Autophagy Bergantung ATG16L yang terjejas Menggalakkan Fibrosis Interstisial Renal dalam Disfungsi Graft Renal Kronik Melalui Induksi EndMT Oleh Laluan Isyarat NF-kB
Mar 18, 2022
Zeping Gui1,2†, Chuanjian Suo1†, Zijie Wang 1†, Ming Zheng1, Shuang Fei1, Hao Chen1, Li Sun1, Zhijian Han1, Jun Tao1, Xiaobin Ju1, Haiwei Yang1, Min Gu2*dan Ruoyun Tan1*
Kronikbuah pinggangdisfungsi rasuah (CAD) disebabkan oleh pelbagai faktor, termasuk sklerosis glomerular, inflamasi, fibrosis interstisial, dan atrofi tiub (IF/TA). Walau bagaimanapun, elemen yang paling menonjolCADialah IF/TA. Kajian kami telah mengesahkan bahawa peralihan endothelial-mesenchymal (EndMT) adalah sumber penting untuk allograft IF/TA. Ciri EndMT ialah kehilangan penanda endothelial dan pemerolehan fenotip mesenchymal atau fibroblastik. Autophagy ialah laluan degradasi intraselular yang dikawal oleh protein berkaitan autophagy dan memainkan peranan penting dalam banyak keadaan fibrotik. Walau bagaimanapun, sama ada autophagy menyumbang kepada fibrosis atau tidakbuah pinggangallograft dan bagaimana mekanisme sedemikian berlaku masih tidak jelas. Autophagy related 16 like gen (ATG16L) ialah gen berkaitan autophagy (ARG) kritikal yang diperlukan untuk pembentukan autophagosome. Di sini, kami mula-mula menganalisis tisu pesakit pemindahan buah pinggang daripada set data Gene Expression Omnibus (GEO) dan 60 pesakit pemindahan dari pusat kami. Penerima dengan fungsi buah pinggang yang stabil ditakrifkan sebagai bukanCADkumpulan dan semua pesakit diCADkumpulan telah didiagnosis secara histopatologiCAD. Keputusan menunjukkan bahawa ATG16L, sebagai satu ARG pembezaan yang ketara, kurang dinyatakan dalamCADkumpulan berbanding kumpulan bukan CAD. Tambahan pula, kami mendapati terdapat lebih sedikit autofagosom dan autolisosom dalam buah pinggang yang dipindahkanCADpesakit, dan downregulation autophagy adalah faktor prognostik yang lemah. In vitro, kami mendapati bahawa kejatuhan ATG16L meningkatkan proses EndMT dalam manusiabuah pinggangsel endothelial glomerular (HRGECs). Dalam vivo, perubahan EndMT dan autofagik fluks kemudiannya dikesan dalam tikusbuah pinggangmodel pemindahanCAD. Kami menunjukkan kejadian EndMT dan menunjukkan bahawa banyaknya ATG16L disertai dengan perubahan fluks autofagik dinamik di sepanjang peringkat pemindahan buah pinggang yang berbeza. Secara mekanikal, ketukan ATG16L, khususnya dalam sel endothelial, mengurangkan degradasi NF-kB dan mengeluarkan sitokin inflamasi (IL-1b, IL-6, dan TNF-a), yang boleh memudahkan EndMT. Kesimpulannya, fluks autofagik yang bergantung kepada ATG16L yang disebabkan oleh pemindahan menunjukkan peningkatan kehilangan progresif dari semasa ke semasa.
Sitokin radang daripada proses ini menggalakkan EndMT, dengan itu membawa kepada perkembanganCAD. ATG16L berfungsi sebagai pengawal selia negatif EndMT dan pembangunanbuah pinggangfibrosis cantuman, dan autophagy boleh diterokai sebagai sasaran terapeutik yang berpotensi untuk disfungsi cantuman buah pinggang kronik.
Kata kunci:disfungsi cantuman buah pinggang kronik, buah pinggangfibrosis celahan, ATG16L, autophagy, EndMT, sitokin radang
Untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com
PENGENALAN
buah pinggangpemindahanadalah salah satu rawatan optimum untuk pesakit uremia kerana ia meningkatkan kualiti hidup mereka dengan ketara (1). Walau bagaimanapun, terdapat bilangan disfungsi allograft buah pinggang yang agak tinggi selepas pemindahan disebabkan oleh kemerosotan progresif kronik fungsi buah pinggang, yang merupakan faktor utama yang mempengaruhi kemandirian jangka panjang buah pinggang yang dipindahkan (2). Disfungsi cantuman buah pinggang kronik (CAD), dahulunya dikenali sebagai nefropati allograft kronik, adalah keadaan multifaktorial yang dikaitkan dengan fibrosis interstisial buah pinggang yang progresif. Pelbagai faktor diketahui menyumbang kepada kehilangan fungsi allograft buah pinggang, termasuk, tetapi tidak terhad kepada, penolakan akut dan kronik, iskemia dan reperfusi proses inflamasi dan pembinaan semula tisu, dan nefrotoksisiti berkaitan dadah (3).
CADSecara morfologi dicirikan oleh keradangan, fibrosis interstisial progresif dan atrofi tiub (IF/TA), dan sklerosis glomerular (4). Antaranya, IF/TA adalah faktor utama yang menentukan fungsi allograft buah pinggang, tetapi mekanisme yang ia berlaku masih tidak diketahui. Beberapa faktor telah dikenalpasti menyumbang kepada kadar kehilangan allograft buah pinggang yang tinggi. Dalam kajian terdahulu kami, kami juga mengesahkan bahawa proses patologi utama CAD adalah allograft buah pinggang IF/TA, yang dicirikan oleh pemendapan berlebihan matriks ekstraselular dalam tisu tubular dan interstisial renal yang dipindahkan (5). Kajian telah mengesahkan bahawa kolagen terutamanya dirembeskan oleh myofibroblas, dan rembesan kolagen membawa kepada pemendapan matriks ekstraselular dan seterusnya pemindahan buah pinggang IF/TA. Terdapat empat sel utama yang terlibat dalam pembentukan miofibroblas: sel epitelium, sel endothelial, fibroblas yang berasal dari sumsum tulang, dan perisit mikrovaskular (6, 7). Mereka memainkan peranan penting dalam membaiki dan melindungi integriti tisu buah pinggang. Antaranya, rangsangan luar membolehkan pembezaan sel buah pinggang intrinsik seperti sel epitelium kepada miofibroblas, yang boleh menghasilkan matriks ekstraselular. Proses ini dipanggil peralihan epithelial-to-mesenchymal (EMT). EMT biasanya melibatkan tiga jenis: (I) embriogenesis, (II) pembaikan tisu dan fibrosis, (III) metastasis (8). Beberapa kajian telah dilakukan untuk menjelaskan mekanisme molekul dan selular EMT jenis II dalam fibrosis organ (9, 10), walau bagaimanapun, peranan EMT dalam proses penjanaan fibroblas primer yang berbeza semasa perkembangan CAD masih tidak dapat disimpulkan.
