Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao , Hsin-Wen Huang , Hui-Chi Huang , Hsin-Fan Chao , Shuen-Wen Yu ,Muh-Hwan Su , Chao-Jih Wang dan Hang-Ching Lin

Abstrak

Cistanche tubulosa ekstrak akueus(CTE) telah digunakan sebagai ubat preskripsi botani untuk merawat demensia di China. Kajian terdahulu kami melaporkan bahawa glikosida phenylethanoid CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus) mempunyai aktiviti anti-Alzheimer's disease (AD) dengan menghalang pengagregatan dan pemendapan amiloid peptida (A). Walau bagaimanapun, kajian baru-baru ini menganggap bahawa glikosida phenylethanoid mungkin dimetabolismekan oleh bakteria usus kerana semua keputusan analisis menunjukkan bahawa bioavailabiliti glikosida phenylethanoid adalah sangat rendah. Dalam kajian ini, kami menunjukkan bagaimana pengkelat besi memainkan peranan penting dalam pengagregatan A dan mekanisme perencatan pemendapanglikosida fenilethanoiddaripada CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus). Di samping itu, kami seterusnya membuktikan glikosida phenylethanoid (1-3) boleh sampai ke otak. CTE aktif(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pengesahan komponen dan mekanisme tindakan akan menjadi bantuan yang besar untuk kawalan kualiti produk dan kajian bioavailabiliti pada masa hadapan. Pada masa yang sama, kami menyediakan kaedah analisis baharu yang berguna dalam menentukan glikosida phenylethanoid (1–3) dalam tumbuhan, makanan, darah dan tisu untuk penyelidikan cap jari kimia dan farmakokinetik.

Kata kunci: Cistanche tubulosa; glikosida fenilethanoid; Penyakit Alzheimer; kelat besi

Cistanche tubulosa

1. Pengenalan

Demensia adalah salah satu penyakit penuaan kronik yang paling biasa. Pada tahun 2015 Laporan Alzheimer Dunia menganggarkan bahawa kira-kira 46.8 juta orang mengalami demensia, dan jumlahnya dijangka menjadi 74.7 juta pada tahun 2030 dan 131.5 juta pada tahun 2050 [1]. Populasi demensia global akan meningkat dari tahun ke tahun dan menjadi tidak terkawal pada masa hadapan. Perbelanjaan penjagaan kesihatan global untuk merawat demensia adalah hampir 604 bilion dolar AS pada tahun 2010 dan jumlahnya dijangka menjadi 1000 bilion pada tahun 2030 [2]. Pesakit demensia mempunyai risiko kematian akibat kemalangan yang lebih besar [3] dan oleh itu memerlukan lebih banyak rawatan perubatan. Ini adalah beban berat bagi penjaga keluarga pesakit demensia. Kesan demensia terhadap penjaga, keluarga dan masyarakat boleh menghasilkan tekanan fizikal, psikologi, kehidupan dan ekonomi yang hebat. Terdapat dua bentuk utama demensia, penyakit Alzheimer (AD) dan demensia vaskular [4,5]. AD adalah demensia yang paling biasa dan merupakan gangguan neurodegeneratif yang tidak dapat dipulihkan dan progresif [4-6]. AD adalah penyebab utama kematian keenam di Amerika Syarikat pada tahun 2015 [6].

Kajian terkini menyokong bahawa ketoksikan neuron yang disebabkan oleh pengagregatan peptida amiloid (A ) (plak) dan protein tau (kusut) berkait rapat dengan patogenesis AD. Pengumpulan A dan protein tau dalam otak boleh menyebabkan kerosakan neuron dan kehilangan ingatan [7]. Oligomer A tidak larut berkumpul dalam plak ekstraselular dan dilaporkan membawa kepada disfungsi sinaptik, ketoksikan neuron, dan kematian sel [8]. Malangnya, tiada rawatan berkesan yang tersedia setakat ini untuk membersihkan A dan protein tau, atau menghalang pembentukan atau oligomerisasi A, dan menggantung atau menyembuhkan kerosakan neuron yang tidak dapat dipulihkan. Ejen terapeutik semasa, seperti galantamine dan donepezil, yang merupakan perencat acetylcholinesterase, hanya boleh memperbaiki kehilangan ingatan buat sementara waktu dengan meningkatkan tahap neurotransmitter. Pada tahun 2012, tiada ubat calon dapat mengurangkan kesan A dalam kajian klinikal pesakit AD yang besar [9]. Oleh itu, penyelidikan untuk rawatan baru untuk menyekat kelaziman penyakit Alzheimer sangat diperlukan. Ion logam baru-baru ini dianggap sebagai faktor utama yang berkait rapat dengan pengagregatan A [10]. Chelator logam yang dianggap sebagai sebatian plumbum berpotensi menyediakan strategi baru untuk pendekatan anti-AD [9,11-15].

