Gangguan Glikosida Phenylethanoid Daripada Cistanche Tubulosa Dengan Ujian MTT

1. Pengenalan

Tumbuhan parasitCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceaekeluarga) diedarkan secara meluas di negara-negara Afrika Utara, Arab, dan Asia [1]. Berpunca daripadaC. tubulosadanC. deserticolaadalah penting dalam perubatan tradisional Cina, telah digunakan untuk merawat mati pucuk, kemandulan, sakit pinggang, dan sembelit akibat inersia kolon [2]. Selain itu, ekstrak etanol daripadaC. tubulosatelah terbukti mempunyai kesan perlindungan yang ketara terhadap hipoksia serebrum pada tikus [3].

Sel endothelial memainkan peranan penting dalam patogenesis hipertensi pulmonari hipoksik. Barisan sel endothelial EA.hy926 adalah serupa dengan sel endothelial primer. Semasa kajian kami tentang kesan antihipoksik ekstrak etanol C. tubulosa pada sel endothelial EA.hy926, kami mendapati bahawa 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){{7 }},5-ujian diphenyltetrazolium bromide (MTT), yang biasanya digunakan untuk menilai daya maju sel dalam kajian sitotoksisiti dan aktiviti sitostatik, menghasilkan keputusan yang bercanggah dengan menunjukkan peningkatan daya maju sel EA.hy926 selepas rawatan.

Penilaian yang tepat tentang daya maju sel adalah penting untuk mengenal pasti potensi kesan sitotoksik atau sitoprotektif bagi agen perubatan. Oleh itu, kami menyiasat komponen mana yang terdapat dalam ekstrak etanol C. tubulosa yang mungkin bertanggungjawab terhadap keputusan bercanggah yang diperhatikan dengan ujian MTT. Kami mengasingkan dua utamaphenylethanoid glycosides (PhGs)daripada ekstrak etanol C. tubulosa,echinacoside (selepas ini kompaun 1) dan acteoside (selepas ini kompaun 2). Kami menentukan kesannya terhadap daya maju sel EA.hy926 menggunakan pelbagai kaedah. Di samping itu, untuk menjelaskan lebih lanjut substituen mana bagi sebatian 1 dan 2 yang mungkin bertanggungjawab terhadap keputusan yang bercanggah, kami menguji aglikon, asid kafeik (selepas ini sebatian 3) dan 3,4-dihydroxylphenylethanol (selepas ini sebatian 4), pada EA daya maju sel .hy926 menggunakan kaedah yang sama.

NATUR CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENGHALANG APOPTOSIS PHGS75% ECH 30% BERAKTA 12%

2. Keputusan dan Perbincangan

2.1. Pengenalpastian Sebatian

Struktur dua sebatian yang diasingkan daripadaC. ekstrak etanol tubulosatelah dikenal pasti melalui analisis resonans magnetik nuklear (NMR) dan spektrometri jisim (MS), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1. Kompaun 1 dikenal pasti sebagai echinacoside dengan perbandingan dengan NMR (Jadual 1) dan MS (m/z 785 [M−H) yang dilaporkan sebelum ini. ]− ) data [4]. Spektrum NMR kompaun 2 sangat serupa dengan kompaun 1, kecuali ketiadaan kumpulan -D-glucopyranosyl (Jadual 1). Sebatian 2 (m/z 623 [M−H]− ) dikenal pasti sebagaiacteoside[5]. Yang penting, kedua-dua sebatian mempunyai aglikon yang sama, yang merangkumi asid kafeik (sebatian 3) dan 3,4-dihydroxylphenylethanol (sebatian 4).