Dengan pemindahan buah pinggang, sentiasa terdapat peningkatan kemungkinan kerosakan pada makro dan mikrovaskular allograf, disebabkan oleh lokasi fizikal endothelium allograft yang menjadikannya sasaran awal pilihan untuk kecederaan allograft (11). Allograf bertindak sebagai sasaran berpotensi untuk tindak balas imun yang dimediasi oleh sejumlah besar sitokin inflamasi serum. Kajian menunjukkan bahawa banyak sitokin inflamasi yang terlibat dalamCADproses (12) dan sel endothelial di tapak allograf buah pinggang bukan sahaja peserta dalam keradangan tetapi juga pengawal selia keradangan (11). Penyelidikan kami sebelum ini mendedahkan bahawa TNF‐a lebih banyak dinyatakan dalamCADkumpulan daripada kumpulan bukan CAD. TNF‐a juga memudahkan proses EMT dalam sel tiub proksimal manusia (HK2) (13). Memandangkan hubungan intim antara sel-sel endothelial dan darah, sel-sel inflamasi yang beredar dan sitokin akan mula-mula menyerang endotel allograf. Rangsangan kronik daripada sitokin radang membawa kepada sel endothelial yang mengalami gangguan struktur sel dan persekitaran dalaman, yang mengakibatkan kecederaan endothelial. Kajian baru menunjukkan bahawa kecederaan endothelial menyumbang kepada pemendapan matriks ekstraselular dan memainkan peranan penting dalam penyakit fibrosis organ. Baru-baru ini, peralihan Endothelial-to-mesenchymal (EndMT) dianggap sebagai punca utama kecederaan endothelial dan menggalakkan kemajuan IF/TA semasa penyakit fibrosis buah pinggang (5, 9). EndMT ialah jenis EMT yang tersendiri. Ia dicirikan oleh sel-sel yang secara beransur-ansur kehilangan penanda endothelial, seperti CD31 dan CD34, dan mendapat fenotip mesenchymal atau myofibroblastic, seperti a-smooth muscular actin (a-SMA), kolagen I, dan fibronektin (FN). Mekanisme kawal selia untuk EndMT kekal sebagai isu yang kompleks. Kejadian EndMT boleh dipengaruhi oleh banyak faktor seperti tekanan oksidatif, hipoksik, dan pelbagai kecederaan (14, 15). Tetapi hampir semua faktor pengawalseliaan ini akhirnya bersatu dalam satu tindakan langsung, iaitu sitokin inflamasi. Dalam kajian terdahulu kami, kami menunjukkan bahawa EndMT adalah faktor penting dalam patogenesis IF / TA dan CAD melalui laluan isyarat TGF-b / Smad (5). Di samping itu, masih ulama lain mencadangkan bahawa ekspresi TGF-b dikawal selia oleh TNF-a (16). Jadi, sitokin inflamasi seperti TNF-a mungkin juga merupakan faktor patogenik yang penting dalam kecederaan endothelial vaskular yang mencirikan perkembangan CAD. Walaupun faktor awal EndMT berbeza dalam pelbagai persekitaran mikro, hasil akhir adalah sama. Oleh itu, sudah memadai untuk membuat hipotesis bahawa mesti ada mekanisme pengawalseliaan pusat dalam pengeluaran sitokin inflamasi dan perkembangan EndMT.
Autophagy ialah laluan selular yang bertanggungjawab terhadap degradasi protein dan organel (17). Proses autophagy juga dikenali sebagai fluks autofagik, dan kekuatan proses ini sering mewakili tahap pengaktifan autophagy. Autophagy terlibat dalam proses patofisiologi buah pinggang yang berbeza, termasuk glomerulosklerosis, nefropati diabetik, dan penyakit buah pinggang sista (18). Beberapa kajian melaporkan bahawa autophagy adalah proses sitoprotektif. Pertahanan klasik untuk anggapan ini adalah seperti yang dilihat pada tikus dengan pemadaman ATG5 tubul proksimal di mana pemadaman menggalakkan fibrosis buah pinggang yang lebih teruk akibat autophagy terjejas (19). Kajian lain juga mendapati bahawa sel epitelium tubul proksimal knockdown bersyarat ATG5 memburukkan kecederaan buah pinggang akut pada peringkat awal, tetapi memperlahankan perkembangan fibrosis buah pinggang dalam proses pemulihan atau pembaikan (20). Walau bagaimanapun, interaksi khusus antara autophagy dan EMT atau EndMT pada penyakit fibrosis masih kekal kontroversi. Beberapa kajian mencadangkan bahawa perencatan autophagy boleh menyebabkan EMT dan fibrosis dengan menjejaskan crosstalk epitelial–fibroblast yang menyimpang dalam fibrosis pulmonari idiopatik (21). Yang lain menunjukkan bahawa Rapamycin menggalakkan EndMT melalui pengaktifan autophagy semasa penuaan pramatang (22). Gen ATG16L terutamanya termasuk ATG16L1 dan ATG16L2. ATG16L2 homo- dan hetero-oligomerizes dengan ATG16L1. Tetapi ATG16L2 kurang dikaitkan dengan autophagy (23). ATG16L1 telah dikenal pasti sebagai gen berkaitan autophagy yang penting, menggalakkan pembentukan autophagosome pada membran plasma, dan memainkan peranan penting dalam bentuk lipidated LC3 (23). Di sini, ATG16L1 secara kolektif dirujuk sebagai ATG16L. Sebagai faktor utama dalam autophagy, ATG16L pernah dilaporkan yang berkaitan dengan patogenesis beberapa penyakit inflamasi. Sebagai contoh, mutasi ATG16L memberikan kecenderungan yang kuat kepada perkembangan penyakit Crohn (24). Walau bagaimanapun, mekanisme tindakan ATG16L dan autophagy belum lagi dikaji dengan baik dalam pendekatan yang disasarkan seperti dalam pengurusan dan prognostik pemindahan buah pinggang. Jadi peranan dinamik fluks autofagik dan autophagy yang bergantung kepada ATG16L mesti menjadi tumpuan penyelidikan untuk terapeutik yang berpotensi dalam perkembangan CAD.
Dalam kajian ini, kami meneroka potensi peranan autophagy yang bergantung kepada ATG16L dalam perkembangan CAD. Kami mendedahkan bahawa kehilangan ATG16L dan autophagy dikaitkan dengan kejadian EndMT dalam pesakit CAD klinikal dan tikus pemindahan buah pinggang. Kami kemudian mendapati bahawa tahap EndMT dan fibrosis interstisial allograft buah pinggang telah dipertingkatkan selepas mengubah aktiviti autophagy dengan merobohkan gen ATG16L. Di samping itu, mekanisme asas yang berpotensi juga diterokai oleh penjujukan RNA, kami mendapati bahawa kemerosotan ATG16L menyumbang kepada pengaktifan laluan faktor nuklear-kB (NF-kB) dan rembesan sitokin inflamasi, kemudian menggalakkan perkembangan EndMT.
BAHAN DAN KAEDAH
Pernyataan Etika
Protokol kajian itu mematuhi Deklarasi Helsinki dan Istanbul. Kajian manusia telah diperiksa dan diberi kuasa oleh jawatankuasa etika tempatan Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Nanjing (ID: IACUC-2010020). Persetujuan termaklum diperoleh daripada semua penerima pemindahan serta pesakit nefrektomi yang disertakan dalam penyelidikan ini.
Kajian yang melibatkan tikus telah diperiksa dan diberi kuasa oleh jawatankuasa etika tempatan Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Nanjing (ID: IACUC-2010020). Persetujuan bertulis bertulis diberikan oleh pemilik untuk penyertaan haiwan mereka dalam penyelidikan ini.
Koleksi Contoh
Sixty of adults who had received living or deceased donor kidney transplants started to be followed up from January 2010 to December 2017 at First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Patients with serum creatinine level consistently < 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least 12 months after kidney transplantation and no other complications such as episodes of significant rejection, drug toxicity injury, and infection were assigned to the non-CAD group. Patients in the CAD group were defined as elevated serum creatinine greater than or equal to 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least three months, and they were diagnosed by two independent pathology experts combined with biopsy results, laboratory indexes, and imaging features. Adjacent normal kidney tissues were obtained from regions outside the tumor margin (>5cm) pada pesakit dengan operasi nefrektomi radikal. Sampel darah diperolehi selepas pesakit telah memberikan persetujuan termaklum. Langkah khusus boleh dirujuk dalam kajian terdahulu kami (5). Ciri-ciri asas pesakit dalam kumpulan CAD dan kumpulan bukan CAD adalah seperti ditunjukkan dalam Jadual 1.
Tikus dan Model Haiwan
Tikus jantan dewasa F344 dan Lewis (Berat 250 ± 10.3 g) diperolehi dari Charles River Laboratories (Beijing, China) dan mematuhi garis panduan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi di Universiti Perubatan Nanjing. Haiwan itu dikendalikan mengikut norma Universiti Perubatan Nanjing dan garis panduan yang diterbitkan oleh Institut Kesihatan Nasional AS.