Batang kering Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, dituai secara meluas di gurun Xinjiang, China. Ia adalah ubat tradisional Cina yang penting yang tergolong dalam ubat Cina tonik yang diindeks dalam Pharmacopeia China dan digunakan selama beribu-ribu tahun untuk rawatan kelemahan fizikal, kekurangan buah pinggang, ketidaksuburan, pelupa, mati pucuk, dan sembelit nyanyuk [16,17].Ekstrak akueus cistanche tubulosaKapsul (CTE) telah diluluskan sebagai ubat botani untuk demensia vaskular di China. Menurut percubaan klinikal 18 pesakit yang didiagnosis dengan AD ringan hingga sederhana, CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)kapsul memberikan pesakit keadaan ingatan yang lebih stabil berbanding dengan perencat acetylcholinesterase [18]. Dalam kajian terdahulu kami, CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)menurunkan pemendapan peptida Amyloid (A) dan kehilangan ingatan yang lebih baik dalam tikus seperti penyakit Alzheimer [19]. Phenylethanoid glycosides, echinacoside (1), acteoside (2), dan iso-acteoside (3) dianggap sebagai komponen utama CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)[20]. Kompaun 1 mempunyai aktiviti neuroprotektif terhadap ketoksikan 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) [21], 1-metil -4-ion phenyl pyridinium (MPP plus ) [22] dan 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) [23]. Laporan kami sebelum ini menunjukkan bahawa 1 menindas oligomerisasi dan ketoksikan A dalam kajian in vitro, dan menghalang pemendapan A, meningkatkan daya ingatan terjejas dan disfungsi kognitif dalam tikus yang disebabkan oleh A [24]. Sebatian 2 dan 3 meningkatkan degradasi A dan menurunkan oligomerisasi A secara in vitro [25]. Kompaun 3 menurunkan pemendapan A dalam tikus teraruh A [25]. Berdasarkan kajian ini, C. tubulosa telah pun membuktikan ia berpotensi untuk merawat AD. CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)berkait rapat dengan pengagregatan dan pemendapan anti-A [24,25]. Untuk lebih memahami CTE dengan lebih jelas(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)mekanisme, kita perlu mempunyai kaedah yang mudah dan cekap untuk mengenal pasti komponen aktif, serta kandungan dalam sampel tisu otak. Kebanyakan kajian telah direka untuk penentuan kuantitatif echinacoside, acteoside, dan iso-acteoside dalam herba atau makanan oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) [26-28], tetapi hanya dua kajian adalah untuk penentuan dalam serum atau tisu [29, 30]. Walau bagaimanapun, tiada laporan mengenai analisis serentak 1-3 dalam tisu otak selepas CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pentadbiran lisan. Di samping itu, masih tidak jelas daripada kajian terkini sama ada CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)komponen aktif atau metabolitnya berjaya melepasi penghalang darah-otak dan bertindak ke atas neuron otak. Oleh itu, penyelidikan ini menyediakan kaedah lanjutan dan sensitif dengan bukti yang meyakinkan yang jelas menggambarkan mekanisme asas CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)terhadap A pengagregatan dan pemendapan.

Cistanche tubulosa ekstrak akueus

2. Keputusan

2.1. Pengasingan dan Pengenalpastian Tiga Sebatian Utama (1–3)

Batang kering C. tubulosa diekstrak dengan 75 peratus EtOH pada suhu bilik. Ekstrak EtOH 75 peratus yang terkondensasi telah dikenakan resin dan kromatografi lajur C18 untuk memberikan tiga sebatian utama, echinacoside (1), acteoside (2), dan iso-acteoside (3). Struktur mereka telah dijelaskan dengan analisis spektroskopi NMR (Resonans Magnetik Nuklear) dan ESI-MS (jisim pengionan Electrospray) dan dengan perbandingan dengan data literatur [31-33] (Rajah 1, Rajah Bahan Tambahan S3-S11).

