Analisis Omik Integratif Membongkar Laluan Berkaitan Keradangan Mikrovaskular dalam Biopsi Allograft Buah Pinggang
Mar 24, 2022
Dalam pemindahan organ pepejal, mikroRNA (miRNA) telah muncul sebagai pemain utama dalam pengawalseliaan fungsi sel allograf sebagai tindak balas kepada kecederaan. Untuk mendapatkan gambaran tentang peranan miRNA dalam penolakan pengantara antibodi, fenotip penolakan yang ditakrifkan secara histologi oleh keradangan mikrovaskular,buah pinggang biopsi allograft tertakluk kepada miRNA tetapi juga pemprofilan RNA messenger (mRNA). Menggunakan proses pemilihan pelbagai langkah unik khusus untuk kajian BIOMARGIN (kohort penemuan, N=86; kohort pemilihan, N=99; kohort pengesahan, N=298), enam miRNA yang dinyatakan secara berbeza telah dikenal pasti secara konsisten:miR-139-5p (turun) dan miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (atas). Tahap ekspresi mereka secara beransur-ansur dikaitkan dengan keamatan keradangan mikrovaskular. Kekhususan sel gen sasaran miRNA telah disiasat dengan mengintegrasikan sasaran mRNA in vivo mereka dengan penjujukan RNA sel tunggal daripada kohort biopsi allograf bebas. Ekspresi miR{11}}p terbitan endothelial berkorelasi negatif dengan ekspresi gen berkaitan MHC. Sebaliknya, ekspresi berlebihan miR{14}}p yang berasal dari epitelium sangat dikaitkan dengan homeostasis elektrolit renal yang terdegradasi dan laluan berkaitan imun yang ditindas. Dalam sel imun, miR{16}}p mengawal pengaktifan NF-kB dalam limfosit T manakala miR{18}}p mengawal penyambungan mRNA dalam sel pembentangan antigen. Secara keseluruhannya, omik bersepadu membolehkan kami membongkar laluan baru yang terlibat dalam keradangan mikrovaskular dan mencadangkan bahawa pengubahsuaian metabolisme dalam sel epitelium tiub berlaku akibat penolakan pengantara antibodi, di luar petak endothelial berdekatan.
Kata kunci:pemindahan buah pinggang, mikroRNA, multi-omik, keradangan mikrovaskular, penolakan pengantaraan antibodi
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
PENGENALANDalampemindahan buah pinggang(KT), kecederaan alloimun biasanya dikotomi kepada dua jenis penolakan allograf mengikut taburan spatial penyusupan imun dan maklumat mengenai kehadiran atau ketiadaan antibodi anti-HLA khusus penderma. Diagnosis bergantung pada biopsi allograf dengan penggredan lesi histologi mengikut klasifikasi Konsensus Antarabangsa Banff(1). Tubulitis (lesi "t") dan keradangan interstisial (lesi "I") adalah ciri histologi ciri penolakan pengantaraan sel T (TCMR) dan berkaitan dengan sitotoksisiti langsung ke petak tubulointerstitial. Penolakan pengantaraan antibodi (ABMR) paling kerap dikaitkan dengan antibodi anti-HLA yang beredar dengan keradangan yang menyasarkan petak mikrovaskular. Lesi histologi ABMR yang aktif termasuk kehadiran sel mononuklear dalam kapilari glomerular ("g"lesi) dan dalam kapilari peritubular ("ptc" lesi), yang digabungkan dirujuk sebagai "keradangan mikrovaskular"(MVI). Dalam ABMR aktif kronik, kecederaan tisu kronik seperti glomerulopati pemindahan atau fibrosis intima arteri menambah kepada lesi akut ini(1). Menggunakan agen imunosupresif sasaran sel T' semasa, TCMR dianggap mempunyai kesan prognostik yang terhad, manakala ABMR adalah punca utama kegagalan rasuah, yang berkaitan dengan kekurangan pendekatan terapeutik yang berkesan (2).
Untuk mencari terapi yang lebih baik untuk MVI dan ABMR, pemahaman yang lebih baik dalam mekanisme biologi yang mendasari proses kecederaan ini diperlukan. Teknologi omik pemprosesan tinggi nampaknya sesuai untuk tujuan tersebut kerana ia membenarkan penyaringan yang tepat dan serentak terhadap ribuan gen, protein dan metabolit(3). Soal siasat transkrip keseluruhan bagibuah pinggangbiopsi allograft telah menunjukkan perubahan ekspresi gen mRNA yang mendalam dalam sel pemastautin yang cedera atau dalam populasi sel yang menyusup semasa ABMR(4). Sementara itu, microRNAs (miRNAs) telah muncul sebagai pemain utama dalam metabolisme sel, dengan mengawal selia RNA messenger (mRNA) pada peringkat posttranscriptional. Malah, miRNA merevolusikan pemahaman kita tentang penyempurnaan proses fisiologi badan yang terlibat dalam percambahan, apoptosis, pembezaan dan perkembangan(5). Tidak menghairankan, ekspresi miRNA yang tidak terkawal mengakibatkan perkembangan banyak patologi termasukpenyakit buah pinggang(6). Oleh kerana profil ekspresi miRNA berbeza antara keadaan berpenyakit dan sihat, banyak kajian telah menganalisis miRNA sama ada secara bersendirian atau digabungkan dengan penanda lain yang lebih tradisional, bukan sahaja untuk mendiagnosis penyakit dan meramalkan perkembangan penyakit tetapi juga untuk mereka bentuk aplikasi terapeutik yang berpotensi (7).
Dalam konteks pemindahan organ pepejal, miRNA mungkin terlibat dalam penolakan melalui peranan mereka dalam pengawalseliaan fungsi sel imun dan dalam tindak balas sel pemastautin allograft kepada kecederaan (6, 8). Beberapa kajian telah menyiasat miRNA allograf sebagai biomarker dan/atau pengesan dalam tetapan TCMR (8,9), tetapi tidak ada yang setakat ini memfokuskan pada MVI dan ABMR. Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk mengintegrasikan tahap omik yang berbeza daripadabuah pinggangbiopsi allograf, untuk mendapatkan gambaran tentang peranan miRNA dalam fenotip penolakan yang merosakkan ini.