Kesemua haiwan ini mengalami pemindahan buah pinggang kiri ortotopik. Tikus Lewis digunakan sebagai penerima dan penderma syngeneik (kumpulan Syn), tikus F344 sebagai penderma alogenik (kumpulan Allo). Buah pinggang kanan dipotong serentak. Purata masa iskemia sejuk adalah kurang daripada 20 minit dan iskemia hangat adalah kurang daripada 35 minit. Cyclosporine A (5 mg/kg, QD, IP; Neoral, Novartis, Switzerland) digunakan selama 14 hari untuk mengelakkan penolakan akut,
Rawatan Farmaseutikal dan Penuaian Tisu
Buah pinggang pemindahan daripada tikus dituai pada minggu ke-4, 8, 12, dan 16 selepas pembedahan. Spesimen tisu allograft buah pinggang yang dibenamkan parafin formalin (10 peratus formalin neutral) telah diperolehi untuk pewarnaan histologi dan IHC/IF. Baki buah pinggang disimpan pada peti sejuk − 80 darjah untuk pengesanan RNA dan protein.
HE dan Masson Trichrome Staining Assay
Protokol ujian pewarnaan HE dan Masson trichrome boleh dirujuk dalam kajian terdahulu kami (5). Untuk mengenal pasti keterukan CAD dan keluasan kawasan fibrotik, kawasan fibrosis allograf renal dikira dengan pewarnaan trichrome Masson. Bagi setiap kepingan, lima medan visual rawak di bawah × 400 mikroskop telah dipilih. Kawasan positif untuk trichrome Masson diukur oleh dua ahli patologi yang buta terhadap reka bentuk eksperimen menggunakan Image‐Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD).
Ujian Pewarnaan Imunohistokimia
Tisu buah pinggang yang diikat dengan formalin dipotong kepada bahagian parafin setebal 3 mm. Proses deparafin, terhidrat, dan pengambilan antigen adalah konsisten dengan kajian terdahulu kami (5). Antibodi [anti-ATG16L (1:100; Abcam, Amerika Syarikat), anti-a- SMA (1:200; Abcam, Amerika Syarikat), anti-Fibronectin (1:100; Abcam, Amerika Syarikat) dan anti-CD31 (1:100; CST, USA)] telah diinkubasi semalaman pada 4 darjah selepas bahagian disekat dengan 10 peratus serum keldai biasa. Langkah seterusnya juga dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini dengan IgG anti-tikus/arnab kambing terbiotinilasi (0.5 mg/mL;
Abcam) dan substrat 3-amino-9-etil karbazol atau 3,3′
diaminobenzidine (Makmal Vektor, Burlingame, CA). Slaid bernoda telah difoto menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 80i yang dilengkapi dengan kamera digital (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China).
Ujian Pewarnaan Imunofluoresensi Tidak Langsung
Selepas diikat dengan larutan formaldehid 4 peratus, bahagian allograft buah pinggang dan kepingan memanjat sel ditembusi dengan 0.1 peratus Triton X-100 selama 1 jam, kemudian disekat dengan 5 peratus serum kambing selama 1 jam. Selepas itu, bahagian dan kepingan memanjat sel diinkubasi dengan anti-NF-kB p65 (1:200; Abcam, Amerika Syarikat) pada 4 darjah semalaman. Keadaan inkubasi antibodi sekunder Dapi boleh merujuk kepada kajian terdahulu kami (5). Slaid telah dilihat dengan mikroskop pendarfluor Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China).
Pengesanan Fluks Autofagik
AAV-mRFP-GFP-LC3 (Hanbio, Shanghai, China) secara stereotaktik disuntik ke dalam buah pinggang kiri tikus Lewis (3 mL) 14 hari sebelum pemindahan. Buah pinggang dikeluarkan pada 4, 8, 12, 16 minggu selepas pemindahan dan difiksasi dengan 4 peratus paraformaldehid selama 24 jam. Slaid (30 mm) dilihat dengan mikroskop pendarfluor Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China). Tompok kuning menunjukkan autofagosom dan bintik merah menunjukkan autolysosom. Apabila isyarat merah lebih kuat daripada isyarat kuning mewakili fluks autofagik diaktifkan. Apabila lebih banyak isyarat kuning daripada isyarat merah mewakili fluks autofagik terjejas.
Mikroskopi Elektron
Sampel telah dibetulkan dengan glutaraldehid sejuk ais (3 peratus dalam 0.1 M penampan cacodylate, pH 7.4) dan selanjutnya diproses oleh Kemudahan Teras (Perkhidmatan, Wuhan, China). Pemerhatian dilakukan pada mikroskop elektron penghantaran JEOL JEM-2100.
Pengesanan Fungsi Renal
Kami menggunakan Kit Ujian Kreatinin QuantiChrom tikus dan Kit Ujian Urea QuantiChrom (Jiancheng, Beijing, China) untuk mengesan kepekatan kreatinin darah tikus dan nitrogen urea mengikut arahan pengilang.
Pengesanan Protein Uria
Sampel air kencing 24 jam dikumpul menggunakan sangkar metabolik, dan perkumuhan protein kencing diuji dengan kit komersial (Mlbio, Shanghai, China) mengikut arahan pengeluar.
Penilaian PCR Masa Nyata
Secara ringkas, jumlah RNA telah disucikan daripada HRGEC menggunakan kit pengekstrakan RNA (TIANGEN, Beijing, China). cDNA (cDNA) telah disintesis seperti yang diterangkan sebelum ini (5). Ekspresi gen diukur dengan ujian PCR masa nyata (Vazyme) dan Sistem Optikon Enjin DNA 2 (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Urutan primer diterangkan seperti berikut:
IL-1 b: 5′‐ TCCTGTTGTCTACACCAATGC‐3′ (F) 5′‐CGGGCTTTAAGTGAGTAGGAGA‐3′ (R);
IL-6: 5′‐TCTCTCCGCAAGAGACTTCCA‐3′ (F)
5′‐ ATACTGGTCTGTTGTGGGTGG‐3′ (R);
TNF-a: 5′‐ CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG‐3′ (F) 5′‐ GAGGACCTGGGAGTAGATGAG ‐3′ (R);
Aktin: 5′‐ TGACGTGGACATCCGCAAAG‐3′ (F) 5′‐ CTGGAAGGTGGACAGCGAGG‐3′ (R);
Western Blot dan Elisa Assay
Secara ringkas, protein daripada sel dan tisu telah diekstrak dalam penimbal RIPA (Thermo ScientificTM, Chelmsford, MA, USA) yang mengandungi koktel perencat fosfatase dan protease (Sigma, St Louis, MO, Amerika Syarikat). Protein (20 mg) telah dipindahkan ke membran PVDF (Millipore, IPVH00010, Massachusetts, Amerika Syarikat) selepas SDS-PAGE. Slaid telah diinkubasi dalam larutan penyekat (5 peratus susu bukan lemak) selama 60 minit, dan kemudian membran PVDF diinkubasi dengan antibodi primer tanpa mencuci di dalam bilik sejuk semalaman. Selepas itu, proses mencuci membran PVDF oleh penimbal tris buffered saline-tween (TBST), diinkubasi oleh antibodi sekunder, tablet ECL, dan terdedah adalah konsisten dengan kajian terdahulu kami (5). Antibodi utama disenaraikan seperti berikut: anti-GAPDH (1:1000; CST, USA), anti-CD31 (1:1000; CST, USA), anti-a-SMA (1:1000;
Abcam, Amerika Syarikat), anti-fibronektin (1:1000; BD Biosciences, Amerika Syarikat),
anti-LC3 (1:1000; CST, USA), anti-ATG16L (1:1000; CST, USA),
anti‐NF-kB p65 (1:1000; CST, USA), anti‐ Phospho-NF-kB p65 (1:1000; CST, USA). Pengukuran dilakukan dengan mengukur keamatan isyarat dengan bantuan perisian analisis imej NIH. MAP1LC3 dikesan menggunakan kit ELISA (ml000829, Mlbio, China) mengikut arahan pengilang.