2.2. Ujian Kandungan Phenylethanoid Glycosides (1–3) daripada CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)

Kaedah ujian telah disahkan untuk analisis glikosida phenylethanoid. Sebatian 1–3 (5.0 mg)ditimbang dengan tepat dan dicampur dengan 50 peratus metanol (40 mL). Campuran telah disonikasi selama 5 minit. Tiga larutan piawai phenylethanoid glikosida (1–3) dicampur sebagai larutan stok piawai (100 µg/mL). Penyelesaian stok piawai telah digunakan untuk menyediakan lima kepekatan berbeza (5,10, 25, 50, dan 100 µg/mL) larutan yang ditunjukkan, masing-masing, dengan mencairkan dengan isipadu bersiri 50 peratus metanol. Lengkung phenylethanoid glycosides (1–3) telah diwujudkan menggunakan kromatografi cecair ultra-prestasi (UPLC) daripada 5–100 µg/mL dan masing-masing adalah linear (1, r2=0.9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). Ketepatan antara hari dan antara hari [ peratus RSD (sisihan piawai relatif) adalah dari 0.1 hingga 1.8 peratus ] dan ketepatan (95.6–104.2 peratus ) boleh diterima oleh UPLC untuk 1–3. UPLC mengukur 1, 2, dan 3 CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)kandungan menjadi 254, 38, dan 41 mg/g, masing-masing (Rajah S2)

2.3. Pengesahan UPLC/MS/MS

Glikosida phenylethanoid (1–3) dicampur dan dicucuk dengan homogenat tisu otak tikus dan dianalisis menggunakan spektrometer jisim tandem kromatografi cecair prestasi Ultra (UPLC/MS/MS) dengan pengekstrakan fasa pepejal. Had bawah pengesanan (LLOQ) 1–3 ialah 0.2 ng/mL. Pemulihan glikosida phenylethanoid meningkat dengan homogenat tisu otak (10 ng/mL) pada 91.39 peratus untuk 1, 89.54 peratus untuk 2, dan 96.81 peratus untuk 3, masing-masing (Rajah 2).

2.4. Analisis Tisu Otak Tikus Seperti AD

Selepas 14 hari CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pemberian oral (200 mg/kg/hari), tisu otak tikus seperti AD dikumpulkan dan dibahagikan kepada dua bahagian, hippocampus dan striatum, dan kedua-duanya dihomogenkan [19]. Oleh kerana homogenat hippocampus dan striatum dari setiap tikus terlalu sedikit untuk dimuatkan ke dalam pengekstrakan fasa pepejal dan untuk mengelakkan ralat eksperimen yang berlebihan, homogenat hippocampus dan striatum daripada empat tikus individu dicampurkan ke dalam sampel yang dianalisis untuk UPLC / MS / MS menggunakan kaedah pengekstrakan fasa pepejal (Rajah 3A, B). Glikosida fenilethanoid (1-3) diperhatikan dalam hippocampus (Rajah 3A) dan striatum (Rajah 3B). Tiada kemuncak ketara dalam tisu otak kosong (Rajah 3C). Dalam hippocampus kandungan echinacoside ialah 11.97 ± {{20}}.34 ng/mL, kandungan acteoside ialah 1.25 ± 0.16 ng/mL, dan kandungan isoacteoside ialah 1.38 ± 0.08 ng/ mL. Dalam striatum kandungan echinacoside ialah 22.60 ± 1.69 ng/mL, kandungan acteoside ialah 2.03 ± 0.61 ng/mL, dan kandungan isoacteoside ialah 4.90 ± 0.64 ng/mL. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)akan melalui penghalang darah-otak mengikut jumlah ketara yang boleh dikesan iaitu 1–3 dalam hippocampus dan striatum. Kandungan 1 jauh lebih tinggi daripada 2 dan 3 dalam CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)oleh analisis UPLC (Rajah S2). Oleh itu, adalah munasabah untuk diperhatikan bahawa 1 adalah yang tertinggi dalam tisu otak selepas CTE oral(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pentadbiran. Molekul 2019, 24, x UNTUK SEMAKAN RAKAN SEBAYA 4 daripada 12 2.4. Analisis Tisu Otak Tikus Seperti AD Selepas 14 hari CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pemberian oral (200 mg/kg/hari), tisu otak tikus seperti AD dikumpulkan dan dibahagikan kepada dua bahagian, hippocampus dan striatum, dan kedua-duanya dihomogenkan [19]. Oleh kerana homogenat hippocampus dan striatum dari setiap tikus terlalu sedikit untuk dimuatkan ke dalam pengekstrakan fasa pepejal dan untuk mengelakkan ralat eksperimen yang berlebihan, homogenat hippocampus dan striatum daripada empat tikus individu dicampurkan ke dalam sampel yang dianalisis untuk UPLC / MS / MS menggunakan kaedah pengekstrakan fasa pepejal (Rajah 3A, B). Glikosida fenilethanoid (1-3) diperhatikan dalam hippocampus (Rajah 3A) dan striatum (Rajah 3B). Tiada kemuncak ketara dalam tisu otak kosong (Rajah 3C). Dalam hippocampus kandungan echinacoside ialah 11.97 ± {{20}}.34 ng/mL, kandungan acteoside ialah 1.25 ± 0.16 ng/mL, dan kandungan isoacteoside ialah 1.38 ± 0.08 ng/ mL. Dalam striatum kandungan echinacoside ialah 22.60 ± 1.69 ng/mL, kandungan acteoside ialah 2.03 ± 0.61 ng/mL, dan kandungan isoacteoside ialah 4.90 ± 0.64 ng/mL. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)akan melalui penghalang darah-otak mengikut jumlah ketara yang boleh dikesan iaitu 1–3 dalam hippocampus dan striatum. Kandungan 1 jauh lebih tinggi daripada 2 dan 3 dalam CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)oleh analisis UPLC. Oleh itu, adalah munasabah untuk diperhatikan bahawa 1 adalah yang tertinggi dalam tisu otak selepas CTE oral(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pentadbir.