BAHAN DAN KAEDAH Reka Bentuk KajianKajian ini adalah sebahagian daripada 7-BIOMArkers yang dibiayai oleh FPbuah pinggangProgram penyelidikan Kecederaan Graft (BIOMARGIN, https://cordis.europa. eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, nombor NCT02832661), diketuai oleh konsortium penyelidikan Eropah untuk mencari penanda bio lesi imun allograf dipemindahan buah pinggangpenerima, dengan nilai diagnostik dan/atau prognostik. BIOMARGIN ialah kajian berbilang pusat, prospektif, berbilang fasa, dilakukan pada empatpemindahan buah pinggangpusat di Eropah (Hospital Necker, Paris, Perancis; Hospital Universiti, Leuven, Belgium; Sekolah Perubatan Hannover, Hannover, Jerman; dan Hospital Universiti, Limoges, Perancis). Sampel dikumpulkan secara prospektif pada masa pemeriksaan dan biopsi petunjuk antara April 2013 dan Jun 2015 (Rajah IA). Semua pemindahan dilakukan dengan padanan silang sitotoksisiti bergantung pelengkap negatif. Di empat pusat klinikal ini, biopsi protokol dilakukan pada 3,12, dan kadangkala pada 24 bulan selepas pemindahan, mengikut amalan pusat tempatan, sebagai tambahan kepada biopsi petunjuk. Lembaga semakan institusi di setiap tapak meluluskan kajian, dan semua pesakit memberikan persetujuan bertulis secara bertulis.
Kohort KajianKajian ini dibahagikan kepada tiga fasa (Rajah 1A). Dalam fasa penemuan kawalan kes pertama, sampel biopsi N=88 digunakan untuk analisis ekspresi miRNA global (N=754 miRNA, tidak termasuk potensi menormalkan miRNA) . Kami memilih sampel berdasarkan ketersediaan dan kriteria histologi (tidak termasuk kes dengan diagnosis glomerulonephritis atau nefropati yang berkaitan dengan polyomavirus dan kes dengan diagnosis yang tidak jelas). Berdasarkan bacaan biopsi tempatan, pemilihan pertama dibuat, yang diperhalusi lagi melalui bacaan pusat oleh sekumpulan ahli patologi, bebas daripada pusat asal. Analisis statistik (lihat pemilihan miRNA) digunakan untuk memilih senarai lanjutan miRNA, yang paling berbeza dinyatakan antara fenotip histologi, yang kemudiannya dikira dalam fasa ke-2.
Reka bentuk kajian kawalan kes yang serupa telah digunakan untuk fasa kedua (pemilihan), di mana analisis ekspresi miRNA yang disasarkan (N=143) telah dilakukan pada N=99 sampel biopsi. Saluran paip statistik yang sama digunakan untuk memilih senarai miRNA yang lebih terhad, untuk kemudiannya dikira dalam fasa ke-3. Akhir sekali, dalam kohort ketiga (pengesahan), semua sampel dikumpulkan secara prospektif dan berturut-turut mengikut protokol BIOMARGIN antara 24 Jun 2014 dan 2 Julai 2015, dan dengan mencukupibuah pinggangkualiti biopsi allograf, telah dinilai untuk 38 miRNA yang dipilih sebagai hasil daripada fasa pemilihan kedua. Dalam kohort tetapan kehidupan sebenar ini, tiada pemilihan dibuat berdasarkan histologi, demografi, masa atau sebarang faktor selain ketersediaan sampel dan kriteria kawalan kualiti (kecukupan biopsi dan hasil RNA).
Pemilihan miRNASaluran paip statistik yang mantap telah dibangunkan khusus untuk kajian BIOMARGIN dalam R(Pasukan Teras R(10), versi 1.0.44),sebagai lanjutan pakej R biosignal(1l). Secara ringkas, dalam fasa penemuan, kami menjalankan strategi pemilihan ciri termasuk pendekatan univariate dan multivariate. Untuk pemilihan univariat, kami menggunakan ujian bukan parametrik (ujian Wilcoxon-Mann-Whitney) dan ujian parametrik (ujian-t Pelajar) dan kohort Penemuan (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Skor ramalan setiap transkrip miRNA dalam setiap model multivariate telah disepadukan untuk menghasilkan "skor multivariate". Dengan menggabungkan keputusan analisis univariat dan multivariate ini, kami dapat menentukan kedudukan dan memilih subset calon miRNA untuk menjadi sebahagian daripada senarai lanjutan untuk dikira semasa fasa seterusnya.Untuk analisis posthoc ini memfokuskan pada laluan VMI, ekspresi normal median setiap miRNA dibandingkan antara kes dan kawalan menggunakan ujian Wilcoxon dalam ketiga-tiga kohort. Kami mengawal beberapa ujian menggunakan kaedah kadar penemuan palsu (FDR) Benjamini & Hochberg.
Penilaian KlinikopatologiSkor lesi histologi individu dinilai secara separuh kuantitatif mengikut kriteria Banff 2019(16). Istilah "keradangan mikrovaskular"(MVI) digunakan untuk merujuk kepada mana-mana tahap gabungan glomerulitis (g)dan/atau kapilalitis peritubular (ptc). Semua kes ABMR memenuhi 2 kriteria pertama klasifikasi Banf 2015 atau Banff 2017 (histologik bukti kecederaan tisu akut dan bukti interaksi antibodi semasa/terkini dengan endothelium vaskular), tetapi tidak semua memenuhi kriteria ketiga [bukti serologi antibodi khusus penderma (DSA) dan/atau pewarnaan CAd]. DSA selepas pemindahan ditentukan mengikut amalan pusat tempatan, dengan kepositifan DSA ditakrifkan sebagai antibodi anti-HLA serum khusus penderma yang boleh dikesan dengan nilai purata intensiti pendarfluor (MFI) 500 pada masa biopsi atau bila-bila masa sebelum ini.
