Dalam Analisis Siliko Peptida Racun Parasitoid Drosophila Mendedahkan Kelaziman Motif Klip Kation–Polar–Kation dalam Protein Knottin Bahagian 1

Abstrak:

Sebagai tebuan parasitoid generalis, Leptopilina heteroatom sangat berjaya pada banyak spesies lalat buah dari genus Drosophila. Parasitoid menghasilkan struktur seperti vesikel ekstraselular (EV) berbilang strategi khusus dalam racunnya. Analisis proteomik mengenal pasti beberapa protein yang berkaitan dengan imuniti, termasuk peptida knottin, LhKNOT, yang mengandungi lipatan simpul sistein (ICK) perencat yang dipelihara secara struktur, yang terdapat dalam protein daripada taksa yang pelbagai. Analisis struktur dan dok kami bagi 36-lipatan sisa knottin teras LhKNOT mendedahkan bahawa selain motif knottin itu sendiri, ia juga mempunyai klip Cation–Polar–Cation (CPC).

Inhibitor cysteine ​​​​adalah bahan semula jadi yang digunakan untuk mencegah kerosakan oksidatif dan menggalakkan pertumbuhan sel. Untuk imuniti, peranan sistein terutamanya dicerminkan dalam meningkatkan imuniti badan dan mencegah keradangan dan jangkitan.

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, semakin banyak kajian telah menunjukkan bahawa sistein boleh memainkan peranan penting dalam sistem imun. Ia boleh menggalakkan percambahan sel imun, meningkatkan daya tahan tubuh terhadap patogen, dan mengurangkan risiko jangkitan. Selain itu, sistein juga boleh mengurangkan pengeluaran radikal bebas dan meningkatkan kesihatan keseluruhan sistem imun, seterusnya meningkatkan imuniti badan.

Walaupun kesan sistein pada imuniti adalah sangat ketara, apabila menggunakan sistein perencat, ia harus digunakan dengan berhati-hati. Kerana sistein perencat biasanya digunakan untuk merawat penyakit tertentu, seperti penyakit kardiovaskular, arthritis, dan lain-lain, jika disalahgunakan, ia akan menjejaskan imuniti dan menyebabkan sistem imun badan menjadi lemah, seterusnya meningkatkan risiko jangkitan.

Kesimpulannya, terdapat hubungan yang tidak dapat dipisahkan antara sistein perencat dan imuniti. Walaupun perencat sistein boleh menggalakkan kesihatan badan, mereka juga perlu digunakan di bawah bimbingan doktor, dan perhatian harus diberikan untuk mengekalkan dos yang munasabah untuk mengekalkan kesihatan badan. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan imuniti. Cistanche boleh meningkatkan imuniti dengan ketara, kerana abu daging mengandungi pelbagai bahan aktif secara biologi, seperti polisakarida, dua cendawan, Huang Li, dll. Bahan-bahan ini boleh merangsang pelbagai sistem imun. sel seperti sel, meningkatkan aktiviti imun mereka.

Klik manfaat kesihatan cistanche

Motif klip CPC dianggap memudahkan aktiviti antimikrob dalam protein pengikat heparin. Yang menghairankan, majoriti ICK yang diuji juga mempunyai motif klip CPC, termasuk 75 tumbuhan bona fide dan protein knottin arthropod yang berkongsi jujukan tinggi dan/atau persamaan struktur dengan LhKNOT. Seperti LhKNOT dan 75 protein knottin yang lain ini, malah peptida antikulat Drosophila Drosomycin, gen sasaran kanonik bagi laluan imun TollNF-kappa B lalat, mengandungi motif klip CPC ini. Bersama-sama, keputusan kami mencadangkan kemungkinan fungsi pertahanan untuk LhKNOT parasitoid.

Kelaziman motif klip CPC, intrinsik kepada simpul sistein dalam protein knottin yang diperiksa di sini, menunjukkan bahawa topologi 3D yang terhasil adalah penting untuk fungsi biokimia mereka. Klip CPC berkemungkinan merupakan motif struktur yang sangat terpelihara yang terdapat dalam banyak protein pelbagai dengan kapasiti pengikatan heparin yang dilaporkan, termasuk protein amiloid. Knottins adalah sasaran untuk pembangunan ubat terapeutik, dan pandangan tentang hubungan struktur-fungsi mereka akan memajukan reka bentuk ubat baru.