Kultur Sel, Rawatan dan Transfeksi shRNA
Sel endothelial glomerular renal manusia (HRGECs) telah dibiakkan dalam medium sel Endothelial (ECM, ScienCell Research Laboratories Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) yang mengandungi 5 peratus serum lembu janin. Persediaan Peralatan HRGEC Kultur Inkubator CO2 dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2 pada 37 darjah. Sel endothelial dipelihara dalam medium bebas serum semalaman dan kemudian dirawat dengan IL-1b, IL-6, dan TNF‐a untuk jam yang berbeza atau kepekatan yang berbeza.
HRGECs stabil ATG16L-knockdown dan ATG16L- overexpression telah dibina menggunakan lentivirus (Jikai, Shanghai, China). HRGEC mula-mula ditransfeksi dengan lipofectamine 2000, kemudian ditransfeksi dengan 1.5 mL ATG16L virus shRNA atau 2.0 mL ATG16L virus mengekspresi berlebihan mengikut protokol pengeluar. Sel-sel endothelial kemudian ditukar ke dalam ECM yang mengandungi 2.0 mL polybrene dan diinkubasi selama 6 jam tambahan. Kami mengesan kadar jangkitan virus dengan mikroskop pendarfluor Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1, Nikon, Shanghai, China). Puromycin (2 µg/mL; Gibco, Thermo Fisher Scientific) digunakan untuk memilih sel yang dijangkiti virus yang stabil. Selepas itu, HRGEC dikumpulkan untuk eksperimen selanjutnya.
Analisis statistik
GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) telah digunakan untuk analisis statistik. Keputusan dinyatakan sebagai min ± SD (min ± SD) daripada sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Perbandingan antara dan dalam beberapa kumpulan dilakukan menggunakan analisis varians sehala diikuti oleh ujian Student-Newman-Keuls. nilai P bagi<0.05 were="" considered="">
KEPUTUSAN
Perubahan Histomorfologi dan Patologi dalam Tisu Buah Pinggang Daripada Pesakit Bukan CAD dan CAD
Dalam kajian ini, pemeriksaan histologi dengan hematoxylin-eosin (HE) dan pewarnaan trichrome Masson menunjukkan allograft buah pinggang IF/TA yang ketara dalam tisu pesakit CAD (n=4) berbanding pesakit yang dipindahkan buah pinggang dengan fungsi buah pinggang yang stabil dari pusat kami ( kumpulan bukan CAD, n=4) (Rajah 1A, B). Koleksi sampel bahan dan kaedah dan Jadual 1 menerangkan maklumat kumpulan terperinci untuk ciri asal. Pewarnaan imunohistokimia (IHC) sampel biopsi buah pinggang manusia menunjukkan ekspresi a-SMA, dan fibronektin (FN) yang lebih tinggi, dan kurang ekspresi CD31 dalam kumpulan CAD (Rajah 1C-H). CD31 ialah protein penanda sel endothelial, dan sel endothelial kehilangan ciri CD31 tetapi memperoleh ciri mesenkim seperti a‐SMA, FN apabila EndMT berlaku. Keputusan ini menunjukkan bahawa ungkapan penanda EndMT adalah lebih tinggi dalam kumpulan CAD berbanding kumpulan bukan CAD.
ATG16L Dinaikkan Selepas Pemindahan Buah Pinggang, tetapi ATG16L Telah Dikurangkan dalam Pesakit CAD Berbanding dengan Pesakit Bukan CAD
RNA-seq dan data klinikal daripada 25 sampel CAD dan 21 sampel tisu biopsi buah pinggang pesakit bukan CAD telah dimuat turun daripada GSE9493. Maklumat pesakit dalam pangkalan data telah didaftarkan di Novartis Institutes for BioMedical Research, Switzerland, dan diproses untuk histopatologi. Diagnosis histologi dan klasifikasi biopsi berdasarkan kriteria Banff '05. Data demografi dan klinikal disediakan dalam pangkalan data GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE9493). Gambarajah skematik aliran analisis adalah seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A. Terdapat 1463 gen pembezaan yang ketara telah diekstrak dengan nilai P<0.05. using="" the="" criteria="" for="" [log2="" fold="" change="" (log2fc)]=""> 1, we selected 92 up-regulated and 115 down-regulated differential genes from the CAD group compared to the non-CAD group (Figure 2B). Then we searched genes associated with autophagy in the GeneCards database. A total of 149 ARGs with a relevance score >7 telah dipilih. Terdapat 14 ARG termasuk dalam ARG pesakit CAD dan bukan CAD. Antaranya, kami mendapati bahawa ATG16L yang mendapat gen skor perkaitan tertinggi telah dikurangkan dalam sampel CAD (Rajah 2C).
Untuk mengelakkan kesan kelompok dan perbezaan populasi, kami melakukan satu siri eksperimen menggunakan spesimen manusia dari pusat kami untuk mengesahkan keputusan pangkalan data awam. Dalam set pertama, kami mewarnai bahagian sampel buah pinggang normal, bukan CAD, dan CAD dengan antibodi anti-ATG16L, dan menunjukkan bahawa ekspresi ATG16L berkurangan dengan ketara dalam pesakit CAD berbanding kumpulan bukan CAD (Rajah 2E) . Kesimpulan yang sama dicapai oleh ujian western blot(WB). Peningkatan FN mewakili tahap fibrosis yang teruk pada buah pinggang pemindahan dan salah satu penunjuk CAD. Kecenderungan WB ATG16L adalah bersesuaian dengan keputusan pengesahan noda IHC kami dan konsisten dengan keputusan dalam GEO (Rajah 2D). Ini mencadangkan bahawa ekspresi ATG16L sebaliknya dikurangkan dengan perkembangan CAD. Apabila melakukan analisis korelasi Pearson, kami mendapati bahawa ATG16L mempunyai korelasi negatif yang kuat dalam corak ekspresi a-SMA, protein FN dan korelasi positif dengan ekspresi CD31. 'r' mewakili nilai korelasi Pearson dan nilai P menandakan kepentingan korelasi (Rajah 2F–I).
Autophagy Telah Dikurangkan dalam Pesakit CAD, dan Pengurangan MAP1LC3 Meramalkan Prognosis Buruk dalam Pesakit CAD
Dalam percubaan sebelumnya, beberapa ARG yang mengawal autophagy telah dikenal pasti daripada pangkalan data GEO. Antaranya, ATG16L terlibat dalam langkah awal autophagy, kami membuat spekulasi tentang kemungkinan autophagy boleh terlibat dalam CAD. Untuk mengkaji tahap autophagy dalam tisu allograft buah pinggang manusia, kami mula-mula mendapati lebih sedikit vakuol autofagik dalam kumpulan CAD melalui mikroskop elektron penghantaran (TEM), berbanding kumpulan bukan CAD (Rajah 3A, B). Selain TEM standard emas untuk memantau autophagy, penurunan tahap SQSTM1 dan peningkatan ekspresi LC3-II mencerminkan peningkatan autophagy. Aliran serupa tahap ekspresi protein LC3-I (bukan lipidasi LC3), LC3-II (lipidasi LC3) dan SQSTM1 dalam kumpulan CAD telah disahkan oleh ujian WB seperti ditunjukkan dalam Rajah 3C, D. P62/SQSTM1 (SQSTM1) ialah reseptor autophagy terpilih dan didegradasi oleh autophagy. Autofagosom dikaitkan dengan lipidasi bentuk sitosolik LC3 dan pembentukan LC{16}}II. Oleh itu, keputusan WB juga mencadangkan bahawa autophagy berlaku.
Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa terdapat perbezaan ARG dalam serum pesakit pemindahan buah pinggang; Tahap LC3 serum mungkin merupakan penunjuk prognostik yang dikaitkan dengan keterukan penyakit (25, 26). Untuk meneroka lebih lanjut peranan autophagy dalam perarakan CAD, kami memeriksa kepekatan LC3 serum 30 pesakit bukan CAD dan 30 CAD oleh ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA). Data demografi yang membentangkan ciri asas pesakit adalah dalam Jadual 1. Taburan nombor kes, jantina pesakit, umur pesakit, antibodi panel reaktif (PRA), rejimen imunosupresif, fungsi buah pinggang bagi kumpulan bukan CAD dan CAD adalah seperti yang ditunjukkan. dalam Jadual 1. Jantina, umur dan PRA tidak menunjukkan perbezaan yang besar. Terdapat perbezaan yang ketara dalam kreatinin serum dan nitrogen urea darah (BUN) antara kedua-dua kumpulan. Kemudian, kami cuba menentukan nilai prognostik autophagy dalam pesakit CAD. Melalui keputusan ELISA serum, kami mendapati bahawa ekspresi LC3 lebih rendah dalam kumpulan CAD. Terdapat juga CAD progresif dan penurunan serentak dalam tahap LC3 (Rajah 3E). Di samping itu, kami membahagikan LC3 kepada kumpulan ekspresi tinggi dan rendah berdasarkan median, analisis survival, keputusan menunjukkan kumpulan ekspresi rendah LC3 mempunyai masa disfungsi allograf yang lebih pendek (Rajah 3F). Secara keseluruhannya, kami membuat spekulasi bahawa kekurangan autophagy mempunyai hubungan yang signifikan dengan perkembangan CAD.
Downregulation of ATG16L Reduced Autophagy and Promoted Progression of EndMT
Untuk menentukan sama ada ATG16L terlibat dalam perubahan autophagy, kami mula-mula mengalihkan HRGEC dengan RNA jepit rambut pendek ATG16L (shRNA). TEM digunakan untuk secara langsung menunjukkan pembentukan vakuol autofagik dan kami mendapati bahawa terdapat lebih sedikit vakuol autofagik dalam sel yang ditransfeksi ATG16L shRNA berbanding dengan yang ditransfeksi dengan scramble shNC (Rajah 4A, B). Kedua-dua ekspresi protein ATG16L dan aktiviti autophagy juga dikurangkan dalam merobohkan kumpulan ATG16L berbanding dengan kumpulan shNC (Rajah 4C).
Peranan autophagy yang bergantung kepada ATG16L dalam perkembangan EndMT kemudiannya disiasat. HRGEC telah ditransfeksi dengan ATG16L shRNA atau shNC. Rajah 4D menunjukkan bahawa pemindahan shRNA ATG16L dapat memudahkan ekspresi FN dan a-SMA dengan ketara dan mengurangkan ekspresi CD31 berbanding HRGEC yang ditransfeksi shNC berebut. Sebaliknya, apabila ATG16L diekspresikan secara berlebihan dalam HRGEC, perkembangan EndMT tidak dipromosikan dengan ketara (Rajah 4E). Keputusan pewarnaan IHC juga mengesahkan trend WB untuk ekspresi CD31 dan a-SMA dalam HRGEC (Rajah 4F).
Perubahan Fibrosis Interstisial Renal, Protein Urin, Fungsi Buah Pinggang dan Peningkatan EndMT Bergantung pada Masa dalam Model Tikus Penolakan Kronik
Seterusnya, kami menyiasat perubahan dalam fibrosis interstisial buah pinggang, protein air kencing, fungsi buah pinggang, dan EndMT dalam vivo. Model penolakan kronik pemindahan buah pinggang tikus telah ditubuhkan melalui pemindahan buah pinggang daripada tikus F344 kepada tikus Lewis. Allograft buah pinggang diambil pada minggu 8, 12, dan 16 selepas pemindahan buah pinggang. Pewarnaan HE dan ujian pewarnaan Masson menunjukkan pelbagai tahap filtrasi sel inflamasi, glomerulosklerosis, atrofi tiub, dan fibrosis interstisial selepas pemindahan buah pinggang. Keputusan pewarnaan Masson juga menunjukkan sejumlah besar gentian kolagen berwarna biru dalam interstitium glomerular dan buah pinggang pada minggu 8, 12, 16 selepas pemindahan buah pinggang, berbanding dengan kumpulan syn (Rajah 5A–C). Untuk menguji fungsi buah pinggang tikus dengan pemindahan alogenik, buah pinggang kanan asli telah dilupuskan semasa pemindahan buah pinggang. Empat minggu selepas pemotongan buah pinggang kanan, protein air kencing 24 jam dan fungsi buah pinggang termasuk kreatinin serum dan BUN merosot secara beransur-ansur dalam semua kumpulan sehingga kematian mereka (Rajah 5D). Hasil ujian IHC mendedahkan ekspresi tinggi FN dan a-SMA manakala ekspresi CD31 berkurangan dalam semua kumpulan pada 16 minggu (Rajah 5E). Ujian Western blot mengesahkan hasil ujian imunohistokimia dan menunjukkan bahawa perkembangan EndMT dipergiatkan dengan lanjutan masa selepas pemindahan buah pinggang (Rajah 5F).
Pemindahan Buah Pinggang Autophagy Diaktifkan tetapi Fluks Autofagik terjejas dalam Peringkat Akhir Model Tikus Penolakan Kronik
LC3, yang dianggap sebagai penanda yang ditentukan untuk autophagy, adalah penting untuk pembentukan autophagosome dan pengaktifan fluks autofagik. Adeno-associated virus (AAV)-mRFP-GFP- LC3 disuntik ke dalam allograft buah pinggang tikus dalam vivo secara stereotaktik. Kami mencipta model mRFP-GFP-LC3 untuk memantau aktiviti autofagik dalam pemindahan buah pinggang. AAV- mRFP-GFP-LC3 biasanya digunakan untuk memantau fluks autofagik dalam vivo. Isyarat GFP mempunyai kepekaan yang lebih tinggi kepada keadaan berasid lumen lisosom daripada mRFP. Oleh itu, autofagosom menunjukkan pendarfluor kuning kerana lokasi bersama GFP dan pendarfluor mRFP menunjukkan dan autolysosom menunjukkan pendarfluor merah. Peningkatan pendarfluor merah menunjukkan pengumpulan autolisosom dan pengaktifan autophagy dalam buah pinggang. Kawasan positif pendarfluor merah meningkat dengan ketara pada minggu 4, 8,12, dan 16 dalam kumpulan allo berbanding dengan kumpulan syn. Walau bagaimanapun, puncta merah lemah dengan cepat selepas mencapai puncak pada 8 dan 12 minggu. Perubahan dalam tahap autophagy terutamanya diperhatikan dalam saluran kecil glomerular dan periferal, dan bukannya dalam tubulus distal atau saluran pengumpul (Rajah 6A, B). Keputusan ini mendedahkan bahawa autophagy telah diaktifkan pada peringkat awal pemindahan buah pinggang tetapi bukan peringkat akhir, dan pelepasan autophagosome telah terjejas selepas kira-kira 8 minggu. Ujian imunohistokimia menunjukkan bahawa ekspresi ATG16L lebih tinggi dalam 8 minggu daripada 16 minggu (Rajah 6C). Keputusan Western blot juga menunjukkan tahap LC3-II dan ATG16L memuncak pada 8 minggu, dan kemudian menurun secara beransur-ansur sehingga 16 minggu dalam buah pinggang allograft tikus selepas pemindahan (Rajah 6D).