2.2. Ujian Daya Tahan Sel

Ujian MTT dan CCK{{0}} digunakan untuk menganalisis kesan sebatian 1–4 pada daya maju sel EA.hy926. Ujian MTT menunjukkan bahawa daya maju sel EA.hy926 meningkat dengan ketara selepas rawatan dengan 25 dan 50 μM sebatian 1, 2, atau 3 (166.3% dan 174.1% untuk sebatian 1, 205.8% dan 224.3% untuk sebatian 2, dan 164.8% dan 189.6% untuk kompaun 3, masing-masing; p < 0.05) jika dibandingkan dengan sel kawalan (Rajah 2A). Tambahan pula, pemeriksaan morfologi sel menentukan bahawa rawatan dengan 50 μM kompaun 1, 2, atau 3 meningkatkan pembentukan kristal formazan ungu, yang merupakan petunjuk langsung perkadaran sel hidup (Rajah 3). Sebaliknya, ujian CCK-8 mencadangkan bahawa daya maju sel menurun dengan ketara selepas rawatan dengan 12.5, 25, dan 50 μM kompaun 1, 2, atau 3 (75.5%, 45.1% dan 43.7% untuk kompaun 1, 85.5%, 51.8%, dan 34.3% untuk kompaun 2, dan 64.5%, 48.2%, dan 36.4% untuk kompaun 3, masing-masing; p < 0.05), berbanding dengan sel kawalan (Rajah 2B). Kompaun 4 tidak menjejaskan daya maju sel sama ada dalam ujian MTT atau CCK-8. Percanggahan antara keputusan yang diperolehi dengan dua ujian menunjukkan bahawa salah satu daripada dua ujian mungkin tidak menggambarkan dengan tepat kesan sebatian 1 dan 2 pada daya maju sel EA.hy926.

2.3. Penilaian Apoptosis oleh Hoechst

Pewarnaan Hoechst 33342 ialah pewarnaan DNA telap sel yang teruja oleh cahaya ultraungu dan memancarkan pendarfluor biru pada 460 hingga 490 nm. Kromatin pekat sel apoptosis mengotorkan lebih terang daripada kromatin sel normal [6]. Manakala sel kawalan mempamerkan kromatin yang tersebar secara seragam, organel normal, dan membran sel utuh, sel yang diinkubasi dengan sebatian 50 μM 1, 2, atau 3 selama 48 jam menunjukkan pewarnaan tipikal sel apoptosis (Rajah 4A). Sebaliknya, pendedahan sel kepada 50 μM kompaun 4 tidak meningkatkan bilangan nukleus apoptosis berbanding rawatan kawalan.

2.4. Analisis Sitometri Aliran Sel Apoptosis

Ujian pewarnaan dua annexin V-FITC/PI mengenal pasti sel apoptosis melalui pengikatan afiniti tinggi annexin V-FITC kepada fosfatidilserin, yang dieksternalisasikan dalam sel yang menjalani apoptosis [7]. Dalam ujian ini, sel yang berdaya maju tidak mengikat sama ada annexin V atau PI dan oleh itu tidak diwarnakan (kuadran kiri bawah), sel apoptosis awal diwarnakan hijau dengan pengikatan annexin V-FITC (kuadran kanan bawah), dan sel apoptosis lewat. diwarnakan hijau dan merah oleh pengikatan annexin V-FITC kepada fosfatidilserin dan PI kepada sel nekrotik, masing-masing (kuadran kanan atas). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4B, sel yang diinkubasi dengan 50 μM sebatian 1, 2, atau 3 selama 48 jam, peratusan sel apoptosis meningkat daripada 3.74% (sel kawalan) kepada 10.32%, 12.95%, dan 11.30%, masing-masing. Berbanding dengan sel kawalan, kompaun 4 tidak meningkatkan peratusan sel EA.hy926 apoptosis.

Selaras dengan keputusan yang diperoleh dengan ujian CCK-8 dan pewarnaan Hoechst 33342, ujian sitometri aliran menunjukkan bahawa sebatian 1, 2, dan 3 mendorong apoptosis dalam sel EA.hy926. Secara keseluruhannya, pemerhatian ini mencadangkan bahawa peningkatan daya maju sel EA.hy926 yang diperhatikan dengan ujian MTT selepas rawatan dengan sebatian 1–3 mewakili keputusan positif palsu.