Kata kunci:

hos–parasit; Drosophila; Leptopilina; simpulan sistein; lipatan knottin; Klip Kation–Polar–Kation; peptida antimikrob; motif pengikat heparin; protein mini.

1. Pengenalan

Dalam interaksi perumah-parasit, parasit mesti memberikan tekanan yang menyinggung sambil pada masa yang sama memastikan perumah hidup untuk mengekalkan keturunan yang berdaya maju [1,2]. Matlamat yang bercanggah sedemikian telah membawa kepada evolusi faktor virulensi dengan strategi molekul yang pelbagai sambil mengekalkan kekhususan perumah yang tinggi. Parasit Hymenoptera membentuk lebih daripada sejuta spesies, terdapat di mana-mana di planet ini, dan memparasitkan pelbagai arthropoda, terutamanya serangga [3].

Tebuan yang menyerang perumah serangga telah membangunkan pelbagai strategi tingkah laku dan biokimia untuk berjaya dan kekal di bawah tekanan evolusi bersama yang berterusan dengan perumah mereka [4-7].

Sistem Leptopilina/Drosophila ialah model yang baru muncul untuk memahami asas molekul tindak balas anti-tebuan dan strategi virulensi tebuan [8]. Untuk menekan imuniti perumah, betina Leptopilina memperkenalkan faktor racun ke dalam perumah larva mereka semasa oviposisi [4,9,10]. Mekanisme imun semula jadi yang ditakrifkan dengan baik dalam Drosophila [11-13] menyediakan konteks yang berharga untuk mengkaji kesan faktor racun tawon ini.

Jangkitan oleh pakar L. boulardi mengaktifkan lengan imun humoral dan selular yang dikawal oleh laluan isyarat Toll-NF-κB lalat yang dipelihara. Ekspresi gen antimikrob peptida (AMP) seperti drosomycin diaktifkan selepas jangkitan L. boulardi [14]. Isyarat Toll-NF-κB juga mengawal pembahagian dan perkembangan sel darah [15,16], langkah-langkah yang mengawal enkapsulasi dan kematian telur tebuan [17,18].

Sebaliknya, jangkitan oleh heteroatom L. generalis menyekat kedua-dua laluan imun [9,14], dan hampir semua sel darah larva dimusnahkan oleh faktor dalam racun tebuan [19,20].

Dalam kajian ini, kami menganalisis struktur teori peptida L. heteroatom, dipanggil LhKNOT, yang dikenal pasti dalam rembesan seperti organel dalam racun L. heteroatom tetapi tidak dalam racun L. boulardi [21]. Organel penindas imun ini termasuk lebih daripada 350 protein dan mempunyai profil proteomik mikrovesikel eukariotik dan sejumlah besar protein yang berkaitan dengan imuniti [21-23].

LhKNOT mengguna pakai motif "Inhibitor Cysteine ​​Knot" (knottin) [24]. Motif knottin secara meluas dipelihara dalam pelbagai taksa, daripada tumbuhan [25,26] kepada siput [27]. Peptida kecil ini (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Pelbagai aktiviti knottin dikaitkan dengan struktur keseluruhan lipatannya, yang bergantung semata-mata pada motif terpelihara enam sisa sistein yang mengambil kesempatan daripada keupayaan unik sistein ini untuk membentuk jambatan disulfida. Motif knottin berlaku apabila sisa sistein diperhatikan dalam corak C1-C2-C3-C4-C5-C6 (di mana "-" mewakili beberapa sisa yang sangat berubah-ubah).

Jambatan disulfida kemudiannya dibentuk dengan cara yang sama terpelihara (C1-C4, C2-C5 dan C3-C6), menghasilkan C1-C4 dan C{{ 8}}C5 membentuk kitaran makro, manakala C{10}}C6 berlaku dalam kitaran makro ini, menghasilkan topologi "bersimpul". Oleh kerana topologi bersimpul ini sebahagian besarnya bergantung pada pemuliharaan enam sisa sistein, motif knottin membolehkan variasi ketara dalam jujukan keseluruhan [30]. Gabungan saiznya yang kecil, toleransi yang tinggi terhadap varians jujukan, dan kestabilan struktur yang diperhatikan telah menjadikan knottin sebagai perancah yang popular untuk reka bentuk ubat [30], bahkan berpotensi untuk rawatan kanser [31].