Laluan NF-kB Telah Diaktifkan dan Dipromosikan EndMT Selepas Tumbangkan Ekspresi ATG16L
Memandangkan persatuan antara downregulation ATG16L dan EndMT dalam model tikus penolakan kronik dan penyakit CAD, kami membuat hipotesis bahawa kehilangan ATG16L secara langsung boleh membawa kepada perkembangan EndMT. Untuk meneroka lebih lanjut mekanisme potensi yang mana perkembangan ini berlaku, kami mula-mula melakukan penjujukan transkriptom total (RNA-seq) dalam HRGEC dengan ShNC atau ShATG16L. Sebanyak 453 gen pembezaan (DEGs) diperolehi antara kedua-dua kumpulan. Antaranya, 358 DEG telah dikawal selia dan 95 telah dikawal ke bawah (Rajah 7A). Kemudian 20 laluan telah dipilih dengan ketara oleh pengayaan KEGG. Kami mendapati bahawa laluan NF-kB adalah salah satu laluan yang telah diaktifkan dengan ketara (Rajah 7B). Penyelarasan gen laluan NF-kB juga disahkan oleh analisis pengayaan set gen (GSEA) (Rajah 7C).
NF-kB ialah salah satu faktor transkripsi penting untuk laluan isyarat radang, dan NF-kB akan translokasi dari sitoplasma ke nukleus apabila ia diaktifkan. Untuk mengesahkan pengaktifan NF-kB dan translokasi nuklear, kami melakukan ujian pewarnaan imunofluoresensi menggunakan antibodi anti-p65 dan mendapati p65 dan pewarna nuklear telah dikolokalisasikan yang menunjukkan translokasi nuklear (Rajah 7D). Di samping itu, kami mendapati bahawa QNZ, perencat laluan isyarat NF-kB, secara signifikan menghalang ekspresi NF-kB dalam nukleus, dan membalikkan ungkapan protein berkaitan EndMT yang disebabkan oleh kejatuhan ATG16L (Rajah 7E).
Ujian WB juga dijalankan untuk mengesahkan mekanisme spesifik pengaktifan laluan NF-kB. Kami mengesan kuantifikasi p65 (jumlah NF-kB) dan p-p65 (phosphorylated NF-kB) dalam HRGEC. Keputusan WB menunjukkan bahawa tahap p65 meningkat dalam kumpulan ShATG16L berbanding kumpulan ShNC, manakala p-p65 mengikuti trend peningkatan yang sama (Rajah 7F). Peningkatan tahap p-p65 dalam HRGEC selepas ATG16L knockdown disertai dengan peningkatan dalam jumlah ekspresi protein p65, yang mungkin mencerminkan kesan tambahan pada ekspresi p65 dalam HRGEC. Untuk mengesan sama ada penstabilan NF-kB disebabkan oleh penurunan degradasi atau peningkatan sintesis, perencat sintesis protein cycloheximide (CHX) telah ditambah kepada sel untuk menghalang sintesis protein dan tahap protein NF-kB dianalisis. Keputusan Western blot menunjukkan bahawa terdapat ekspresi berterusan protein p65 dengan kehadiran CHX (Rajah 7G). Sementara itu, tahap mRNA NF-kB belum diubah dengan ketara oleh ShATG16L. Data kuantitatif untuk tahap mRNA NF-kB ditunjukkan secara grafik dalam Rajah 7H. Ini mencadangkan bahawa translokasi nuklear NF-kB adalah disebabkan oleh penurunan degradasi, bukan peningkatan sintesis selepas ketukan ATG16L dalam HRGEC. Untuk mengesahkan lagi ekspresi NF-kB dalam tisu manusia, kami melakukan ujian pewarnaan imunofluoresensi pada tisu allograft buah pinggang manusia yang dicapai dan mendapati tahap ekspresi p65 peningkatan ketara dalam allograf buah pinggang pesakit CAD (Rajah 7I, J).
Pengaktifan Laluan NF-kB Rembesan Sitokin Terinduksi, Antaranya IL-1b, IL-6 dan TNF‐a Boleh Merangsang Kemajuan EndMT dalam HRGEC
Isyarat NF-kB ialah pengawal selia utama tindak balas keradangan. Kami kemudiannya meneroka faktor larut yang bertanggungjawab untuk EndMT yang disebabkan oleh shATG16L oleh RT-PCR. Antara beberapa sitokin yang berkaitan dengan kecacatan autophagy dan tindak balas keradangan, IL-1b, IL-6, dan TNF-a, faktor keradangan hiliran tipikal yang disebabkan oleh laluan NF-kB, adalah ketara. meningkat jika dibandingkan dengan HRGEC yang ditransfeksi shNC semasa kemerosotan aktiviti autophagy (Rajah 8A). Ini adalah selaras dengan penemuan kami sebelum ini mengenai faktor keradangan seperti TNF-a peningkatan dalam serum tikus dengan penolakan kronik (27).
Untuk menyiasat patogenesis EndMT yang dirangsang oleh IL{{0}}b, IL-6, dan TNF-a, kami merawat HRGEC dengan kepekatan IL-1b yang berbeza ({{ 7}}~20 ng/mL), IL-6 (0~200 ng/mL) dan
TNF‐a ({{0}}~20 ng/mL) selama 24 jam. Kesemua IL-1b, IL-6 dan TNF-a boleh mengimbangi tahap protein FN dan a‐SMA dengan penurunan bergantung dos penanda sel endothelial CD31 secara serentak. Kesan ini memuncak apabila HRGEC dirawat dengan 10 ng/mL IL-1b, 200 ng/mL IL-6 atau 10 ng/mL TNF‐a, masing-masing (Rajah 8B). Eksperimen kebergantungan masa juga dilakukan untuk mengesahkan ungkapan berkaitan EndMT. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8B, rawatan IL-1b, IL-6 atau TNF-a selama 0~48 jam dengan ketara boleh mendorong ekspresi FN dan a- SMA dan menyebabkan kehilangan CD31 dalam HRGEC sebagai masa rangsangan bertambah. Untuk menguji kesan IL-1b, IL-6 dan TNF-a pada rawatan EndMT, Anakinra, Tocilizumab dan Infliximab telah dimulakan apabila menumbangkan ATG16L. Anakinra ialah antagonis reseptor interleukin-1 (IL-1R). Tocilizumab ialah antibodi peneutral IL-6R yang menyekat IL-6 daripada terikat kepada IL-6R. Infliximab ialah antibodi IgG1 monoklonal yang mengikat secara khusus kepada TNF-a dan merupakan perencat TNF-a yang telah berjaya digunakan dalam pengurusan penyakit radang usus. Keputusan WB menunjukkan bahawa Anakinra dan Infliximab boleh mengurangkan EndMT dengan lebih ketara (Rajah 8C). Keputusan ini mencadangkan bahawa kehilangan ATG16L bukan sahaja mengurangkan aktiviti autophagy tetapi juga menggalakkan rembesan sitokin inflamasi IL-1b, IL-6, dan TNF-a dengan menekan degradasi p65 untuk mengaktifkan NF- laluan kB (Rajah 8D).
PERBINCANGAN
Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa pemindahan buah pinggang merosakkan fluks autofagik, yang dikaitkan dengan peningkatan dalam tindak balas keradangan, EndMT, dan keterukan fibrosis interstisial allograf buah pinggang. Walaupun aktiviti autofagik ditingkatkan buat sementara waktu pada peringkat awal pemindahan allograf, ia secara beransur-ansur menurun akibat kehilangan ATG16L. Autophagy yang bergantung kepada ATG16L, sebagai proses sitoprotektif, boleh melemahkan fibrosis interstisial buah pinggang yang dipindahkan melalui peraturan EndMT yang disebabkan oleh IL-1b, IL-6, dan TNF-a. Untuk pengetahuan terbaik kami, ini adalah kajian pertama yang menjelaskan peranan dan perubahan dinamik fluks autofagik dalam pemindahan buah pinggang. Dalam kajian ini, kami juga menyiasat butiran patofisiologi molekul yang mendasari cara kemerosotan fluks autofagik mengakibatkan EndMT dan fibrosis interstisial allograft buah pinggang.