2.5. Aktiviti Pengkelat Logam Phenylethanoid Glycosides (1–3).

Dalam literatur, penentuan bebas daripada sebatian dan kompleks logamnya dilakukan menggunakan HPLC [34,35]. Ukuran aktiviti khelasi telah dianalisis oleh UPLC dalam kajian ini. Larutan 50 µg/mL setiap glikosida phenylethanoid (1–3) telah ditambah ke dalam larutan 10 µg/mL kuprum (Cu), kalsium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), besi (Fe) atau serum tikus masing-masing. Setiap sebatian dengan setiap larutan logam atau serum dianalisis oleh UPLC. Glikosida phenylethanoid (1–3) mempamerkan aktiviti pengkelat logam dengan besi dan serum (Rajah 5, Bahan Tambahan Rajah S1). Molekul 2019, 24, x UNTUK SEMAKAN RAKAN SEBAYA 5 daripada 12 sampel daripada tikus seperti AD selepas CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pemberian oral (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4.19 min), 2 (tR= 5.13 min) dan 3 (tR= 5.68 min)] . (c) Tisu otak kosong. Rajah 4. Glikosida phenylethanoid (1–3) dapat dikesan dalam tisu otak tikus [19] menggunakan UPLC/MS/MS. Data mewakili min ± SD, n{14}} untuk setiap kumpulan. 2.5. Aktiviti Pengkelat Logam Phenylethanoid Glycosides (1-3). Dalam literatur, penentuan bebas daripada sebatian dan kompleks logamnya dilakukan menggunakan HPLC [34,35]. Ukuran aktiviti khelasi telah dianalisis oleh UPLC dalam kajian ini. Larutan 50 ug/mL setiap glikosida phenylethanoid (1–3) telah ditambah ke dalam larutan 10 ug/mL kuprum (Cu), kalsium (Ca), magnesium (Mg), zink (Zn), besi (Fe) atau serum tikus masing-masing. Setiap sebatian dengan setiap larutan logam atau serum dianalisis oleh UPLC. Glikosida fenilethanoid (1–3)

2.6. Analisis Echinacoside (1) dalam Serum Tikus dalam Vivo

Untuk memahami pengedaran echinacoside dalam serum tikus, serum dikumpul dari masa awal hingga 720 minit selepas echinacoside (1) pentadbiran oral (100 mg/kg) dan serum dikumpulkan dari masa awal hingga 720 minit selepas echinacoside (1) pemberian oral (100 mg/kg) dan dianalisis oleh UPLC. Rajah 6 menunjukkan kepekatan berbanding profil masa echinacoside dalam serum tikus.

3. Perbincangan

Demensia, terutamanya AD, adalah penuaan yang tidak dapat dipulihkan dan penyakit kronik yang membawa kepada simpulan soalan Gordian. Penyakit yang tidak dapat diatasi ini membawa kepada isu ekonomi yang serius dengan beban kewangan yang besar dan semakin meningkat. Di seluruh dunia, penyelidik AD mengambil banyak usaha untuk menyiasat ubat anti-AD baharu tetapi gagal dalam beberapa ujian klinikal besar yang menyasarkan A pada tahun 2012 [9]. Kecuali untuk menyasarkan A secara langsung, homeostasis ion logam dalam otak dianggap sebagai sebab utama yang berkaitan dengan pengagregatan dan pemendapan A yang membawa kepada pembentukan AD [9,10]. Oleh itu, ion logam memainkan peranan penting dalam patogenesis AD, dan hipotesis chelation logam telah menjadi hala tuju penyelidikan yang penting [9,13-15].