Pelbagai baris bukti eksperimen menunjukkan atau mencadangkan keupayaan antimikrob untuk knottin yang berbeza [25,26,29,30,32,33] atau interaksi saluran ion berpagar [28,34], walaupun mekanisme molekul yang mana fungsi ini dijalankan tidak difahami dengan baik. Tambahan pula, tidak diketahui sama ada fungsi antimikrob ini berkongsi mekanisme tindakan yang sama.

Memandangkan penemuannya daripada zarah penindas imun daripada parasit lalat, matlamat kami adalah untuk (a) mengenal pasti jujukan berkaitan LhKNOT daripada pelbagai organisma, termasuk L. heteroatom, L. boulardi dan parasitoid Ganaspis, yang menyerang Drosophila dan (b) mengenal pasti sebarang motif struktur novel hadir dalam homolog LhKNOT yang diketahui atau baharu dengan harapan bahawa ramalan motif yang dipelihara sedemikian mungkin mencadangkan fungsi yang mungkin untuk LhKNOT dan membimbing penyelidikan eksperimen masa depan.

Kami menunjukkan bahawa model teori LhKNOT mempunyai ciri-ciri lipatan knottin dengan tiga helaian beta antiselari, dikekang oleh jambatan disulfida. Model LhKNOT mengandungi klip CPC, yang mampu berinteraksi dengan heparin, glycosaminoglycan (GAG) bercas negatif yang mempunyai nilai perubatan yang ketara. LhKNOT juga berpotensi untuk berinteraksi dengan GAG lain, seperti keratan sulfat (GAG yang sangat sulfat, serupa dengan heparin) dan asid hyaluronik (wakil GAG tunggal yang tidak memerlukan sulfat) [35].

Tambahan pula, homolog struktur LhKNOT (iaitu, protein motif knottin bona fide) juga mempunyai motif klip CPC yang boleh berlabuh dengan heparin. Anehnya, seperti LhKNOT dan protein knottin bona fide yang lain ini, peptida antikulat Drosophila Drosomycin juga berkongsi motif klip CPC ini dalam strukturnya. Motif ini juga dikenal pasti dalam 41 daripada 46 homolog LhKNOT tambahan daripada L. heteroatom, L. boulardi, dan Ganaspis spp. tebuan berjaya pada D. melanogaster.

Ini dalam pemerhatian berasaskan siliko mencadangkan bahawa motif klip CPC, yang wujud dalam banyak knottin, mungkin menyediakan asas struktur untuk mengubah suai fungsi imun atau virulensi. Kami membuat spekulasi tentang kemungkinan fungsi berkaitan antimikrob atau virulensi untuk LhKNOT tebuan. Banyaknya lipatan knottin dan keselarasannya dengan motif klip CPC dalam kebanyakan peptida knottin yang baru dikenal pasti daripada tiga parasitoid Drosophila mencadangkan peranan penting yang belum ditentukan untuk mereka dalam fisiologi parasitoid dan/atau dalam parasit hos. interaksi.

2. Keputusan
2.1. Urutan LhKNOT Menunjukkan Persamaan dengan Peptida Antimikrobial Serangga dan Tumbuhan

Carian BLASTp bagi pangkalan data nr dan TSA menggunakan jujukan LhKNOT penuh (60 asid amino) menunjukkan bilangan hit penting yang terhad, terutamanya diberi anotasi sebagai "peptida antimikrobial", daripada tumbuhan dan serangga. Beberapa jujukan kulat juga dikenal pasti. Semua keputusan menunjukkan kurang daripada 60 peratus identiti asid amino kepada LhKNOT. Padanan teratas untuk LhKNOT dalam pangkalan data nr ialah peptida antimikrobial daripada kumbang biasa, Callosobruchus maculates, manakala hit teratas dalam pangkalan data TSA ialah peptida antimikrob daripada hama keriting gandum Aceria Coachella.

Pemuliharaan adalah paling menonjol di kawasan satu-satunya motif jujukan yang dikaitkan dengan LhKNOT, tandatangan 'peptida antikulat' bersimpul sistein (domain pfam11410, E=2.8 × 10−3 ). Selepas menjalankan PSI-BLAST untuk pengesanan homolog jauh, urutan tambahan telah didedahkan. PSI-BLAST menunjukkan keputusan yang sama dengan loji ais biasa, Mesembryanthemum crystallinum; hama merah, Dinothrombium tinctorium; tebuan parasitoid, Trichogramma pretiosum; klik kumbang, Ignelater bercahaya; tebuan parasitoid, Trichogramma brassicae; kumbang debunga biasa, Brassicogethes aeneus; pengorek abu, Agrilus planipennis; dan lalat gergaji, Neodiprion lecontei.