TUBULOSA CISTANCHE SEMULAJADI UNTUK MENINGKATKAN IMUNITI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Perbincangan

Pada tahun 1983, Mosmann membangunkan ujian mikroplat MTT kolorimetrik untuk mengukur percambahan sel dan sitotoksisiti [8]. Ujian mudah ini, dan pengubahsuaiannya, kini digunakan secara meluas dalam makmal biologi sel di seluruh dunia. Kajian pecahan dalam sel mamalia menunjukkan bahawa kofaktor nukleotida piridin yang dikurangkan, NADH, bertanggungjawab untuk kebanyakan pengurangan MTT. Ini disokong oleh kajian menggunakan seluruh sel [9]. Oleh itu pengurangan MTT dikaitkan dengan sel yang aktif secara metabolik dan bukan sahaja digabungkan dengan respirasi mitokondria tetapi juga dengan sitoplasma dan membran bukan mitokondria termasuk petak endosom/lisosom dan membran plasma [10]. Caj positif bersih pada molekul MTT adalah faktor utama untuk pengambilan selularnya melalui potensi membran plasma.

Terutama sekali, ujian MTT mungkin kadangkala tidak menggambarkan dengan tepat kesan sebenar sebatian yang diuji pada sel tertentu. Walau bagaimanapun, struktur atau kumpulan kimia yang mungkin menyebabkan keputusan bercanggah dalam ujian MTT belum dikenal pasti. Kajian terbaru telah menunjukkan bahawa ujian MTT boleh memandang rendah kesan antiproliferatif (-)-epigallocatechin-3-gallate, polifenol yang paling banyak dalam teh hijau [11]. Dalam kajian menggunakan ujian MTT untuk mengesan kemosensitiviti tumor, agen kemoterapi anti-kanser, seperti epirubicin, paclitaxel, docetaxel, dan imatinib mesylate (Gleevec), menunjukkan peningkatan daya maju sel [12,13]. Selain itu, beberapa kajian telah melaporkan bahawa ekstrak tumbuhan tertentu dan polifenol aktif redoks boleh mengganggu ujian MTT kerana ia secara langsung mengurangkan garam tetrazolium MTT tanpa ketiadaan sel [14].

Keperluan untuk melarutkan kristal formazan MTT sebelum analisis spektrofotometri dalam pembaca plat mikro dan sifat titik akhir tindak balas yang wujud mengehadkan penggunaan ujian MTT kepada aplikasi tertentu. Ini membawa kepada pembangunan analog tetrazolium di mana bahagian fenil dihiasi dengan kumpulan sulfonat bercas negatif, seperti 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), garam dalam bercas negatif [15] dan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), garam dalaman berasid lemah yang berkait rapat dengan MTT [16] . Pengubahsuaian ini menghasilkan penghasilan produk formazan larut sederhana kultur yang menghapuskan keperluan langkah pelarutan sebelum kuantiti. Sejajar dengan itu, apabila cas negatif yang meningkat pada molekul ini mengurangkan keupayaan mereka untuk bergerak merentasi membran sel [17], penerima elektron perantaraan (IEA), seperti 1-methoxy-5-methyl phenazine methyl sulfate ({{25} }}methoxy PMS) diperlukan untuk memudahkan pengurangan pewarna tetrazol atau untuk meningkatkan kadar pengurangan.