Walaupun banyak jenis penyelidikan telah melaporkan bahawa autophagy terlibat dalam pembentukan dan perkembangan fibrosis interstisial buah pinggang, ARG belum dianalisis secara komprehensif untuk meneroka nilai klinikal mereka dalam perkembangan penolakan graf buah pinggang kronik. Beratus-ratus protein dikaitkan dengan proses autophagy. Memandangkan kepentingan autophagy dalam pemindahan buah pinggang, adalah munasabah untuk membuat spekulasi bahawa ARG memegang janji besar dalam ramalan prognostik dan sasaran terapeutik. Untuk meneroka faktor patogenetik asal CAD, kami memprofilkan ekspresi mRNA 149 ARG dalam kohort GSE9493 dan menganalisis 14 ARG dengan tegas, yang paling dikaitkan dengan autophagy antara pesakit CAD dan bukan CAD. Antara ARG yang dikurangkan dalam kumpulan CAD, gen pengawalseliaan negatif autophagy, seperti Raptor dan MAPK3 (28, 29), telah dikurangkan dalam kumpulan CAD. Sebaliknya, ATG16L sebagai ARG terkawal adalah perancah untuk lipidasi LC3 dengan menyetempatkan secara dinamik ke membran sumber putatif dan menggalakkan pembentukan vakuol autofagik (30). Walau bagaimanapun, beberapa kajian telah menunjukkan bahawa ATG16L tidak diperlukan untuk pemanjangan membran pengasingan (23). Oleh itu, persatuan antara peranan autophagy-independent atau autophagy-dependent ATG16L dan EndMT telah dikaji.
Untuk menyiasat persatuan antara ATG16L, autophagy, dan EndMT dalam buah pinggang yang dipindahkan, kami merobohkan ATG16L oleh shRNA dalam HRGEC. Penemuan kami mendedahkan bahawa shATG16L boleh mengurangkan tahap autophagy dan mendorong EndMT. Begitu juga, penyelidikan in vivo dan sampel klinikal juga mendedahkan bahawa pengaktifan ATG16L dan fluks autofagik pada peringkat awal pemindahan buah pinggang, fluks autofagik menurun dalam julat dinamik apabila perubahan fibrotik meningkat. Ia boleh disimpulkan bahawa sebab perkembangan EndMT mungkin disebabkan oleh pengurangan fluks autofagik, dan autophagy yang bergantung kepada ATG16L memainkan peranan perlindungan dalam perkembangan EndMT dan fibrosis interstisial allograft buah pinggang. Walau bagaimanapun, beberapa penemuan menunjukkan bahawa autophagy yang disebabkan oleh rapamycin membawa kepada pengaktifan EndMT dalam HCAEC di bawah keadaan anoksik (22). Ini nampaknya berbeza daripada keputusan kami. Kami menganggap bahawa peranan autophagy mungkin berbeza dalam pelbagai jenis sel. Ia mungkin bergantung kepada konteks selular dan faktor pengawalseliaan huluan. Memandangkan autophagy yang bergantung kepada ATG16L ialah cara perlindungan diri apabila EndMT berlaku dalam CAD, adalah bermakna untuk menentukan mekanisme khusus EndMT yang disebabkan oleh shATG16L.
Kami melakukan penjujukan generasi seterusnya daripada kumpulan ATG16L knockdown dan kumpulan kawalan dalam HRGEC. Laluan KEGG dan analisis GSEA mendedahkan bahawa laluan NF-kB adalah salah satu laluan yang diperkayakan dengan ketara. NF-kB biasanya mengikat IkB, yang menstabilkan NF-kB dalam sitoplasma. Apabila laluan NF-kB diaktifkan, NF-kB heterodimer p65 berpindah ke nukleus dan mengikat kepada promoter khususnya (31). Salah satu laluan kanonik (klasik) untuk translokasi nuklear NF-kB ialah fosforilasi p65. Walau bagaimanapun, peningkatan dalam bilangan laluan bukan kanonik telah dilaporkan dalam penyakit yang berbeza. Telah juga dilaporkan bahawa autophagy terpilih pengantara p62/SQSTM1-yang ditindas boleh mengurangkan degradasi lisosom laluan NF-kB (32), kecacatan autophagy juga membawa kepada pengaktifan NF-kB kerana ekspresi SQSTM1 yang berterusan, yang seterusnya menggalakkan tumorigenesis dalam model tetikus (33). Dalam kajian kami, kami melihat peningkatan dalam tahap protein p65 dan p-p65 manakala tahap mRNA tidak berubah. Dengan kehadiran perencat sintesis protein CHX, pengumpulan protein p65 masih berterusan berbanding dengan ketiadaan perencat. Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawa pengaktifan NF-kB yang disebabkan oleh knockdown ATG16L terhasil daripada pengurangan degradasi protein dan proses ini mungkin penindasan degradasi bergantung autofagik.
Keradangan berkait rapat dengan akibat penting pemindahan buah pinggang pada tahap klinikal dan terapeutik (34). NF-kB p65 ialah faktor transkripsi yang paling penting dalam pengawalseliaan faktor keradangan selular. Dalam kajian ini, kami juga mendapati mengetuk ATG16L meningkatkan sitokin IL-1b, IL-6 dan TNF-a melalui laluan NF-kB. Penemuan ini dan penemuan lain bersetuju dengan banyak kajian lain seperti yang menyimpulkan bahawa kehilangan ATG16L meningkatkan pengeluaran IL- 1b yang disebabkan oleh endotoksin (35) dan TNFAIP3/A20 mengikat ATG16L1 untuk mengawal tindak balas autofagik, NF-kB pengaktifan (36). Tambahan pula, peranan sitokin inflamasi pada EndMT telah dilaporkan dalam beberapa kajian terdahulu. Namun begitu, ada kemungkinan sitokin inflamasi ini memainkan peranan yang pelbagai bergantung pada patologi yang mendasari dan tahap ambiennya. Dalam model tetikus obesiti akibat diet, kekurangan autofag endothelial menyebabkan IL6-bergantung EndMT (37). Dalam penyakit kalsifikasi vaskular, IL-1b dan TNF-a mendorong EndMT dalam sel endothelial aorta primer manusia (38). Keputusan kami menyaring dan mengenal pasti IL-1b, IL-6 dan TNF-a sebagai sitokin inflamasi EndMT yang menggalakkan dalam persekitaran patologi CAD. Dengan ini, hubungan timbal balik antara kehilangan ATG16L dan sitokin inflamasi telah dikaji untuk menggariskan sasaran terapeutik yang mungkin untuk mengawal kehilangan ATG16L dalam perkembangan CAD.
Penyelidikan kami mempunyai beberapa batasan. Pengesahan semasa kesan ATG16L pada EndMT dan perkembangan fibrosis hanya dijalankan dalam model talian sel knockdown, kerumitan perubahan autophagy dalam vivo dan dalam pembangunan CAD hampir tidak dapat ditiru dan menggariskan keperluan untuk tikus kalah mati bersyarat ATG16L endothelial. . Kami akan menubuhkan model pemindahan buah pinggang tikus kalah mati ATG16L untuk kajian mekanisme lanjut. Keputusan kami menunjukkan bahawa kehilangan ATG16L dan autophagy menggalakkan EndMT, QNZ menghalang pengaktifan NF-kB, dan IL-1b, antibodi monoklonal TNF-a antagonis reseptor spesifik dengan itu memperlahankan proses fibrotik allograf, tetapi ia tidak dapat sepenuhnya. membalikkan keputusan ini. Sama ada mekanisme lain memainkan peranan yang sama masih tidak diketahui. Selain itu, selain sel endothelial, sumber miofibroblas terdiri daripada pelbagai sel, termasuk epitelium, fibroblas, dan pericytes (39). Sama ada kehilangan ATG16L dan kekurangan autophagy menjejaskan sel-sel ini masih tidak dapat disimpulkan.