Menggunakan pelayan web HMMER yang dipacu oleh Model Markov Tersembunyi sebagai kaedah alternatif untuk mengesan homolog jauh, kami mengenal pasti lima serangan kulat daripada Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Rosellinia necatrix dan Beauveria bassiana.

Carian PDB untuk jujukan yang serupa hanya memperoleh dua keputusan penting, satu untuk peptida antikulat jenis knottin Alo-3 daripada serangga Acrocinus longimanus dan yang kedua daripada peptida penyembuhan luka yang dikekang disulfida pB1 daripada Pereskia bleo. Butiran semua homolog dekat dan jauh yang dikenal pasti menggunakan pendekatan persamaan urutan yang berbeza diringkaskan dalam Jadual Tambahan S1.

Penjajaran LhKNOT kepada struktur knottin tipikal yang diketahui serta homolog yang dikenal pasti menunjukkan pemuliharaan enam sistein yang membentuk tiga jambatan disulfida dalam LhKNOT (Rajah 1A). Pada terminal-Nnya, LhKNOT mengandungi segmen heliks yang panjang yang diramalkan berfungsi sebagai urutan isyarat; secara dalaman, ia mengandungi tiga helaian beta, seperti yang dijangkakan daripada struktur sekunder peptida knottin (Rajah 1B).

Selain itu, penilaian kesamaan jujukan LhKNOT disasarkan kepada transkrip L. heteroatom dan L. boulardi yang tersedia dan daripada parasitoid Drosophila yang lain, Ganaspis spp. (lihat Kaedah), mendedahkan banyak urutan yang berkaitan. Untuk L. heterotoma (Lh14), kami mengenal pasti 16 protein knottin Lh14 tambahan (Jadual Tambahan S2).
Untuk L. boulardi, kami mengenal pasti 22 protein knottin (Jadual Tambahan S3). Enam homolog LhKNOT juga dikenal pasti daripada hookeri Ganaspis (G1) dan dua homolog LhKNOT ditemui dalam ramalan protein yang dibuat daripada genom G. brasiliensis (VA) (Jadual Tambahan S4). Rajah 2 menunjukkan pemuliharaan jujukan knottin parasitoid ini dengan LhKNOT. Oleh itu, sekurang-kurangnya beberapa parasitoid Drosophila yang disampel dalam kajian ini kelihatan mengekodkan berbilang protein knottin. Peptida knottin tambahan tersebut mungkin dikodkan oleh tawon ini, dan pendekatan proteomik/bioinformatik yang sistematik diperlukan untuk mendapatkan senarai yang komprehensif. Fungsi knottin diduga ini dalam fisiologi parasit masih tidak diketahui.

Rajah 1. (A) Penjajaran jujukan berbilang LhKNOT (atas) dan homolog dalam keluarga knottin (atas ke bawah): Mesembryanthemum crystallinum (tumbuhan; antimikrob; ID NCBI: AAC19399), Aceria tosichella (hama; antimikrob; ID NCBI :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (kumbang; tidak diketahui; ID NCBI:VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (hama; tidak diketahui; ID NCBI:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} seperti; tebuan parasitoid; antimikrobial; ID NCBI: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (kumbang; tidak diketahui; ID NCBI: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (tebuan parasitoid; tidak diketahui; ID NCBI: CAB{{27 }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (kumbang; tidak diketahui; ID NCBI: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (pengorek abu; antimikrob; ID NCBI : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (sawfly; tidak diketahui; NCBI ID: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (kulat; antikulat; Uniprot ID: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (kulat; antikulat ; ID Uniprot: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (kulat; tidak diketahui; ID Uniprot: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (kulat; tidak diketahui; ID Uniprot: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (kulat; tidak diketahui; ID Uniprot: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; kumbang; antikulat; ID PDB: 1Q3J) dan Pereskia bleo (pB1; kaktus ID PDB; PDB 5XBD). Sisa yang sama diserlahkan dengan warna merah, manakala sisa yang serupa secara kimia diserlahkan dengan warna kuning. Anak panah hitam menandakan sisa sistein terpelihara yang bertanggungjawab untuk lipatan struktur knottin, dan ketersambungan jambatan disulfida bagi tiga jambatan disulfida ditandakan dengan nombor hijau neon.