Baru-baru ini, generasi baharu garam tetrazolium larut air telah dibangunkan yang mana WST-1 ialah prototaip [18]. WST-1, garam dalaman disulfonasi bercas negatif yang mengandungi sisa iodin, adalah lebih stabil daripada XTT dan MTS dengan adanya 1-methoxy PMS, ia adalah wajib IEA. Ini membawa kepada pemasaran WST-1/1-methoxy PMS sebagai kit pembiakan sel reagen tunggal yang mudah. Beberapa garam tetrazolium lain dalam siri WST telah dibangunkan, yang paling berguna mungkin ialah WST-8 [19]. WST-8 nampaknya mempunyai sifat pengurangan selular yang sangat serupa dengan WST-1 dan sedang dipasarkan secara bebas sebagai ujian-8 CCK. WST-8 adalah tidak telap sel dan oleh itu dikurangkan secara ekstraselular, melalui pengangkutan elektron daripada NADH intraselular ke WST-8 merentasi membran plasma yang dimediasi oleh 1-metoksi PMS. Walaupun kedua-dua MTT dan WST-8/1-pengurangan PMS metoksi didorong oleh NADH intraselular, sumber NADH nampaknya berbeza dalam kedua-dua kaedah ini. WST-8/1-pengurangan PMS metoksi lebih bergantung pada ulang-alik malat/aspartat yang menghubungkan kitaran asid trikarboksilik mitokondria-NADH dengan ruang ekstramitokondrial [20].

Dalam eksperimen awal, kami mengesahkan bahawa sebatian 1, 2, 3, dan 4 tidak dapat mengurangkan garam tetrazolium MTT secara langsung (tidak ditunjukkan). Dalam kajian ini, pengaruh langsung sebatian itu sendiri dengan reagen telah dihapuskan dengan mencuci plat mikro dengan berhati-hati dengan garam penimbal fosfat (PBS) sebelum larutan MTT atau CCK-8 ditambah, seperti yang ditunjukkan dalam protokol pengeluar. Namun begitu, keputusan yang diperoleh menggunakan kedua-dua kaedah tersebut masih bercanggah (Rajah 2). Seperti yang dijangkakan, pengeraman sel dengan sebatian 1, 2, dan 3 meningkatkan pengurangan garam tetrazolium menjadi formazan ungu, berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 3), menunjukkan bahawa pengurangan garam tetrazolium semata-mata dengan kehadiran sebatian tertentu. tidak mencukupi untuk menilai keupayaan kompaun untuk mengganggu ujian MTT.

Untuk menentukan sama ada sebatian 1, 2, 3, dan 4 boleh mendorong apoptosis dalam sel EA.hy926, perubahan morfologi selular dan eksternalisasi fosfatidilserin dinilai. Selaras dengan penurunan daya maju selular yang diperhatikan dengan ujian CCK-8, keputusan pewarnaan Hoechst dan analisis sitometri aliran menggunakan annexin V-FITC/PI mencadangkan bahawa perencatan pertumbuhan yang diperhatikan selepas rawatan kompaun 1, 2, dan 3 adalah disebabkan, sekurang-kurangnya sebahagiannya, kepada apoptosis sel EA.hy926. Keputusan kami juga menyokong idea bahawa kumpulan caffeyl yang terdapat dalam kedua-dua sebatian 1 dan 2 bertanggungjawab untuk keputusan bercanggah yang diperoleh dengan ujian MTT.

Sama seperti penemuan kami, Rottlerin, pembuka saluran kalium konduktans besar yang kuat, tidak menunjukkan kereaktifan terhadap MTT secara in vitro. Walau bagaimanapun, ia sangat meningkatkan pembentukan kristal formazan di dalam sel, hasil yang jelas bertentangan dengan perencatan Rottlerin NF-κB dan percambahan sel yang diperhatikan oleh analisis penggabungan [3 H]-thymidine ke dalam DNA [21]. Mekanisme di mana Rottlerin meningkatkan pengurangan MTT dikaitkan dengan kesan pembongkaran mitokondrianya [22]. Rottlerin mempunyai kumpulan pengganti asid cinnamoyl. Berbanding dengan asid cinnamoyl, sebatian 3 mempunyai dua sisa hidroksil tambahan, yang terletak di C-3 dan C-4. Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa mekanisme di mana sebatian 1 dan 2 menyebabkan keputusan yang bercanggah dalam ujian MTT mungkin juga dikaitkan dengan kesan pemisahan mitokondria mereka. Untuk menguji hipotesis ini, kajian perbandingan antara sebatian 1, dan 2, dan penyingkiran bahan kimia, seperti trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP), diperlukan.

 NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Bahagian Eksperimen

3.1. Reagen dan Bahan Kimia

Kompaun 3 (asid kafein–serbuk, ketulenan=98.6%) telah dibeli daripada Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). Kompaun 4 (3,4-minyak dihydroxylphenylethanol, ketulenan=98.5%) diperoleh daripada Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China). MTT dan dimetil sulfoksida (DMSO) diperoleh daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Ujian CCK{11}} telah dibeli daripada Dojin Laboratories (Kumamoto, Jepun). Kit pengesanan apoptosis Hoechst 33342 dan annexin V-FITC/PI telah dibeli dari Institut Bioteknologi Beyotime (Haimen, China).

3.2. Bahan Tumbuhan

C. tubulosabatang dikumpulkan dari Wilayah Yutian, Wilayah Autonomi Uygur Xinjiang, China. Spesimen baucar telah disimpan di Makmal Utama Perubatan Altitud Tinggi, Universiti Perubatan Tentera Ketiga (Chongqing, China) dan disahkan oleh Yi Zhang dari Universiti Perubatan Tradisional Cina Chengdu (Chengdu, China).

3.3. Pengekstrakan dan Pengasingan Bahan Tumbuhan

Batang C. tubulosa (0.6 kg) yang dikeringkan di udara telah diserbukkan dan diekstrak dengan 50% etanol selama 2 jam pada 70 darjah . Selepas penyingkiran pelarut di bawah tekanan yang dikurangkan, ekstrak etanol (212.5 g) telah dibubarkan dan terampai dalam air (2 L) dan diekstrak dengan n-butanol (2 L × 3). Ekstrak n-butanol (110 g) dikromatografi pada lajur poliamida dan dicairkan dengan etanol/air (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) menghasilkan lima pecahan (A–E) . Pecahan B (65 g) telah dipecahkan pada lajur ODS; elusi dengan etanol: air (1:9) sebatian diasingkan 1 (3 g). Pecahan D (10.5 g) dipecahkan pada lajur ODS; elusi dengan etanol/air (1:4) sebatian diasingkan 2 (1 g).

Spektrum NMR telah direkodkan pada spektrometer Bruker Avance 600 dalam CD3OD dengan Tetramethylsilane (TMS) sebagai standard dalaman. Spektrum jisim telah dijalankan pada spektrometer jisim BioTOF-Q.

3.4. Kultur sel

Talian sel EA.hy926 diperoleh daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika (Manassas, VA, Amerika Syarikat). Sel telah dikultur dalam medium RPMI 1640, ditambah dengan 10% (v/v) serum lembu janin dan 1% (v/v) penisilin-streptomisin dalam persekitaran yang lembap dengan 5% CO2 pada 37 darjah .

3.5. Daya Tahan Sel

Daya maju sel telah dinilai menggunakan ujian MTT dan CCK{{0}}. Sebatian 1 dan 2, dan aglikonnya, asid kafeik (3) dan 3,4-dihydroxylphenylethanol (4) telah dilarutkan dalam DMSO kepada kepekatan akhir DMSO < 0.1% (v/v) dalam media kultur.

Sel EA.hy926 telah disemai pada 96-plat perigi pada 4 × 103 sel/telaga. Selepas pengeraman selama 24 jam, sel dirawat dengan kompaun 6.25-50 μM 1, 2, 3, atau 4 selama 24 jam. Medium kultur dikeluarkan dan sel dibasuh dua kali dengan garam penampan fosfat (PBS). Aliquots (10 μL) larutan MTT stok (5 mg·mL−1 ) telah ditambah kepada setiap perigi yang mengandungi 100 μL medium dan diinkubasi dengan sel selama 4 jam. Selepas pengeraman, medium telah dikeluarkan dan 150 μL aliquot DMSO telah ditambah kepada setiap telaga untuk melarutkan kristal formazan. Penyerapan diukur pada 490 nm menggunakan pembaca plat mikro (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Daya maju sel dinyatakan sebagai peratusan pengurangan MTT, memberikan nilai 100% kepada penyerapan sel kawalan. Semua eksperimen dilakukan tiga kali dan dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD).

