Antibodi perangsang imun Menggabungkan Pengaktifan Myeloid Teguh Dan Kekebalan Anti-tumor Tahan Lama（Bahagian 1）

Untuk mengetahui maklumat lanjut sila hubungidavid.wan@wecistanche.com

Abstrak

Reseptor pengecaman corak semula jadi, termasuk reseptor seperti tol (TLR), boleh mengubah persekitaran mikro tumor dan imuniti anti-tumor adaptif utama.Walau bagaimanapun, agonis TLR tidak diterima dengan baik kerana ketoksikan yang dikaitkan dengan pengaktifan imun yang meluas selepas pentadbiran sistemik.Untuk mereka bentuk terapeutik yang sesuai untuk penghantaran sistemik danmampu menimbulkan tindak balas sasaran tumor, kami membangunkan kelas novel konjugat antibodi perangsang imun (ISAC) yang terdiri daripada agonis TLR7/8 yang dikonjugasikan kepada antibodi penyasaran tumor.ISAC anti-HER2 yang ditadbir secara sistematik diterima dengan baik dalam vivo dan menimbulkan pengaktifan teguh sel myeloid intratumoral, mengakibatkan pembersihan tumor dan ingatan imunologi seterusnya.Potensi in vitro dan keberkesanan in vivo memerlukan aktiviti tandem didorong oleh fungsi Fc yang utuh dan agonisme TLR untuk membolehkan fagositosis dan imuniti anti-tumor yang dimediasi sel T.Memori imunologi pengantara ISAC tidak terhad kepada HER2, kerana tikus yang dirawat ISAC dilindungi daripada mencabar semula dengan tumor HER2-negatif.Keputusan ini memberikan rasional yang kukuh untuk pembangunan klinikal ISAC dan menunjukkan bahawa sinergi antara isyarat Fc R dan TLR7/8 menyumbang kepada mekanisme imuniti anti-tumor pengantara ISAC.

Klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut tentang Cistanche

pengenalan

Sebelum akhir abad ke-20, pesakit kanser umumnya mempunyai tiga kaedah rawatan yang tersedia: pembedahan pembedahan, radiasi, dan kemoterapi. Kemunculan imunoterapi kanser menambah modaliti keempat yang kuat yang meluaskan repertoir onkologi bermula dengan kelulusan rituximab untuk limfoma bukan Hodgkin dan meluas kepada penggunaan perencat pusat pemeriksaan 1,2 secara meluas. Walau bagaimanapun, mana-mana satu terapi, termasuk imunoterapi, adalah terhad sementara melainkan ia menghasilkan tindak balas biologi dan imunologi yang tahan lama yang mengatasi heterogeniti tumor dan beban mutasi 3–5. Inhibitor pusat pemeriksaan seperti antibodi anti-PD-1 dan PD-L1 secara dramatik meningkatkan hasil dalam beberapa petunjuk, termasuk pada pesakit yang mempunyai beban mutasi tumor yang tinggi atau ketidakstabilan mikrosatelit, dan satu penentu kerentanan tumor terhadap imunoterapi pusat pemeriksaan ialah tahap pra -penyusupan sel T sedia ada. Pesakit dengan tumor "sejuk" yang mempunyai penyusupan sel T yang jarang adalah kurang responsif terhadap sekatan pusat pemeriksaan dan mempunyai prognosis yang lebih buruk berbanding pesakit dengan tumor "panas" di mana sel T tumor-reaktif imunosupresi hadir dalam persekitaran mikro tumor (TME) 6,7 . Biopsi tumor dan imunohistokimia menunjukkan bahawa sel pembentang antigen profesional (APC) seperti sel dendritik (DC) selalunya lebih kerap dalam TME berbanding sel T, walaupun masih terdedah kepada mekanisme imunosupresif 8,9. Memandangkan kehadiran sel myeloid dalam TME dan peranannya dalam menggalakkan pengaktifan sel T, terdapat peningkatan usaha untuk membangunkan terapi yang mengaktifkan APC yang berkaitan dengan tumor untuk menimbulkan imuniti sel T yang meluas dan tindak balas imun anti-tumoral yang berkesan.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 penderma. (d) Rituximab telah bertindak balas dengan SATA melalui sisa lisin untuk menukar amina bebas kepada kumpulan sulfhidril yang dilindungi sebelum deasetilasi dengan hidroksilamin dan tindak balas seterusnya dengan T785-MCC untuk menghasilkan rituximab-ISAC. (e) Analisis LC-MS rituximab-ISAC berikutan rawatan PNGase F. DAR dikira berdasarkan penambahan jisim penghubung-agonis sebanyak 606 g/mol. ( f ) Rituximab atau rituximab-ISAC berlabel pendarfluor diinkubasi dengan sel tumor CD20 ditambah Toledo pada 4 darjah selama 2 jam sebelum analisis melalui cytometry aliran. Data adalah daripada 1 eksperimen dengan sampel tiga kali ganda dan mewakili 2 eksperimen.(gh) APC myeloid manusia yang baru diasingkan telah dibiakkan dengan rituximab, T785, rituximab, dan T785 atau rituximab-ISAC dengan kehadiran CD20 berlabel CFSE ditambah sel tumor Toledo pada nisbah 3:1 kesan kepada sasaran. Kepekatan rituximab digambarkan pada paksi X dengan kepekatan T785 dalam ujian ini konsisten dengan jumlah T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 penderma (min dan SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Kini telah didokumentasikan dengan baik bahawa penghantaran tempatan agen imunostimulasi dalam model praklinikal boleh memprogram semula APC pemastautin tumor yang ditindas ke dalam sel diaktifkan yang mampu memproses dan membentangkan antigen yang berkaitan dengan tumor, termasuk neoantigen, kepada sel T yang kemudiannya menjadi pengantara imuniti anti-tumor 10–13 . Satu strategi sedemikian yang dipelopori oleh Carmi et al menunjukkan bahawa penghantaran intratumoral antibodi penyasaran tumor alogenik dengan agonis reseptor seperti Toll (TLR)-3 atau dengan TNF dan CD40L menyelamatkan APC berkaitan tumor secara berfungsi yang membawa kepada pengambilan antigen yang dipertingkatkan dan induksi seterusnya imuniti sel T anti-tumor. Strategi gabungan ini, yang memanfaatkan fungsi efektor antibodi dengan agonis TLR, membawa kepada membasmi tumor primer dan lesi metastatik dan melindungi tuan rumah daripada tumor berulang 11,14. Begitu juga, antibodi anti-OX40 agonis yang digabungkan dengan agonis TLR9, CpG, mengaktifkan APC dan sel T dalam tumor, menghasilkan keberkesanan yang mengagumkan terhadap pelbagai jenis tumor pada tikus 13. Terjemahan berkesan strategi pengaktifan APC ke dalam klinik sedang dijalankan. disiasat dalam pelbagai petunjuk dengan data klinikal pada pesakit dengan melanoma yang menunjukkan bahawa penghantaran intra-tumor agonis TLR9 dalam kombinasi dengan antibodi anti-PD-1 boleh membawa kepada pengecutan tumor dan tindak balas abscopal dalam lesi yang tidak disuntik 15. Begitu juga, beberapa kumpulan sedang mengejar agonis TLR7/8 untuk imunoterapi tumor kerana corak ekspresi TLR7/8 dalam APC manusia lebih mencerminkan corak ekspresi TLR7 dan TLR9 dalam APCs16-18 murine. Akhirnya, penggunaan strategi penghantaran intra-tumoral, jika berkesan, akan dihadkan oleh kebolehcapaian tumor kerana penghantaran sistemik agonis imun yang menyasarkan APC telah dihadkan oleh ketoksikan, separuh hayat yang pendek, dan penghantaran sub-optimum ke tapak sasaran.Matlamat kami adalah untuk mereka bentuk konjugat antibodi perangsang imun (ISAC) yang terdiri daripada antibodi monoklonal sasaran tumor yang digabungkan kepada agonis imun sebagai pendekatan terapeutik baru untuk mendapatkan imuniti anti-tumor yang tahan lama. Pentadbiran sistemik ISAC menimbulkan pengaktifan APC setempat dalam TME yang bergantung kepada Fcfungsi effector dan pengaktifan TLR sambil mengelakkan ketoksikan tipikal yang berkaitan dengan penghantaran sistemik agonis TLR. Selain itu, pentadbiran sistemik konjugasi ini kepada tikus yang membawa tumor membolehkan pemprosesan dan pembentangan antigen kepada sel T yang membawa kepada imuniti anti-tumor yang berterusan dalam pelbagai model yang tahan terhadap antibodi sasaran tumor yang tidak terkonjugasi.