X dan XX menandakan bilangan pembolehubah sisa pada terminal N- dan C, masing-masing. Elemen struktur sekunder LhKNOT yang dimodelkan ditunjukkan di bahagian atas. dan T mewakili -strand, dan -turn, masing-masing. (B) Ramalan struktur sekunder untuk LhKNOT, menunjukkan segmen heliks panjang (silinder merah jambu; isyarat peptida) diikuti oleh tiga helai beta (anak panah kuning). Struktur sekunder ini mengikuti tandatangan Knottin kanonik [36]. (C) Prototaip lipatan struktur knottin daripada pangkalan data KNOTTIN [36] (kebenaran untuk menghasilkan semula imej ini diberikan oleh Dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, Oktober 2019). Dua jambatan disulfida (hijau) membentuk kitaran makro, manakala satu pertiga (biru) menarik melalui pusat memberikan protein topologi bersimpul yang serupa. (D) Struktur tertier LhKNOT yang diramalkan, menunjukkan topologi bersimpul dan motif sistein terpelihara, sisa sistein membentuk jambatan disulfida dalam corak terpelihara yang dilihat di seluruh keluarga knottin (bentuk C1 -C4 dan C2 -C5 kitaran makro, C3 -C6 menarik melalui tengah).

Rajah 2. (A) Penjajaran jujukan berbilang LhKNOT (atas) dan homolog dalam Lh14. (B) Penjajaran jujukan berbilang LhKNOT (atas) dan homolog dalam L. boulardi. X yang ditanda dalam kotak hijau sepadan dengan sisipan berikut dalam dua urutan Lb17: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEPFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Penjajaran jujukan berbilang LhKNOT (atas) dan homolog dalam Ganaspis spp. Sisa yang sama diserlahkan dengan warna merah, manakala sisa yang serupa secara kimia diserlahkan dengan warna kuning.

Anak panah hitam menandakan sisa sistein terpelihara yang bertanggungjawab untuk lipatan struktur knottin, dan ketersambungan jambatan disulfida bagi tiga jambatan disulfida ditandakan dengan nombor hijau neon. Elemen struktur sekunder LhKNOT yang dimodelkan ditunjukkan di bahagian atas. dan T mewakili -strand, dan -turn, masing-masing. Bintang kelabu ditambah pada bahagian atas blok jujukan, sisa di atas mewakili sisa yang dimodelkan dengan konformasi bergantian.

2.2. Struktur Tiga Dimensi LhKNOT

Lipatan struktur tipikal peptida knottin ditakrifkan oleh enam sistein yang terlibat dalam tiga ikatan disulfida untuk membentuk lembaran beta antiselari tiga untai bersimpul sistein [25]. Ciri penting lipatan ini ialah keterkaitan sisa sistein untuk membentuk jambatan disulfida dan jambatan disulfida sistein 3 dan 6 melalui disulfida 1–4 dan 2–5 untuk membuat disulfida khas melalui simpulan disulfida (Rajah 1A, C ).

Disulfida ini, melalui ciri simpulan disulfida, membezakan lipatan knottin daripada protein simpulan sistein yang lain. Selain daripada sistein yang dipelihara, selebihnya jujukan asid amino boleh agak berubah-ubah, dan oleh itu, hanya bilangan knottin yang terhad dikenal pasti melalui pendekatan persamaan jujukan untuk LhKNOT (lihat bahagian sebelumnya dan Jadual Tambahan S1).

Algoritma pengecaman lipatan dan pendekatan pemodelan berasaskan templat, sebaliknya, mendapatkan beberapa knottin pelbagai sebagai calon yang sesuai untuk memodelkan LhKNOT. Di antara pelbagai model LhKNOT yang dihasilkan, model terbaik ialah model berasaskan pelbagai templat LhKNOT yang dicipta menggunakan program HHpred [37] dengan sekatan struktur yang diperoleh daripada tiga templat teratas, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], omega-agatoxin-IVA (PDB: 1IVA) [28], dan PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Profil tenaga berasaskan pengetahuan yang dikira menggunakan ProSA-web [38] untuk model terpilih ini menunjukkan tenaga yang rendah dan skor z -4.53, yang setanding dengan struktur yang diselesaikan.