Pengekstrakan RNA Daripada Sampel Biopsi untuk Pemprofilan mRNA dan miRNATeras dua jarum diambil pada setiap satubuah pinggangbiopsi allograf. Satu telah digunakan untuk penggredan histologi konvensional dan sekurang-kurangnya separuh daripada yang lain segera disimpan dalam Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Belanda). Tiub Allprotect disimpan pada suhu 4C(minimum 24 jam hingga maksimum 72 jam) , dan kemudian disimpan pada -20 darjah darjah sehingga pengekstrakan RNA. Jumlah RNA telah diasingkan daripadabuah pinggangspesimen biopsi allograf menggunakan Kit Universal Allprep DNA/RNA/miRNA (Qiagen Benelux BV) pada instrumen QIAcube (Qiagen Benelux BV). Kuantiti (penyerapan pada 26{{20}}} nm) dan ketulenan (nisbah penyerapan pada 230,260, dan 280 nm) RNA terpencil diukur menggunakan spektrofotometer NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Ghent, Belgium). Nombor integriti RNA(RIN) telah dinilai dengan Eukaryote nano/pico RNA Kit(Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgium) pada instrumen Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Indeks kawalan kualiti tidak berbeza dengan ketara antara VMI dan No Kumpulan MVI [RIN(min±SD):5.6±1.96vs5.4±1.97,P=0.66;nisbah 260/280 (min±SD):1.87±0.06 lwn 1.87±0.1l,P{{26 }}.40]. Untuk sampel RNA dengan RIN rendah(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI DIALISIS BUAH PINGGANG/PINGGUL
Pemprofilan miRNASpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 dianggap tidak dinyatakan. RNU44 dan RNU48 menunjukkan ekspresi yang konsisten dalam semua sampel min (RNU44 ditambah RNU48) pekali variasi ialah 3.73 peratus dalam Kad Tatasusunan A dan 3.79 peratus dalam Kad Tatasusunan B] dan digunakan sebagai gen pengemasan untuk normalisasi data merentas semua sub-kajian.
Analisis Transkripmik mRNAAnalisis transkriptik dilakukan oleh microarray seperti yang telah diterangkan(17). Secara ringkas, jumlah RNA yang diekstrak daripada sampel biopsi mula-mula dikuatkan dan dibiotinilasi kepada RNA(cRNA) pelengkap menggunakan Kit Reagen GeneChip 39 IVT PLUS (Affymetrix) dan dihibridkan kepada Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Tatasusunan( Affymetrix), yang terdiri daripada 54,675 set siasatan yang meliputi keseluruhan genom. Kami menggunakan penormalan Purata Serpihan Berbilang Teguh (RMA). Ekspresi ternormal median bagi setiap mRNA dibandingkan antara kes dan kawalan menggunakan ujian Wilcoxon. Kami mengawal inflasi alfa risiko akibat pelbagai ujian dengan menggunakan kaedah kadar penemuan palsu (FDR) Benjamini & Hochberg. Data microarray telah dikendalikan mengikut garis panduan Maklumat Minimum Mengenai Eksperimen Microarray.
Dalam Analisis SilicoPerisian Biological Interpretation Of Multiomics EXperiments(BIOMEX) telah digunakan untuk analisis pembezaan data transkriptom, menggunakan anotasi ID Ensembl(18). Analisis Laluan Kepintaran (IPA, Bina: 478438M Versi kandungan: 44691306, Qiagen) dan OMICSnet(19) telah digunakan untuk menentukan set gen yang dikawal oleh miRNA yang dipilih. OMICSnet digunakan untuk melakukan analisis Ontologi Gene dengan pangkalan data laluan Reactome, menggunakan laluan lengkap (20). Pembinaan rangkaian gen tidak diselia sepenuhnya dan bergantung pada bilangan interaksi molekul yang dilaporkan bagi setiap gen dengan semua gen lain dalam rangkaian. Gen yang membentangkan bilangan interaksi tertinggi secara automatik diletakkan di tengah rangkaian, manakala gen dengan bilangan interaksi yang lebih rendah tersebar ke pinggir. Asal selular miRNA terpilih telah disiasat menggunakan projek Fantom5 (21), yang menyediakan analisis topi ekspresi gen dalam sel dan tisu manusia. Untuk analisis ekspresi miRNA, kami mempertimbangkan semuabuah pinggang-sel struktur yang berkaitan dan semua sel hematopoietik yang beredar, tanpa pemilihan selanjutnya.