Menurut kajian terdahulu kami [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)menunjukkan aktiviti anti-demensia yang berpotensi. Malah dalam kajian klinikal manusia, selepas 1 tahun rawatan dengan CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)kapsul untuk pesakit AD sederhana, skor Alzheimer's Disease Assessment Scale-kognitif subskala (ADAS-cog) tidak akan menunjukkan kemerosotan yang ketara berbanding sebelum rawatan [18]. CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)mengekalkan skor ADAS-cog pesakit AD stabil, tetapi ubat preskripsi lain tidak. Satu-satunya pilihan ubat preskripsi yang dilesenkan untuk rawatan AD ialah perencat acetylcholinesterase (AChEIs) seperti donepezil dan galanthamine yang memperbaiki gejala AD dalam jangka pendek, tetapi kemerosotan berlaku selepas 1 tahun rawatan [36]. Berdasarkan kajian klinikal, CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)mempunyai peluang untuk menjadi rawatan yang berpotensi untuk pembangunan agen anti-AD. Berdasarkan laporan kami sebelum ini [24,25], echinacoside (1), acteoside (2), dan iso-acteoside (3) akan melindungi neuron daripada kerosakan oleh A, mengurangkan oligomerisasi A secara in vitro, dan secara signifikan memperbaiki disfungsi kognitif yang disebabkan oleh A. dalam vivo. Kajian in vitro menunjukkan dos aktif 1–3 adalah sehingga 50 ug/mL [24,25]. Tetapi kajian terdahulu menganggap bahawa bioavailabiliti oral 1 dan 2 adalah sangat rendah (0.83 peratus untuk 1 dan 0.12 peratus untuk 2) dalam tikus [29,30]. Kompaun 1 tidak dapat dikenal pasti dalam serum manusia selepas pentadbiran tablet echinacea oral [37]. Kajian semasa menunjukkan bahawa 1-3 mempunyai kebolehtelapan membran yang lemah dan penyerapan dalam sel usus [38] dan kebanyakan 1 akan dimetabolismekan dalam saluran gastrousus [39]. Kandungan kompaun 2 dalam serum tikus hanya kira-kira 4.5 ug/mL selepas 15 minit suntikan intravena dengan dos 10 mg/kg acteoside [30]. Walau bagaimanapun, kajian ini menunjukkan bahawa 1-3 akan dikesan dalam hippocampus dan striatum tisu otak tikus selepas CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)pentadbiran lisan (Rajah 3 dan 4). Di samping itu, Rajah 6 menunjukkan bahawa kandungan kompaun 1 dalam serum tikus meningkat kira-kira 5 kali ganda daripada 15 minit kepada 720 min selepas kompaun 1 pemberian oral (100 mg/kg). Kami menganggap glikosida phenylethanoid CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)akan melalui penghalang darah-otak dan akan berlaku tindakan chelation antara CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)dan logam. Chelation ialah tindak balas kimia boleh balik. Besi adalah unsur penting dalam serum dan otak [10,40]. Rajah 5 menunjukkan bahawa tiga glikosida phenylethanoid akan mempunyai aktiviti pengkelat logam dengan besi dan serum. Besi dan serum jelas mengubah kawasan masa pengekalan puncak tiga glikosida phenylethanoid. Pengkelat besi mungkin merupakan sebab penting yang membawa kepada kesilapan mengenal pasti bioavailabiliti glikosida phenylethanoid yang sangat rendah. Oleh itu, aktiviti pengkelat logam harus dipertimbangkan dalam serum darah dan analisis otak bagi tiga CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus)glikosida phenylethanoid untuk memulihkan bioavailabiliti dan farmakokinetik sebenar. Di samping itu, keputusan menunjukkan tiga glikosida phenylethanoid (1–3) akan melalui penghalang darah-otak dan tiba di tisu otak melalui peredaran badan. Kajian ini membangunkan kaedah yang paling pantas dan sensitif untuk analisis 1–3 menggunakan UPLC/MS/MS dan memberikan bukti yang kukuh untuk membuktikan bahawa glikosida phenylethanoid (1–3) adalah juzuk bioaktif utama CTE(Cistanche tubulosa ekstrak akueus).