Verify3D [39] menilai model berasaskan berbilang templat ini dengan skor lulus (100.00 peratus daripada sisa dalam model mempunyai purata 3D-1 skor D lebih besar daripada atau sama dengan 0.2). Skor VoroMQA [40] 0.325 berkemungkinan mencerminkan saiz kecil peptida dan skor templat berada dalam julat yang sama (Tambahan Rajah S1).

Model berasaskan pelbagai templat ini melambangkan lipatan knottin dengan tiga helai beta antiselari, dikekang oleh jambatan disulfida dan ketersambungan dijangka jambatan disulfida (Rajah 1D). KNOTER3D, alat dalam Pangkalan Data KNOTTIN [36] mengesahkan bahawa model ini mempunyai lipatan knottin yang bona fide dan mengesahkan corak ikatan disulfida yang dikenal pasti sebelum ini dalam Rajah 1D.

2.3. LhKNOT Menunjukkan Kehadiran Klip CPC, Mampu Berinteraksi dengan Heparin dan GAG Lain

Untuk mencari fungsi LhKNOT yang berpotensi, korelasi struktur-fungsi homolog struktur rapat LhKNOT telah disiasat. Protein knottin daripada kaktus Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] mempunyai motif pengikat heparin yang dikenali sebagai klip CPC. Motif struktur ini membentuk klip terkekang geometri daripada dua sisa kationik dan satu kutub yang berinteraksi dengan heparin oleh jambatan garam dan ikatan hidrogen yang mengapitnya dalam kedudukan dalam permukaan bercas positif klip [41].

Superposisi struktur kaktus knottin dan LhKNOT menunjukkan bahawa kedua-dua struktur adalah sangat serupa, dengan perbezaan keseluruhan kurang daripada 2Å. Analisis dok LhKNOT dengan heparin, menggunakan parameter khusus ClusPro untuk heparin sebagai ligan, mendedahkan bahawa untuk LhKNOT, interaksi polar yang sesuai dengan motif klip CPC berlaku dalam residu R1-S3-R14 (Rajah 3A) .

Jarak yang diukur (kedua-duanya di antara alfa-karbon dan pusat jisim rantai sisi sisa yang mengambil bahagian) berbeza daripada klip CPC kurang daripada 1Å, mencadangkan kehadiran klip CPC yang diduga dalam LhKNOT (Rajah 3B). Elektrostatik permukaan LhKNOT yang dimodelkan juga menunjukkan kehadiran poket pengikat kationik yang dijangka dibentuk oleh klip CPC [41,42] (Rajah 3C).

Untuk menilai keupayaan klip CPC untuk berinteraksi dengan GAG lain, analisis dok tambahan dilakukan dengan LhKNOT dan keratan sulfat (PDB ID: 1KES) dan dengan LhKNOT dan asid hyaluronik (PDB ID: 1HYA). Dalam kedua-dua kes, permukaan pengikatan bercas positif yang dicipta oleh klip CPC terikat pada molekul bercas negatif. Ligplot yang dihasilkan oleh PDBSum mengesahkan persatuan GAG dengan sisa pembentuk CPC (Angka Tambahan S2 dan S3).

2.4. Homolog Struktur Lain LhKNOT Juga Mengandungi Motif Klip CPC

Kehadiran klip CPC dalam kedua-dua LhKNOT dan homolog strukturnya daripada Pereskia bleo (pB1) mencadangkan kemungkinan pemuliharaan klip CPC yang lebih luas dalam keluarga knottin. Analisis 21 homolog struktur rapat LhKNOT dengan PDB yang diselesaikan secara eksperimen dalam pangkalan data KNOTTIN mendedahkan bahawa, dalam setiap kes, peptida mempunyai motif klip CPC. Bagi kebanyakan peptida (cth, T. tridentatus), parameter motif menyimpang kurang daripada 1Å daripada lipatan knottin teras, manakala bagi yang lain (cth, knottin yang menyinggung), sisihan adalah sehingga margin 3Å (Jadual Tambahan S5). Begitu juga, protein knottin yang dimodelkan daripada homolog yang dikenal pasti menunjukkan bahawa hampir kesemuanya memiliki klip CPC.