Kesimpulannya, kajian semasa membuktikan bahawa ketukan ATG16L adalah penting untuk merosakkan fluks autofagik dan pembentukan EndMT yang disebabkan oleh IL-1b, IL-6, dan TNF-a dalam perkembangan fibrosis interstisial renal yang dipindahkan . Fungsi ini dimediasi oleh NF-kB mengurangkan degradasi dan pengaktifan laluan. Ringkasnya, hasil kajian kami memberikan pandangan baru tentang hubungan dinamik fluks autofagik dan EndMT. Mencegah kehilangan ATG16L dan perencatan fluks autophagy boleh menjadi pilihan baru untuk rawatan dan pencegahan perkembangan fibrosis interstisial buah pinggang dan CAD dalam penerima pemindahan buah pinggang.
Batang cistanche menghalang penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel
PENYATA KESEDIAAN DATA
Data mentah yang menyokong kesimpulan artikel ini akan disediakan oleh pengarang, tanpa sebarang tempahan yang tidak wajar.
PENYATA ETIKA
Kajian yang melibatkan peserta manusia telah disemak dan diluluskan oleh jawatankuasa etika tempatan Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Nanjing. Pesakit/peserta memberikan persetujuan termaklum bertulis mereka untuk mengambil bahagian dalam kajian ini. Kajian haiwan telah disemak dan diluluskan oleh jawatankuasa etika tempatan Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Nanjing. Persetujuan termaklum bertulis diperoleh daripada pemilik untuk penyertaan haiwan mereka dalam kajian ini.
SUMBANGAN PENULIS
RT dan MG menyelia dan menyusun projek itu. ZG, CS, dan ZW mereka bentuk dan menjalankan kebanyakan eksperimen. MZ dan SF mengumpul sampel tikus. LS, HC, ZH, JT, XJ, dan HY menganalisis data. ZG dan ZW membuat angka tersebut. ZG dan RT merangka dan menyemak kertas kerja. Semua pengarang menyumbang kepada artikel dan meluluskan versi yang diserahkan.
PEMBIAYAAN
Kerja ini telah disokong oleh Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China [nombor geran 82070769, 81870512, 81770751, 81570676, 81470981, 81100532].
RUJUKAN
1. Carney EF. Pemindahan: Faedah kelangsungan hidup menerima buah pinggang penderma pesakit kencing manis. Nat Rev Nephrol (2017) 13(8):444. DOI: 10.1038/nrneph.2017.88
2. El-Husseini A, Aghil A, Ramirez J, Sawaya B, Rajagopalan N, Baz M, et al. Hasil pemindahan buah pinggang dalam pemindahan organ pepejal primer, ulangan dan ginjal-selepas-bukanrenal: 15-analisis tahun pangkalan data UNOS terkini. Pemindahan Clin (2017) 31(11). DOI: 10.1111/ctr.13108
3. Schinstock CA, Stegall M, Cosio F. Pandangan baharu mengenai penolakan pengantaraan antibodi kronik dan perkembangannya kepada pemindahan glomerulopati. Curr Opin Nephrol Hypertens (2014) 23(6):611–8. doi: 10.1097/MNH. 0000000000000070
4. Goldberg RJ, Weng FL, Kandula P. Disfungsi Allograft Akut dan Kronik dalam Penerima Pemindahan Buah Pinggang. Med Clin North Am (2016) 100(3):487–503. doi: 10.1016/j.mcna.2016.01.002
5. Wang Z, Han Z, Tao J, Wang J, Liu X, Zhou W, et al. Peranan peralihan endothelial-to-mesenchymal yang disebabkan oleh TGF-beta1 dalam pemindahan fibrosis interstisial buah pinggang. J Cell Mol Med (2017) 21(10):2359–69. doi: 10.1111/ lompat.13157
6. An C, Jia L, Wen J, Wang Y. Menyasarkan Fibroblas Terbitan Sumsum Tulang untuk Fibrosis Renal. Adv Exp Med Biol (2019) 1165:305–22. doi: 10.1007/978-981- 13-8871-2_14
7. Cruz-Solbes AS, Youker K. Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) dan Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT): Peranan dan Implikasi dalam Fibrosis Buah Pinggang. Keputusan Probl Cell Differ (2017) 60:345–72. doi: 10.1007/978- 3-319-51436-9_13
8. Yang J, Antin P, Berx G, Blanpain C, Brabletz T, Bronner M, et al. Garis panduan dan definisi untuk penyelidikan mengenai peralihan epitelium-mesenchymal. Nat Rev Mol Cell Biol (2020) 21(6):341–52. doi: 10.1038/s41580-020-0237-9
9. Zeisberg EM, Potenta SE, Sugimoto H, Zeisberg M, Kalluri R. Fibroblas dalam fibrosis buah pinggang muncul melalui peralihan endothelial-to-mesenchymal. J Am Soc Nephrol (2008) 19(12):2282–7. doi: 10.1681/ASN.2008050513
10. Di Gregorio J, Robuffo I, Spalletta S, Giambuzzi G, De Iuliis V, Toniato E, et al. Peralihan Epitelium-ke-Mesenchymal sebagai Sasaran Terapeutik Berkemungkinan dalam Gangguan Fibrotik. Biol Dev Sel Hadapan (2020) 8:607483. doi: 10.3389/ jatuh.2020.607483
11. Kardinal H, Dieude M, Hebert MJ. Disfungsi Endothelial dalam Pemindahan Buah Pinggang. Front Immunol (2018) 9:1130. DOI: 10.3389/fimmu.2018. 01130
12. Zhao Y, Cooper DKC, Wang H, Chen P, He C, Cai Z, et al. Potensi peranan patologi sitokin pro-radang (IL-6, TNF-alpha, dan IL-17) dalam xenotransplantasi. Xenotransplantation (2019) 26(3):e12502. doi: 10.1111/Xen.12502
13. Zhao C, Xu Z, Wang Z, Suo C, Tao J, Han Z, et al. Peranan faktor nekrosis tumor-alfa dalam peralihan epitelium-ke-mesenchymal dalam sel-sel buah pinggang yang dipindahkan pada penerima dengan disfungsi allograft kronik. Gene (2018) 642:483–90. DOI: 10.1016/j.gene.2017.11.059
14. Zhang B, Niu W, Dong HY, Liu ML, Luo Y, Li ZC. Hipoksia mendorong peralihan mesenchymal endothelial dalam pembentukan semula vaskular pulmonari. Int J Mol Med (2018) 42(1):270–8. doi: 10.3892/ijmm.2018.3584
15. Li J, Zhang Q, Ren C, Wu X, Zhang Y, Bai X, et al. Ultrasound Berdenyut Intensiti Rendah Menghalang Peralihan Endothelial-Mesenchymal Akibat Tekanan Oksidatif dalam Sel Endothelial Aorta Manusia. Biokim Fisiol Sel (2018) 45 (4):1350–65. doi: 10.1159/000487561
16. Guan Q, Nguan CY, Du C. Ungkapan mengubah faktor pertumbuhan-beta1 menghadkan kecederaan iskemia-reperfusi buah pinggang. Pemindahan (2010) 89(11):1320– 7. doi: 10.1097/TP.0b013e3181d8e9dc
17. Levine B, Kroemer G. Fungsi Biologi Gen Autophagy: Perspektif Penyakit. Sel (2019) 176(1-2):11–42. DOI: 10.1016/j.sel.2018.09.048
18.De Rechter S, Decuypere JP, Ivanova E, van den Heuvel LP, De Smedt H,
Levtchenko E, et al. Autophagy dalam penyakit buah pinggang. Pediatr Nephrol (2016) 31 (5): 737–52. doi: 10.1007/s00467-015-3134-2
19. Li H, Peng X, Wang Y, Cao S, Xiong L, Fan J, et al. Atg5-kekurangan autophagy pengantara dalam tubul proksimal menggalakkan kitaran sel penangkapan G2/M dan fibrosis buah pinggang. Autophagy (2016) 12(9):1472–86. doi: 10.1080/ 15548627.2016.1190071
Baisantry A, Bhayana S, Rong S, Ermeling E, Wrede C, Hermann J, et al. Autophagy Mendorong Perubahan Prosenescent dalam Segmen S3 Tubular Proksimal. J Am Soc Nephrol (2016) 27(6):1609–16. doi: 10.1681/ASN.2014111059