Ekstrak cistanche tubulosa

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan Tumbuhan

Batang C. tubulosa dikumpulkan pada Mei 2016 dari Hangzhou, China. Loji itu dikenal pasti oleh spesimen Baucar HC Dr. Lin (No. 20016CT) telah disimpan di Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, China.

4.2. Pengasingan dan Pemurnian

Batang C. tubulosa kering dikisar menjadi serbuk, dan kemudian diekstrak lima kali dengan 75 peratus EtOH. Selepas penyejatan pelarut di bawah tekanan yang dikurangkan, ekstrak mentah telah tertakluk kepada kromatografi lajur Macroporousresin AB-8 dengan sistem pelarut kecerunan H2O/EtOH daripada 20 peratus EtOH sehingga 100 peratus EtOH. Menurut kromatografi lapisan nipis, empat pecahan (Fr.1~Fr.4) telah dikumpulkan untuk pengasingan selanjutnya. Fr. 2 telah tertakluk kepada kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) persediaan pada lajur COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm × 20 mm id, 5 µm) menggunakan 18 peratus asetonitril sebagai sistem fasa mudah alih. Kadar sesama ialah 15 mL/min. Tiga puncak minat utama telah dikumpulkan secara terpilih. Pecahan yang mengandungi sebatian yang disasarkan dipeluwapkan lagi kepada kekeringan dan menghasilkan 1, 2, dan 3, masing-masing.

4.3. Analisis Eksperimen

Spektrum NMR 1H dan 13C diperoleh menggunakan spektrometer Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, USA) dengan tetrametilsilane (TMS) sebagai standard dalaman. HPLC persediaan dilakukan menggunakan lajur fasa terbalik (Cosmosil C18-lajur AR-II, 250 mm × 20 mm id; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Jepun) pada siri AD Shimadzu LC-6 radas dengan Prominence HPLC UV-Visdetectors (Kyoto, Jepun).

Echinacoside (1):serbuk putih; ESI−MS m/z: 785 [M − H]−; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz):δ 1.07 (1H, d, J=6.2 Hz, Rha-H{{10} }), 2.79 (2H, t, J=5.2 Hz, H-7), 3.56 (1H, m, Ha{{20}}), 3.79 (1H, m, H-30 ),3.91 (1H, m, Hb-8), 4.29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4.38 (1H, d, J=7.9 Hz, H-10 ), 5.00 (1H, t, J=9.6 Hz, H-40 ), 5.17(1H, d, J=1.5 Hz, Rha-H-1), 6.27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-800 ), 6.58 (1H, dd, J=8.1,2.0 Hz,H-6), 6.67 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6.70 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.77 (1H, d, J=8.2 Hz, H{ {86}} ), 6.94 (1H,dd, J=8.3, 2.0 Hz, H-600 ), 7.05 (1H, d, J=2.0 Hz, H{ {100}} ), δ 7.59 (1H, d, J=15.9 Hz, H-700 ); 13C-NMR(CD3OD, 125 MHz): δ 18.5 (Rha-C-6), 36.6 (C-7), 62.6 (Glc-C-6), 69.4 (C{{ 124}} ), 70.5 (C-40 ), 70.6 (Rha-C-5), 71.5 (Glc-C-4), 72.0 (Rha-C-3) , 72.3 (C-8), 72.4 (Rha-C-2), 73.8 (Rha-C-4), 74.7 (C-50 ), 75.1 (Glc-C -2), 76.1 (C-20 ), 77.8 (Glc-C-5), 77.9 (Glc-C-3), 81.7 (C-30 ) , 103.1 (Rha-C-1), 104.2 (C-10 ), 104.7 (Glc-C-1),114.7 (C-200 ), 115.3 (C{{ 188}} ), 116.3 (C-500), 116.5 (C-2), 117.1 (C-5), 121.3 (C-6), 123.3 (C{{ 203}} ), 127.6 (C-100 ),131.5 (C-1), 144.7 (C-3), 146.1 (C-4), 146.9 (C{{ 218}} ), 148.2 (C-700 ), 149.8 (C-300 ), 168.5 (C-900 ) (Rajah S3–S5)