Analisis Data Penjujukan RNA Sel TunggalData penjujukan RNA sel tunggal manusia (siRNA-seq) yang diterbitkan sebelum ini daripada dua biopsi ABMR dan empat rujukan sihat yang sepadan dengan biopsi pengawasan pemindahan telah digunakan. Kiraan mentah atau matriks yang berkaitan telah dimuat turun masing-masing daripada GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22)danbuah pinggangProjek Perubatan Precision (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Matriks ekspresi gen mentah yang dihasilkan setiap sampel telah digabungkan dan dianalisis menggunakan pakej Seurat V4 (23). Parameter yang digunakan untuk mencipta dan menapis objek Seurat adalah seperti berikut: kemasukan sel yang menyatakan antara 500 dan 10000 gen yang dikesan dan kurang daripada 25 peratus transkrip mitokondria. Selepas penapisan, semua objek telah disepadukan menggunakan aliran kerja penyepaduan SCTransform pada Seurat (24). Secara ringkas, 3000 ciri telah digunakan untuk penyepaduan menggunakan fungsi PrepSCTItegration, dan fungsi FindIntegrationAnchors digunakan untuk mengehadkan kesan kelompok. Set data Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) penuh telah dijana menggunakan fungsi DimPlot dan 16 komponen utama teratas. Kelompok dibina menggunakan fungsi FindNeighbors dan FindClusters dengan resolusi 0.6. Pengenalpastian kluster dilakukan menggunakan fungsi FeaturePlot dengan menilai ekspresi penanda khusus dalam setiap kluster. Plot titik dijana menggunakan fungsi plot DotPlot dan FeaturePlot, dengan kiraan normal dalam ujian RNA sebagai data input.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI JANGKITAN BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Analisis statistikCiri pesakit dan penderma diterangkan mengikut nombor, peratusan dan kekerapan untuk pembolehubah kategori. Kami melaporkan pembolehubah berterusan menggunakan min dan sisihan piawai (SD) jika taburan normal, median dan julat antara kuartil (IQR) untuk pembolehubah dengan taburan condong. Kami membandingkan ciri-ciri mereka menggunakan ujian Fisher atau Wilcoxon apabila sesuai. Kami menggunakan ujian Kruskal-Wallis untuk membandingkan ekspresi miRNA median mengikut keamatan MVI, dan ujian Spearman untuk analisis korelasi. Kami menganggap kepentingan statistik untuk nilai-P kurang daripada 0.05. Kami menggunakan GraphPad Prism(versi 8; GraphPad Software, San Diego, CA) dan RStudio (versi 4.0.3)untuk analisis statistik dan pembentangan data. Pakej R berikut telah digunakan: peta haba3 (peta haba3_1.1.9)untuk analisis peta haba, fmsb(fmsb_0.7.0)dan skala (skala_1.1.1)pakej untuk plot radar, ggplot2 (ggplot2_3.3.5)untuk graf bar dan complot(corrplot_0.90)untuk analisis matriks korelasi.
KEPUTUSAN
Pengenalpastian Berbilang Langkah bagi miRNA Berkaitan MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). 59 pesakit lain (MVI-) membentangkan pelbagai diagnosis yang terdiri daripada penolakan pengantaraan sel T(TCMR, N=8), fibrosis celahan dan atrofi tiub (IFIA,N=20),danbiopsi normal(N{{6 }}), tetapi tiada MVI. Daripada 754 calon miRNA, 18 miRNA dinyatakan secara berbeza antara kumpulan MVI plus dan MVI (Rajah 1B). Dalam kohort pemilihan, senarai terhad 143 miRNA dikira dalam 99 sampel. Dalam kohort pemilihan ini, 14 miRNA dinyatakan secara berbeza antara kes dengan (N=28)dan tanpa (N=71)ABMR(Rajah 1C). Akhir sekali, dalam kohort trans-sectional terbesar, 38 miRNA dikira dalam 298 sampel, di mana 12 miRNA dinyatakan secara berbeza antara ABMR(N=29) vs tiada ABMR (N=269) biopsi (Rajah 1D). ).
Pengenalpastian Konsisten 6 MiRNA Berkaitan MVI dan Kaitan dengan HistologiSeterusnya, kami menyilangkan 3 senarai miRNA yang dinyatakan secara berbeza dan mengenal pasti 6 miRNA yang dikaitkan secara konsisten dengan MVI atau ABMR merentas 3 kohort bebas (Rajah 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p dan miR-223-3p diekspresikan secara berlebihan dalam MVI/ABMR, manakala ekspresi miR-139-5p dikurangkan. Plot radar (Rajah 2B) memaparkan untuk setiap langkah ungkapan perbezaan antara kes dan kawalan 6 miRNA dan menyokong keteguhan profil miRNA merentas tiga kohort bebas. Seterusnya, kami mengkaji bagaimana ekspresi 6 miRNA dikaitkan dengan lesi histologi individu merentas semua 483 biopsi allograf yang diambil bersama. Ekspresi 5 miRNA terkawal meningkat secara beransur-ansur dengan keamatan lesi MVI, manakala ungkapan miR-139-5p berkorelasi negatif (Rajah 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p bukan sahaja sangat dikaitkan dengan ciri berkaitan ABMR (g, ptc, pemendapan C4d), tetapi juga dengan lesi berkaitan TCMR(i, t ) dan lesi IFTA(ct, ci), mencadangkan penglibatan mereka dalam proses keradangan dan parut yang biasa, bukan ABMR-spesifik. Secara bergantian, beberapa kolineariti intrinsik mungkin secara semula jadi wujud di antara lesi, mengakibatkan ketidakupayaan kita untuk mengenal pasti kekhususan sebenar untuk satu lesi. MiR-222-3p tidak berkait dengan lesi histologi TCMR atau IFTA (Rajah 2D).
Integrasi Multi-Omics: Interplay mRNA-miRNA dalam MVSeterusnya, kami menilai gen yang dinyatakan secara berbeza antara kes MVI plus dan MVI-, dalam set penemuan yang diterbitkan sebelum ini (25). Daripada 54,675 probe, sejumlah 2755 gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) telah dikenal pasti antara MVI plus dan MVI-
kumpulan, yang terdiri daripada 1085 gen yang dikawal ke bawah dan 1670 gen yang dikawal selia (Rajah 3A). MRNA yang paling berbeza dinyatakan dalam sampel MVI ditambah ialah CXCL9 dan CXCL10, selaras dengan laporan sebelumnya (17, 26) bahawa gen ini adalah yang paling diekspresikan dalam ABMR. Seterusnya, kami menggunakan IPA dan OMICSnet untuk mengenal pasti dalam silico gen sasaran putative untuk setiap miRNA. Sejumlah 4504 mRNA diramalkan akan disasarkan oleh sekurang-kurangnya satu daripada 6 miRNA. Kemudian, kami menyepadukan 4504 sasaran yang diramalkan ini dengan DEG dalam biopsi allograf. Analisis miRNA/mRNA bersepadu mengenal pasti 61 DEG yang disasarkan oleh miR{13}}p yang meningkat dengan ketara dalam MVI serta biopsi. Ia juga mengenal pasti 28, 58,52,43 dan 27 DEG menurun dengan ketara dalam MVI ditambah biopsi yang masing-masing disasarkan oleh miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p, dan miR-223-3p (Rajah 3B).