Ujian CCK-8 dilakukan mengikut literatur dengan sedikit pengubahsuaian [23]. Secara khusus, sel telah dirawat dengan sebatian 6.25–50 μM 1, 2, 3, atau 4 selama 24 jam dan dibasuh dua kali dengan PBS sebelum penambahan larutan 10 μL CCK-8 dan 100 μL media kultur. Selepas mengeram plat mikro pada 37 darjah selama 2 jam, penyerapan diukur pada 450 nm menggunakan pembaca plat mikro. Daya maju sel dinyatakan sebagai peratusan sel berdaya maju berbanding sel kawalan (100%). Semua eksperimen telah dijalankan tiga kali dan dinyatakan sebagai min ± SD.

3.6. Penilaian Apoptosis oleh Hoechst 33342 Pewarnaan

Perubahan morfologi apoptosis diperhatikan dengan pewarnaan Hoechst 33342. Secara ringkas, sel EA.hy926 telah disemai pada 48-plat perigi (2 × 104 sel/telaga) dan dirawat dengan 50 μM sebatian 1, 2, 3, atau 4 selama 48 jam pada 37 darjah, dibasuh dua kali dengan PBS, dan tetap dengan 4% (v/v) paraformaldehid selama 15 minit pada suhu bilik. Selepas membilas dua kali dengan PBS, sel telah diwarnai dengan Hoechst 33342 (10 ug·mL−1 ) selama 5 minit pada suhu bilik dan dibasuh dua kali dengan PBS. Nukleus bernoda Hoechst divisualisasikan menggunakan mikroskop pendarfluor (Olympus, Tokyo, Jepun).

3.7. Analisis Apoptosis oleh Sitometri Aliran

Sel apoptosis dikesan oleh annexin V-FITC/PI double-staining dan analisis sitometri aliran. Secara ringkas, selepas rawatan dengan 50 μM sebatian 1, 2, 3, atau 4 selama 48 jam, sel dituai dan digantung semula dalam PBS pada 1 × 105 sel·mL−1. Selepas sentrifugasi pada 500× g selama 5 minit pada 25 darjah, 195 μL penimbal pengikat annexin V-FITC dan 5 μL annexin V-FITC telah ditambah. Selepas pencampuran vorteks lembut, campuran itu diinkubasi selama 10 minit pada suhu bilik dalam gelap. Selepas sentrifugasi pada 500× g selama 5 minit pada 25 darjah, 190 μL penimbal pengikat annexin V terkonjugasi FITC dan 10 μL PI telah ditambah. Selepas pencampuran vorteks lembut, sampel dianalisis menggunakan FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, Amerika Syarikat) dalam masa 30 minit.

3.8. Analisis statistik

Semua data eksperimen dinyatakan sebagai min ± SD. Kepentingan perbezaan antara sampel eksperimen dan kawalan yang sepadan dinilai dengan analisis varians sehala (ANOVA) menggunakan perisian SPSS (versi 11.5). Kepentingan statistik telah ditetapkan pada p < 0.05.

4. Kesimpulan

Keputusan kami menunjukkan bahawa anggaran berlebihan bilangan sel berdaya maju yang diperhatikan dalam ujian MTT boleh menutupi sitotoksisiti sebatian tertentu. Oleh itu, semasa proses saringan ubat, kami mengesyorkan menggunakan pelbagai kaedah untuk menentukan kesan sebatian khusus pada daya maju sel (seperti CCK-8 dan 3 ujian H-TdR) untuk mengelakkan menjana keputusan yang mengelirukan.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENGGALAKKAN REMBAHAN TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%