Acteoside (2):serbuk putih; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 0.94(3H, d, J =5.9 Hz, H{{1{{ 156}}}} ), 2.68 (2H, m, H-7), 4.33 (1H, d, J=7.8 Hz, H{{20}} ), 4.70 (1H, t, J=9.0 Hz, H-400 ),5.01 (1H, s, H-1000 ), 6.18 (1H, d, J=15 .9 Hz, H-80 ), 6.48 (1H, dd, J=7.9, 1.4 Hz, H-6), 6.62 (1H, d, J=7 .1Hz, H-5), 6.73 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.75 (1H, d, J=7.9 Hz , H-50 ), 6.97 (1H, d, J=8.1 Hz, H-60 ),7.01 (1H, s, H-20 ), 7.44 (1H , d, J=15.8 Hz, H-70 ); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): δ 18.2 (C-6000 ), 35.1(C-7), 60.8 (C-600 ), 68.8 (C{{94} } ), 69.2 (C-400 ), 70.3 (C-3000 ), 70.3 (C-8), 70.4 (C-2000 ), 70.6 (C{{109} } ), 71.7 (C-500 ),74.5 (C-200 ), 79.2 (C-300 ), 101.3 (C-1000 ), 102.3 (C{{124} } ), 113.6 (C-80 ), 114.7 (C-20 ), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50 ),116.3 (C{{139} }), 119.6 (C-6), 121.5 (C-60 ), 125.6 (C-10 ), 129.2 (C-1), 143.6 (C{{154} }), 145.0 (C-3), 145.0 (C-30 ), 145.6(C-70 ), 148.5 (C-40 ), 165.7 (C{{169} } ) (Rajah S6–S8).

Iso-acteoside (3):serbuk putih; ESI−MS m/z: 623 [M − H]−; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz):δ 1.07 (3H, d, J=6.1 Hz, H{{10} } ), 2.65 (2H, m, H-7), 4.35 (1H, d, J=10.0 Hz, H-100 ), 5.10 (1H, s, H{{ 24}} ),6.27 (1H, d, J=15.9 Hz, H-80 ), 6.45 (1H, dd, J=8.0, 1.8 Hz, H{{ 38}}), 6.58 (1H, d, J=8.8 Hz, H-5), 6.73(1H, d, J=1.6 Hz, H{{50} }), 6.74 (1H, d, J=8.1 Hz, H-50 ), 6.94 (1H, d, J=8.2 Hz, H-60 ) , 7.04 (1H, s, H-20 ),7.46 (1H, d, J=15.8 Hz, H-70 ); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 17.9 (C-6000 ), 35.2 (C-7), 63.5 (C-600 ),68.2 (C-5000 ), 70.4 (C-400 ), 70.6 (C-3000 ), 71.7 (C-8), 72.1 (C-2000 ), 73.7 (C-4000 ), 74.1 (C-500 ), 74.5 (C-200 ), 80.9(C-300 ), 100.7 (C-1000 ), 102.7 (C-100 ), 113.9 (C-20 ), 114.9 (C-80 ), 115.5 (C-5), 115.8 (C-50 ), 116.3 (C-2 ), 119.6(C-6), 121.5 (C-60 ), 125.5 (C-10 ), 129.2 (C-1), 143.5 (C-4 ), 145.0 (C-3), 145.3 (C-30 ), 145.6 (C-70 ), 148.5 (C-40 ),165.6 (C-90 ) (Rajah S9–S11).

4.4. Penyediaan Ekstrak Akueus Cistanche Tubulosa (CTE)

Batang serbuk Cistanche tubulosa diekstrak dua kali dengan merefluks dengan air selama 1.5 jam, dan larutan ekstrak ditapis. Yang ditapisCistanche tubulosaekstrak akueus(CTE) disimpan pada suhu 4 ◦C sebelum digunakan.

5. Kesimpulan

Kajian ini menunjukkan bahawa 1–3 ialah komponen aktif CTE untuk aktiviti anti-AD. Kelat besi telah menjadi konsep baru untuk mereka bentuk ubat generasi baru untuk rawatan AD [41]. CTE ialah ubat Cina anti-AD botani yang berpotensi menyasarkan pengagregatan dan pemendapan A akibat khelasi besi. Di samping itu, kami seterusnya membuktikan bahawa 1–3 akan sampai ke otak melalui penghalang darah-otak (BBB). Komponen aktif dan pengesahan mekanisme asas CTE akan sangat membantu kawalan kualiti dan bioavailabiliti kajian produk pada masa hadapan. Pada masa yang sama, kaedah analisis lanjutan dan cekap yang dibentangkan akan berguna dalam menentukan 1–3 dalam tumbuhan, makanan, darah, dan tisu otak untuk cap jari kimia dan penyelidikan farmakokinetik.