Asal Selular miRNA Berkaitan MVAsal selular enam miRNA dicirikan dalam pelbagaibuah pinggangsubtipe sel dan sel hematopoietik menggunakan atlas miRNA tersedia dalam talian [pangkalan data Fantom (27)]. Pengelompokan tanpa pengawasan didiskriminasibuah pinggangmiRNA yang berasal dari sel daripada miRNA yang berasal dari sel imun (Rajah 4A). Ia juga mendedahkan satu atau dua jenis sel dominan untuk setiap miRNA. MiR-139-5p kelihatan terutamanya diekspresikan oleh sel endothelial glomerular(EC). MiR-222-3p, walaupun ekspresinya tidak dikaitkan dengan keradangan tiub (Banff lesions"t", Rajah 2D), terutamanya berkaitan denganbuah pinggangsel epitelium. Empat miRNA yang tinggal terutamanya dinyatakan dalam sel mononuklear darah periferal (PBMC) atau granulosit, dengan miR-142-3p diperkaya dalam sel NK dan monosit, miR-150-5p dalam CD4 plus dan CD8 plus T sel, miR -155-5p dalam CD19 ditambah sel B dan makrofaj,danmiR-223-3p dalam neutrofil.
Penjujukan RNA Sel Tunggal Mengenalpasti Semua Sel Renal dan Sel Imun yang Menyusup Untuk mencirikan potensi peranan setiap miRNA yang berkaitan dengan MVI, kami menganalisis data sc-RNAseq yang tersedia secara umum daripada duabuah pinggangbiopsi allograf dengan ABMR dan skor MVI tinggi (g2, ptc3)(22). Dataset ini telah disepadukan dengan 4 biopsi rujukan yang sihat tanpa MVI. Selepas kawalan kualiti dan penapisan, 31545 sel telah dikesan dan kluster tanpa pengawasan mendedahkan 12 kluster (Rajah 4B). Kami menggunakan penanda yang mantap (28) untuk mengenal pasti semua subtipe sel pemastautin dan penyusupan utama dan melabelnya (Tambahan Rajah S2). Seterusnya, kami memberi tumpuan kepada populasi sel dari mana enam miRNA kami dianggap berasal. Dalam matlamat ini, kami menyusun sel kepada 4 kelompok utama yang sepadan dengan endothelium, epitelium, limfosit, dan APC (Rajah 4C). Selaras dengan analisis sebelumnya terhadap data ini (22), populasi sel neutrofilik atau NK tidak dikesan dalam dataset sc-RNASeg.
miR-139-5p Mengawal Pengaktifan EC dan Laluan Pembentangan Antigen Semasa MVIMiR-139-5p ialah satu-satunya miRNA yang dikurangkan dalam kajian kami dalam kes dengan MVI/ABMR (Rajah 2A) dan didapati kebanyakannya berasal daripada glomerular EC(Rajah4A). Enam puluh satu daripada gen sasarannya telah disahkan diselaraskan dalam mikroarray pukal daripada kes tambah MVI (Rajah 3B) dan ekspresi mereka disiasat selanjutnya pada resolusi sel tunggal dalam 3 subkluster EC yang dikenal pasti sebelumnya (Rajah 4B, C). Seperti yang digambarkan dalam Rajah 5A, ECcluster yang diaktifkan hanya dapat dikesan dalam sampel MVI plus. Selain itu, separuh daripada 61 gen(N=30) telah meningkat secara konsisten dalam sc-RNAseq MVI ditambah biopsi, tanpa mengira tiga subkluster EC. Antaranya, GBP5 adalah gen yang paling banyak meningkat. Seterusnya, analisis ontologi gen menggunakan 30 transkrip yang berasal dari endothelial ini mengenal pasti UBE2D1 dan YWHAG sebagai pemain pusat dalam rangkaian gen (Rajah 5B). Lebih khusus lagi, laluan berkaitan imun dan laluan pemprosesan dan pembentangan antigen yang dimediasi kompleks histokompatibiliti utama (MHC) telah diperkaya (Rajah 5C). Analisis pseudotime dilakukan untuk mencirikan perubahan ekspresi gen dengan lebih baik dalam perjalanan pengaktifan EC, lintasan keadaan sel-sel (Rajah 5D, E), UBE2D1, YWHAG, dan GBP5 secara berterusan meningkat semasa pengaktifan endothelial berkaitan MVI. Trajektori yang sangat serupa ditemui untuk gen berkaitan MHC HLA-A, -B dan -DRA tetapi juga untuk pengaktifan endothelial bonafide dan penanda keradangan seperti VCAM1, CXCL9, dan CXCL10, menunjukkan bahawa semua gen ini secara serentak dinyatakan semasa pengaktifan endothelial. Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa miR{32}}p dikurangkan semasa lesi MV dan tidak lagi menekan laluan pembentangan antigen MHC dalam EC diaktifkan.
miR-222-3p Menjejaskan Kedua-duanyabuah pinggangLaluan Berkaitan Fisiologi dan Imun dalam Sel Epitelium Semasa MVI Seterusnya, kami menumpukan pada miR-222-3p, miRNA terkawal dalam sampel MVI denganbuah pinggangasal sel epitelium dan korelasi yang lebih eksklusif kepada lesi histologi yang berkaitan dengan ABMR (Rajah 2A, D, 4A). Dalam tisu allograf pukal, ekspresi 43 gen sasarannya telah dikurangkan (Rajah 3B), dan selanjutnya dinilai pada satu- resolusi sel dalam berbezabuah pinggangpopulasi epitelium yang kami kenal pasti sebelum ini (Rajah 4B, C). Penurunan besar-besaran sebanyak 41 daripada 43(95 peratus) gen ini merentas semua yang dikenal pastibuah pinggangKelompok sel epitelium mencadangkan pembungkaman gen
profil dalam VMI (Rajah 6A). Menariknya, 4 gen terlibat dalambuah pingganglaluan fisiologi (ERBB4, ATPIB1, TIMM50, dan KIF3B), tetapi juga gen berkaitan imun (TRAPI dan PEBPI) dikenal pasti sebagai gen pusat dalam rangkaian (Rajah 6B). Ontologi gen 43gen mendedahkan pengayaan dalam laluan isyarat ErbB tetapi juga dalam laluan yang berkaitan dengan imun dan tindak balas sitokin (Rajah 6C) dan ekspresi ERBB4 telah disahkan selanjutnya di semuabuah pinggangsel (Rajah 6D). Secara keseluruhannya, keputusan ini mencadangkan bahawa semasa VMI, tahap tinggi -222-3p inbuah pinggangsel epitelium dikaitkan dengan penindasan kuat gen yang terlibat dalam kedua-duanyabuah pingganglaluan homeostasis elektrolit dan laluan berkaitan imun dalam epitelium.