Enam belas jujukan tambahan daripada L. heteroatom, 22 jujukan daripada L. boulardi, dan 8 jujukan daripada Ganaspis spp., tanpa struktur 3D yang diketahui, telah dimodelkan dan dianalisis untuk kehadiran motif klip CPC. Walaupun 13 daripada 16 knottin L. heteroatom diduga dan 2{10}} daripada 22 knottin L. boulardi diduga mendedahkan motif klip CPC, semua jujukan Ganaspis mengandungi klip CPC (Jadual Tambahan S5). Menariknya, tujuh homolog yang tidak mempamerkan motif klip CPC tergolong dalam (a) jujukan kumbang debunga biasa (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) jujukan kulat R. necatrix (A0A1S8A723), dan (c) tiga L. heterotoma knottins 4,5,6 dan L. boulardi knottins 3 dan 20 (Jadual Tambahan S5).

Tinjauan knottin dalam pangkalan data KNOTTIN, tidak berkaitan dengan LhKNOT, tetapi mewakili pelbagai takson (siput kon, ketam ladam, serangga, tumbuhan, kala jengking dan labah-labah), menunjukkan motif klip CPC. Dalam semua kes, profil elektrostatik permukaan motif klip CPC dicas secara positif, berkemungkinan besar, untuk memudahkan interaksi dengan heparin bercas negatif (Rajah 4). Walau bagaimanapun, sama dengan knottin kumbang, kulat dan tebuan yang diterangkan di atas, klip CPC tidak dikenal pasti dalam knottin daripada siklotida tumbuhan dan span (Jadual Tambahan S5).

Rajah 4. Keputusan dok heparin dan elektrostatik permukaan (A) peptida antikulat Phytolacca americana (PFAP-s; tumbuhan; PDB: 1DKC), (B) saluran kalsium omega-agatoxin terpilih Agelenopsis aperta (Omega-agatoxin IV-A ; labah-labah; PDB: 1IVA), (C) peptida antikulat Acrocinus longimanus (Alo-3; kumbang; PDB: 1Q3J), (D) peptida penyembuhan luka Pereskia bleo (pB1; kaktus; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) peptida antikulat "Drosomycin" daripada Drosophila spp. (Drosomycin; lalat; PDB: 1MYN), (G) Conotoxin GS (Conotoxin GS; siput kon; PDB:1AG7), (H) peptida antimikrobial Tachystatin A yang diasingkan daripada ketam Horseshoe (Tachystatin A; ketam ladam; PDB:1CIX) dan (I) Chlorotoxin, toksin kala jengking kecil Leiurus quinquestriatus (Chlorotoxin; kala jengking; PDB:1CHL) menunjukkan motif klip CPC kationik. Angka berorientasikan untuk memaparkan terbaik struktur klip CPC. Potensi elektrostatik permukaan digredkan warna daripada −4 kT/e (merah) kepada tambah 4 kT/e (biru).

2.5. Dalam Analisis Mutasi Siliko Klip CPC LhKNOT Mendedahkan Klip CPC Sekunder

Model tiga mutan LhKNOT dalam silico (R1A, S3A, R14A) telah disiasat untuk membandingkan interaksi mengikat jenis liar dan protein mutan. Dalam kes mutan R14A, heparin ditunjukkan secara mengejutkan dikaitkan dengan klip CPC sekunder yang melibatkan residu R1, S3, dan R30 dan bukannya motif R1, S3, dan R14 dalam jenis liar (Tambahan Rajah S4). Mutan berganda atau tiga kali ganda (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A), bagaimanapun, tidak menunjukkan interaksi dengan mana-mana sisa motif klip CPC primer atau sekunder (Rajah Tambahan S4C, D).

Mutan dalam siliko dengan mutasi R1A (mengganggu kedua-dua motif klip CPC primer dan sekunder), bagaimanapun, menunjukkan heparin yang dikaitkan dengan R29 dan R30, kerana ia menyediakan satu-satunya permukaan kationik yang tinggal (Tambahan Rajah S4C, D). Menariknya, ligan lebih suka mengaitkan dengan motif klip CPC, dalam kes klip primer dan sekunder, di atas permukaan kationik tambahan ini apabila motif tersedia, mencadangkan interaksi khusus klip CPC mungkin membenarkan perkaitan yang lebih stabil. interaksi elektrostatik bukan spesifik.

For more information:1950477648nn@gmail.com