Rujukan

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; Ikram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; et al. Perubahan kelaziman dan kejadian demensia dari semasa ke semasa–bukti semasa. Nat. Rev. Neurol. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Dementia: Diagnosis tepat pada masanya dan campur tangan awal. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodaty, H.; Close, J. Kemandirian dan ciri-ciri orang tua dengan dan tanpa demensia yang dimasukkan ke hospital berikutan mencederakan diri dengan sengaja. Int. J. Geriatr. Psik. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Claus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Prevalensi penyakit Alzheimer dan demensia vaskular: persatuan dengan pendidikan. Kajian Rotterdam. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galasko, D.; Dewan, K.; Luchsinger, JA; Ogunniyi, A.; Perry, EK; Potocnik, F.; et al. Penyakit Alzheimer dan demensia vaskular di negara membangun: Kelaziman, pengurusan dan faktor risiko. Lancet. Neurol. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. Fakta dan angka penyakit Alzheimer 2018. Demen Alzheimer. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Hipotesis amiloid penyakit Alzheimer: Kemajuan dan masalah dalam perjalanan ke terapeutik. Sains 2002, 297, 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, penyakit Alzheimer FM. N. Inggeris. J. Med. 2010, 362, 329–344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, AI Metallostasis dalam penyakit Alzheimer. Radic Percuma. biol. Med. 2013, 62, 76–89. [CrossRef]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Kesan ion logam pada pengagregatan A dan Tau. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Peraturan homeostasis tembaga dan besi oleh chelator logam: Kemoterapi yang mungkin untuk penyakit Alzheimer. A. Kimia. Res. 2015, 48, 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Copper(I) chelators untuk penyakit Alzheimer. J. Fizik. Kimia. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Kemajuan terkini dalam chelator logam pelbagai fungsi sebagai ubat yang berpotensi untuk penyakit Alzheimer. Coordinat. Kimia. Wahyu 2016, 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. D'Acunto, CW; Kaplanek, R.; Gbelcova, H.; Kajik, Z.; Briza, T.; Vasina, L.; Havlik, M.; Ruml, T.; Kral, V. Metallomics untuk rawatan penyakit Alzheimer: Penggunaan chelator generasi baharu yang menggabungkan sifat mengikat dan pengangkutan kation logam. Eur. J. Med. Kimia. 2018, 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Teranostik yang melibatkan logam: Strategi baru untuk memerangi penyakit Alzheimer. Coordinat. Kimia. Wahyu 2018, 362, 72–84. [CrossRef]

16. Shao, ML; Ma, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, Farmakope Cina XN; Penerbit Kimia dan Perindustrian: Beijing, China, 2005; hlm. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Salah satu hadiah farmaseutikal terbaik Perubatan tradisional Cina. Depan. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. Kajian berlabel terbuka, bukan plasebo terkawal pada kapsul glikosida Cistanche tubulosa (memo semula (R)) untuk merawat Penyakit Alzheimer sederhana. Am. J. Alzheimer's Dis. Demen lain. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Pembalikan oleh ekstrak berair Cistanche tubulosa daripada defisit tingkah laku dalam model tikus seperti penyakit Alzheimer: Perkaitan untuk pemendapan amiloid dan fungsi neurotransmitter pusat. Pelengkap BMC. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Analisis glikosida phenylethanoid dalam ekstrak herba Cistanchis oleh LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Sinic. 2000, 35, 839–842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Kesan neuroprotektif echinacoside dalam model MPTP tetikus penyakit Parkinson. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Ye, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinacoside melindungi daripada apoptosis neuron yang disebabkan oleh MPP(tambah) melalui peraturan laluan ROS/ATF3/CHOP. Neurosci. lembu jantan. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinacoside melindungi daripada 6-disfungsi mitokondria akibat hidroksidopamin dan tindak balas keradangan dalam sel PC12 melalui mengurangkan pengeluaran ROS. Evid. Pelengkap Berasaskan. Bergantian. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinacoside memperbaiki kerosakan ingatan dan defisit kolinergik yang disebabkan oleh peptida amyloid-beta melalui perencatan pemendapan amiloid dan toksikologi. Fungsi Makanan. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Acteoside dan iso-acteoside melindungi sitotoksisiti yang disebabkan oleh amiloid-beta peptida, defisit kognitif dan gangguan neurokimia dalam Vitro dan dalam Vivo. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18. [CrossRef]