miR-150-5p Mengawal Pengaktifan NF-kB dalam Limfosit T Semasa MVI Begitu juga, kami menyiasat peranan pengawalseliaan (peningkatan) miR-150-5p semasa MVI dalam gugusan sel T, di mana ia paling dominan dinyatakan (Rajah 4A). Kami merancang 58 penurunan DEG berkaitan MVI yang dikenal pasti dalam sampel biopsi allograf pukal (Rajah 3B) dan kami menghadapinya dengan ekspresi gen dalam kelompok sel T sc-RNAseq (Rajah 7A). Perkadaran gen yang disasarkan oleh miR150-5p dan secara khusus kurang dinyatakan dalam sel-T semasa MVI adalah sangat rendah (15/58,25.9 peratus )menunjukkan bahawa penurunan global gen ini dalam vivo bukan semata-mata disebabkan oleh Petak limfosit T. Namun begitu, daripada senarai 15 gen yang sangat terpilih ini dan menggunakan platform OMICSnet, kami membina rangkaian gen (Rajah 7B) dan melakukan analisis ontologi gen (Rajah 7C). Kami mendapati bahawa ekspresi berlebihan miR-150-5p dikaitkan dengan NF Peraturan -KB dalam limfosit T semasa MVI.
miR-155-5p Mengawal Penyambungan mRNA dalam APC Semasa MV Akhir sekali, strategi yang sama telah digunakan untuk gen sasaran 52miR-155-5p, kurang dinyatakan semasa MVI(Rajah 3B). Berbeza dengan miR-150-5p dalam limfosit T, kami mendapati hampir dua pertiga daripada gen sasaran miR-155-5p telah menurun secara konsisten dalam kelompok APC sc-RNAseq(31/52,59.6 peratus , Rajah 8A). Analisis rangkaian gen mendedahkan bahawa AIFMI dan CIAO1 adalah gen pusat (Rajah 8B). Selain itu, ontologi gen mendedahkan pengayaan yang kuat dalam laluan yang berkaitan dengan splicing mRNA (Rajah 8C).
PERBINCANGANDengan reka bentuknya yang unik, kajian BIOMARGIN ialah rangka kerja tipikal untuk penyepaduan data berbilang omik. Malah, saluran paip yang sangat teguh telah digunakan dalam kedua-dua kohort penemuan, pemilihan dan pengesahan yang merangkumi sejumlah besar pesakit dari pusat pemindahan yang berbeza. Dalam tiga kohort bebas, kami secara serentak memerhati dan mengesahkan profil ekspresi pelik 6 miRNA semasa MVI: miR-139-5p dikurangkan manakala miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p dan miR-223-3p telah meningkat. Yang penting, tahap setiap 6 miRNA ini dikaitkan dengan keterukan MVI, mencadangkan mekanisme peraturan yang bergantung kepada dos. Kami seterusnya menggunakan platform silikon untuk menyiasat setiap asal selular miRNA. Secara mengejutkan, dua kumpulan miRNA yang berbeza diperhatikan: yang pertama diperoleh daripada sel imun yang menyusup dan yang kedua lebih khusus untuk pemastautin.buah pinggangsel. Kemudian, kedua-dua miRNA dan mRNA diukur dalam set penemuan sampel biopsi yang sama, membolehkan analisis bersepadu mRNA/miRNA dinyatakan secara berbeza yang disahkan secara vivo yang dikaitkan dengan MVI. Akhirnya, selepas menerangkan persatuan mRNA / miRNA pada resolusi tisu pukal, kami mengesahkan interaksi mRNA / miRNA pada resolusi sel tunggal untuk empat daripada 6 miRNA yang dikenal pasti.
Menariknya, miR-139-5p ialah satu-satunya miRNA yang berkorelasi negatif dengan lesi MVI. Ia berasal terutamanya dari EC dan telah dilaporkan mengawal gen berkaitan MHC. Di antara gen sasarannya, UBE2D1 sangat dikawal semasa pengaktifan endothelial yang dikaitkan dengan MVI. Keluarga UBE2D ialah keluarga enzim konjugasi ubiquitin E2 dalam sistem ubiquitin-proteasome (29, 30) dan UBeD1 ditunjukkan untuk meningkatkan ubiquitination Mac-I, yang membawa kepada pengawalseliaan protein kelas II MHC (31). Di samping itu, GBP5 ialah EC yang tidak aktif gen yang paling diwakili semasa MVI, yang selaras dengan laporan terbaru kami yang menunjukkan bahawa GBP5 sangat dikawal dalam biopsi ABMR (17) tetapi juga dalam sampel darah (32). Menariknya, ekspresi GBP5 ditunjukkan untuk diinduksi oleh interferon jenis II dalam sel endothelial mikrovaskular rahim manusia, bersama-sama dengan CXCL9 dan CXCL10 (33). Peranan awal kedua-dua kemokin proinflamasi ini dalam proses penolakan akut didokumenkan dengan baik dan tahap mereka dalam air kencing dicadangkan untuk memantau risiko penolakan akut dalam pengawasan rutin penerima pemindahan buah pinggang (34). Satu lagi sasaran miR-139-5p ialah kod YWHAG.YWHAG untuk keluarga protein HLA-F dan telah diterangkan sebagai dinyatakan secara berbeza semasa proses profibrotik aktif dalam nefropati diabetik (35). Kemungkinan peranan miR-139-5p dalam fibrosis, laluan biasa terakhir selepas keradangan, adalah lebih relevan lagi bahawa IFTA baru-baru ini telah dimasukkan ke dalam skor komposit untuk meramalkan kemandirian allograf buah pinggang selepas ABMR(36). Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa miR-139-5p tidak lagi menindas ekspresi antigen MCH pada permukaan Anethum semasa MVI dan akan mengambil bahagian dalam kemoattraction dan proses fibrosis, tetapi mekanisme ini kekal sebagai ekspresi yang disahkan secara eksperimen pada permukaan endothelium semasa MVI dan boleh mengambil bahagian dalam proses chemoattraction dan fifibrosis, tetapi mekanisme ini masih perlu disahkan secara eksperimen.
