberapa protein utama berbanding dengan laluan isyarat insulin. Kami mula-mula memfokuskan pada p38-MAPK yang ekspresinya didapati dikawal oleh OxS sambil mengganggu lata isyarat reseptor insulin. Kedua-dua analisis p38-MAPKfosforilasi dan pengiraan fosfo p38-MAPK/p38-nisbah MAPK menunjukkan peningkatan ketara dalam tindak balas kepada Fe/Asc, yang serasi dengan IS terjejas dalam Caco{ {6}}/15 sel. Pengesahan diperoleh dengan penurunan pAkt dan PI3K. Sebaliknya, PAC membalikkan arah aliran kerana mereka memaparkan keupayaan untuk mengurangkan p38-fosforilasi MAPK dan nisbah phospho p38-MAPK/p38-MAPK sambil meningkatkan laluan isyarat PI3K/Akt, yang diketahui sebagai pengantara tindakan biologi utama insulin dengan mengawal pengangkutan glukosa, sintesis protein, percambahan selular, kemandirian sel, dan glukoneogenesis. Kemerosotan dalam IS akibat OxS dan keradangan kronik juga boleh menjejaskan proses glukoneogenesis3,54. Analisis dua enzim utama yang terlibat dalam sintesis glukosa de novo (PEPCK, G6Pase) mendedahkan peningkatan ketara dalam tindak balas kepada Fe / Asc manakala pentadbiran PAC membawanya kembali ke paras normal dalam sel Caco2/15.

Kesimpulannya, banyak kajian dalam literatur saintifik menunjukkan kesan kesihatan yang ketara bagi sebatian fenolik sama ada sebagai molekul fenolik tertentu atau campuran beberapa polifenol dengan bukti tidak langsung. Kerja ini menunjukkan kesan penting PAC (flavanol kompleks) dalam homeostasis usus dengan menghalang OxS, keradangan, dan gangguan metabolik yang berkaitan. Memandangkan PAC mungkin tidak diserap sepenuhnya oleh usus kecil, kajian lanjut diperlukan untuk menyiasat mekanisme yang terlibat dalam kesan kesihatan yang bermanfaat dalam usus kecil.

Bahan dan kaedah

Kultur dan rawatan sel Caco-2/15 usus. Untuk semua eksperimen, kami menggunakan barisan sel adenokarsinoma kolorektal epitelium manusia Caco-2/15, klon stabil bagi sel Caco-2 induk (American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA), yang diperolehi daripada Dr. JF Beaulieu (Jabatan Biologi Selular, Fakulti Perubatan, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Kanada). Barisan sel Caco-2/15 mempunyai sifat unik untuk membezakan secara in vitro kepada enterosit matang terpolarisasi dan membentuk mon-over yang tidak telap. Sel Caco-2/15 telah dikultur seperti yang diterangkan sebelum ini323455 dan digunakan untuk kajian integriti sel, OCS dan keradangan17,19 dan IS56.

Analisis ekspresi protein dengan immunoblotting. Selepas pengeraman dengan pelbagai rawatan, sel Caco-2/15 telah dilisekan dalam penimbal ais sejuk yang mengandungi 20 mM Tris-HCl(pH 7.4),150 mM NaCl,1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA,1 peratus NP -40,1 peratus deoksikolat,2.5 mM natrium pirofosfat,1 mM Na2VO4, 1 ug/mL leupeptin dan 1 mM PMSF. Kepekatan protein setiap sampel ditentukan menggunakan kaedah Bradford （Bio-Rad）. Protein kemudiannya dinyahtutur selama 5 minit dalam penimbal sampel yang mengandungi SDS dan ß-mercaptoethanol. Homogenat yang mengandungi 15 ug jumlah protein diasingkan pada gel SDS-polyacrylamide 10 peratus mengikut berat molekul protein dan telah dielektros ke membran nitroselulosa. Susu bebas lemak digunakan untuk menyekat tapak membran yang tidak spesifik sebelum menambah antibodi primer semalaman pada 4 darjah . Pencairan antibodi dilaporkan dalam Maklumat Tambahan dan dalam penerbitan terbaru kami. Jalur reaktif telah ditangkap menggunakan Sistem Pengimejan MP ChemiDoc (Bio-Rad). Semua data dinyatakan sebagai nisbah protein sasaran kepada -aktin dalam sampel yang sama.

Analisis statistik. Semua nilai dinyatakan sebagai min ± SEM bagi sekurang-kurangnya tiga eksperimen berbeza yang dijalankan dalam tiga kali ganda. Data dianalisis dengan ANOVA sehala diikuti oleh ujian perbandingan berbilang Tukey menggunakan PRISM 7.0(Perisian GraphPad, San Diego, CA, Amerika Syarikat). Perbezaan dianggap penting di P<>

Artikel ini diekstrak daripada Scientifc Reports|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5