Yang keduabuah pinggangmiRNA terbitan yang kami kenal pasti ialah miR-222- 3p, yang ekspresinya didapati lebih spesifik bagi lesi MVI: ia dikaitkan dengan skor g dan PTC serta pemendapan C4d, tetapi tidak dengan lesi i atau t. Walau bagaimanapun, ia terutamanya berasal dari sel epitelium. Selepas penyepaduan berbilang omik pada peleraian sel, kami menentukan bahawa miR-222-3p terutamanya menindas isyarat ErbB yang penting untuk fungsi selular asas, seperti percambahan, penghijrahan, pertumbuhan dan pembezaan (37). Dalam biologi manusia, isyarat ErbB fisiologi diperlukan untukbuah pingganghomeostasis elektrolit dan penyelenggaraan integriti buah pinggang (38). Keputusan kami juga mengenal pasti ADAM22, NRG1, ZNF91 sebagai gen berkaitan isyarat ErbB terutamanya ditindas dalam epitelium semasa MVI. Gen lain yang penting untuk fisiologi buah pinggang seperti ATP1B1 dan KIF3B juga telah ditindas dalam epitelium buah pinggang oleh miR-222-3p semasa MVI. Sebelum ini, Baker et al. menunjukkan bahawa ATP1B1 (b1 subunit Na tambah /K tambah -ATPase) memandubuah pinggangpenyerapan semula tiub natrium (39). Di samping itu, Aguado-Fraile et al. telah mengenal pasti Ahli Keluarga Kinesin 3B (KIF3B) terlibat dalam pemerdagangan sel dalam sel tubul proksimal tikus. KIF3B muncul sebagai pengantara utama tindak balas sel tubul epitelium proksimal terhadap iskemia / reperfusi dengan potensi aplikasi dalambuah pinggangpengurusan kerosakan iskemia (40). Oleh itu, kita boleh membuat spekulasi bahawa miR-222-3p menindas laluan fisiologi penting semasa MVI dalam epitelium. Selain itu, laluan berkaitan imun juga dikawal oleh ekspresi berlebihan miR-222-3p: gen penting seperti TRAP1 dan PEBP1 telah dihalang sepenuhnya dalam sampel dengan MVI yang kuat. Menariknya, TRAP1 telah ditunjukkan untuk memperbaikibuah pinggangfifibrosis tubulointerstitial pada tikus dengan halangan ureter unilateral dengan melindungibuah pinggangmitokondria sel epitelium tiub (41). Tambahan pula, PEBP1 memberikan kesan anti-radang melalui perencatan kedua-dua laluan MAPK dan NF-kB di bawah keadaan homeostatik / basal (42). Dalambuah pinggangepitelium, kajian oleh Marko et al. secara elegan menunjukkan bahawa pengaktifan NF-kB selepas iskemik memburukkan kecederaan tiub dan memburukkan lagi keradangan (43). Di tangan kami, PEBP1 telah ditindas sepenuhnya oleh miR-222-3p, menunjukkan bahawa laluan NF kB dilepaskan semasa MVI. Secara keseluruhan, keputusan ini menunjukkan bahawa biologi epitelium terganggu semasa MVI danbuah pinggangsel epitelium secara aktif bertindak balas terhadap kecederaan MVI manakala penglibatan tisu ini dalam MVI jarang ditangani. Penemuan molekul ini mungkin memberi penerangan baharu pada lesi kecederaan tubular akut, kriteria ABMR yang mantap, namun telah lama diabaikan. Selain itu, telah ditunjukkan bahawa sel epitelium boleh merembeskan miR-222-3p eksosomal dan mendorong fenotip M2 dalam makrofaj (44). Dalam pada itu, Li et al. baru-baru ini melaporkan bahawa makrofaj M2 mengekspresikan secara berlebihan miR-155 dan menyampaikan miRNA ini dalam persekitaran mikro, juga melalui rembesan eksosom. Dalam pemindahan buah pinggang, miR-155 telah meningkat dalam pelbagai keadaan (IFTA, penolakan akut dan TCMR) dan dalam cecair badan atau tisu (45). Menariknya, miR- 155 boleh menggalakkan peralihan epitelium-mesenchymal melalui penyasaran RASSF4 dalam sel epitelium (46). Crosstalk berasaskan miRNA ini antara makrofaj danbuah pinggangsel epitelium masih perlu dinilaipemindahan buah pinggangdan lebih khusus lagi dalam konteks MVI. Selaras dengan penemuan ini, kami mendapati bahawa miR-155-5p terutamanya dinyatakan oleh APC yang merangkumi monosit dan makrofaj. Dalam subset khusus ini, ontologi miR- 155-5p-target-gen mendedahkan pengayaan dalam laluan penyambungan premRNA. Menariknya, Janssen et al. melaporkan bahawa keradangan paru-paru menyebabkan laluan splicing pra-mRNA dalam makrofaj alveolar. Selain itu, pengaktifan splicing pra-mRNA berbeza dalam makrofaj pemastautin tisu berbanding makrofaj yang diperolehi oleh (direkrut darah) monosit. Perubahan dalam metabolisme teras dalam makrofaj yang direkrut telah dilaporkan, dengan peningkatan pengeluaran melalui glikolisis dan penurunan pengeluaran melalui kitaran asid trikarboksilik (kitaran TCA, iaitu kitaran Krebs) (47). Mengenai miR-150-5p, kami mendapati bahawa ekspresi berlebihannya semasa MVI dikaitkan dengan laluan NF-kB dalam kelompok limfosit yang merangkumi kedua-dua sel NKT semula jadi dan sel T adaptif. Menariknya, miR-150-5p adalah penting untuk menjana sel NK matang dan berfungsi (48) dan miR{13}}p kekurangan CD8 ditambah sel T dilaporkan kurang sitotoksik (49). Selain itu, sel T CD8 juga boleh merembeskan miR{17}}p dalam eksosom (50) yang seterusnya boleh menggalakkan pengaktifan fibroblas dalam sel epitelium tiub dan seterusnya.buah pinggangfifibrosis seperti yang dicadangkan oleh laporan terkini (51, 52).
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Kajian kami mempunyai beberapa batasan. Kami menumpukan penyelidikan kami pada 6 miRNA, dikenal pasti secara konsisten merentas reka bentuk berbilang langkah kami. Walau bagaimanapun, kami meneruskan pemilihan miRNA langkah demi langkah, dengan hanya sebahagian kecil daripada semua miRNA yang diketahui dikira dalam kohort pengesahan. Laluan statistik untuk pemilihan miRNA bergantung pada reka bentuk awal BIOMARGIN, sesuai untuk mengenal pasti biomarker diagnostik untuk berbilang titik akhir (ABMR, tetapi juga TCMR dan IFTA). Oleh itu, walaupun meningkat dengan ketara dalam kohort penemuan dan pemilihan (Rajah 2A), miR-146a tidak dikira dalam kohort pengesahan. Oleh itu, miR-146a secara de facto dikecualikan daripada proses pemilihan kami, walaupun kesusasteraan mencadangkan peranan dalam iskemia/reperfusi dalam pemindahan buah pinggang (53) dan dalam kawalan pengantaraan Treg terhadap tindak balas alloimun (54). Selain itu, kami tidak boleh mengecualikan bahawa saiz sampel yang lebih berkuasa akan menghasilkan lebih banyak miRNA, seperti miR-138 (turun) dan miR-511 (naik) yang dinyatakan secara berbeza dalam kes ABMR bagi kohort pemilihan dan menunjukkan arah aliran yang sama dalam kohort penemuan. Selain itu, kami tidak melakukan analisis sc-RNAseq pada sampel biopsi kami sendiri tetapi menggunakan dataset sc-RNAseq yang tersedia dalam talian. Pada masa reka bentuk kajian dan pengumpulan sampel biopsi, teknologi scRNAseq sememangnya belum tersedia, dan keperluan untuk sampel yang baru dikumpul tidak membenarkan penggunaan retrospektif sampel beku atau parafin. Begitu juga, pemprofilan mRNA dilakukan menggunakan microarrays, teknologi penanda aras pada masa itu yang kini telah mengatasi prestasi RNA-seq generasi akan datang. Penggunaan dataset sc-RNAseq yang tersedia dalam talian mengehadkan keupayaan kami untuk melaporkan ciri demografi asas pesakit. Maklumat yang hilang ini boleh menimbulkan kebimbangan mengenai perwakilan kumpulan penduduk. Selain itu, kami tidak mengawal sebarang aspek teknikal penjujukan. Oleh itu pada resolusi yang dipilih, analisis sc-RNAseq kami tidak mengesan sebarang kelompok sel neutrofil atau NK dalam sampel ini. Oleh itu, analisis hiliran kami bagi miR-142-3p dan miR-223-3p adalah terhad kepada membina rangkaian gen sasaran dan ontologi masing-masing (Rajah S2 Tambahan) dan tidak membenarkan sebarang penerokaan resolusi sel tunggal. Walau bagaimanapun, rangkaian gen dan ontologi 27 gen sasaran miR-223-3p mendedahkan pengayaan kitaran TCA (Tambahan Rajah S2) bersama dengan isyarat ERBB. Oleh itu, kita boleh membuat spekulasi bahawa kedua-dua miR-155-5p dalam monosit dan miR-223-3p dalam neutrofil memainkan peranan dalam metabolisme dan tindak balas keradangan yang terlibat oleh sel-sel ini semasa MVI. Selain itu, miR-142-3p telah pun terbukti meningkat dalam penolakan allograf buah pinggang (9, 55, 56), tetapi setakat ini tidak dikaitkan secara khusus dengan ABMR. Satu lagi batasan kajian kami ialah perubahan ekspresi gen tertentu dalam sel penyusupan yang jarang berlaku mungkin disembunyikan dalam analisis ekspresi gen pukal. Kajian lanjut termasuk lebih banyak sampel diperlukan untuk membolehkan penyiasatan yang betul terhadap semua, walaupun subtipe sel yang jarang berlaku, tetapi kini dihadkan oleh kos teknik yang agak tinggi.
Sebagai kesimpulan, kami menyiasat di sini laluan molekul yang dikaitkan dengan MVI, kecederaan histologi utama yang berkaitan dengan ABMR. Pendekatan omics bersepadu yang digunakan membolehkan kami membongkar laluan baru yang terlibat dalam MVI dan mencadangkan bahawa pengubahsuaian metabolisme epitelium tiub berlaku akibat ABMR, di luar petak endothelial berdekatan. Kajian kami menggambarkan potensi besar multi-omics untuk membongkar mekanisme penyakit dan membuka jalan kepada penyiasatan baharu untuk menjelaskan lebih lanjut perbincangan silang antarabuah pinggangsubset sel residen dan allograft-infiltrasi.