Keputusan

Reka Bentuk dan Pencirian ISAC Untuk membolehkan konjugasi agonis TLR kepada antibodi, alat dok molekul telah digunakan untuk mereka bentuk agonis TLR7/8 novel (T785) dengan butil-amin yang berfungsi sebagai titik lampiran yang boleh diakses pelarut pada antibodi ( Rajah 1A, Rajah Tambahan 1A–C). T785 melibatkan TLR7 manusia dengan EC50 sebanyak 0.643 μM dan TLR8 manusia dengan EC50 sebanyak 1.60 μM dalam talian sel HEK293 yang mengekspresikan bersama wartawan fosfatase alkali rembesan NF-κB dan sama ada TLR7 atau TLR8 (Rajah ). Kekhususan T785 untuk TLR7/8 telah disahkan oleh ketidakupayaan T785 untuk mendorong aktiviti NF-κB dalam sel wartawan HEK293 yang tidak mempunyai ekspresi TLR7/8 (Tambahan Rajah 2A). Untuk mengesahkan aktiviti agonistik dalam sel primer, monosit dan DC yang baru diasingkan, dipanggil APC myeloid (~ 96 peratus monosit, 4 peratus DC; Tambahan Rajah 3A), yang menyatakan kedua-dua TLR7 dan TLR8, telah dirangsang semalaman dengan 1 μM T785 atau R848, a agonis TLR7/8 yang mantap dan berciri 19. T785 dan R848 merangsang APC myeloid pada tahap yang sama (Rajah 1C) 20,21. Aktiviti T785 juga telah disahkan dalam plasmacytoid DC manusia yang baru diasingkan (pDCs), yang menyatakan TLR7 tetapi bukan TLR8 (Tambahan Rajah 2B). Untuk menyiasat kesan ISAC dalam budaya in vitro manusia, ISAC dihasilkan dengan rituximab (Rajah 1D), antibodi monoklonal anti-CD20 yang disahkan secara klinikal yang digunakan untuk rawatan keganasan sel B, dengan konjugasi kepada T785 dalam tindak balas pelbagai langkah. dengan pemaut silang heterobifungsi yang serasi 22. T785-Kecekapan konjugasi ISAC diukur oleh LC-MS berikutan deglikosilasi dengan PNGase F, menghasilkan purata nisbah ubat-ke-antibodi (DAR) sebanyak 1.71 (Rajah 1E). Kami mengesahkan bahawa ISAC mengekalkan pengikatan yang setanding dengan CD20 berikutan eksperimen sitometri aliran dengan CD20- yang mengekspresikan garisan sel tumor Toledo, garis sel yang dicirikan dengan baik yang diperoleh daripada pesakit dengan limfoma sel besar meresap (Rajah 1F) 23. T 785-ISAC yang mengikat kepada reseptor Fc manusia (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) telah dinilai oleh Biacore dan setanding dengan rituximab (Jadual Tambahan 1).ISAC mengaktifkan APC mieloid manusiaPotensi imunostimulasi rituximab T{{77 }}ISAC dinilai berikutan kultur APC mieloid manusia yang baru diasingkan dengan sel tumor CD20 ditambah Toledo berlabel CFSE selama 18 jam. APC Myeloid yang dikultur dengan rituximab T785-ISAC mengalami perubahan morfologi yang pantas selaras dengan morfologi DC, manakala morfologi DC tidak diperhatikan dalam kultur yang diinkubasi dengan rituximab, T785 atau campuran equimolar rituximab, dan T785 (Rajah 1G). APC yang dirangsang dengan rituximab T785-ISAC kekal berdaya maju dan dendritik dalam morfologi sehingga lapan hari manakala APC yang dirangsang dengan campuran kebanyakannya tidak berdaya maju pada hari kelapan (Rajah 1H). Analisis sitometri aliran pelbagai warnaselepas 18 jam menunjukkan bahawa APC yang dirangsang dengan rituximab T785-ISAC menurunkan kawalan CD14 dan CD16 dan serentak mengimbangi CD123, penanda permukaan sel ditunjukkan kepadadikawal selia pada DC myeloid diaktifkan 24. Sebaliknya, APC dirangsang dengan rituximab,T785 atau campuran tidak memodulasi ungkapan penanda ini (Rajah 1I, Rajah Tambahan 4A, strategi gating yang diterangkan dalam Rajah Tambahan 3BC).

APC manusia yang dirangsang dengan rituximab T785-ISAC juga mengimbangi CD molekul kostimulasi86 dalam cara yang bergantung kepada dos, dengan trend yang sama diperhatikan dengan upregulation CD40 dan HLA-DR yang konsisten dengan fenotip APC yang diaktifkan (Rajah 1I & Tambahan Rajah 4B). Perubahan bergantung kepada dos dalam ekspresi penanda permukaan adalah konsisten sama ada dinilai sebagai keamatan pendarfluor median (MFI, Rajah 1) atau sebagai peratus daripada jumlah populasi sel yang positif untuk penanda masing-masing (Tambahan Rajah 5). Analisis seterusnya supernatan bebas sel menunjukkan bahawa rituximab T785-APC yang dirangsang oleh ISAC merembeskan kuantiti TNF dan IL yang lebih tinggi-1 (Rajah 2J dan Rajah Tambahan 4C). Potensi imunostimulasi T{16}}ISAC tidak terhad kepada rituximab, kerana T{17}}ISAC yang dijana dengan trastuzumab turut menimbulkan pengaktifan myeloid yang dipertingkatkan (Tambahan Rajah 4D). Kapasiti APC yang dirangsang ISAC untuk menimbulkan pembentangan antigen dan penyebuan silang sel T CD8 ditambah telah dinilai menggunakan sistem antigen model ovalbumin (OVA) 25,26. Splenik CD11c ditambah DC yang diasingkan daripada tikus jenis liar telah dibiakkan semalaman dengan kompleks imun yang terbentuk dengan OVA dan sama ada antibodi anti-OVA atau ISAC. DC yang dimuatkan OVA telah dikira dan diinkubasi dengan sel T OT-I CD8 ditambah dengan kekhususan TCR untuk peptida OVA, SIINFEKL, dikomplekskan dengan MHC-I. Persembahan silang dipertingkatkan pengantara ISAC anti-OVA, seperti yang diukur dengan jumlah MHC-I, peptida SIINFEKL terikat, dan penyebuan silang yang dipertingkatkan seperti yang diukur oleh percambahan sel T CD8 ditambah (Rajah Tambahan 6A & 6B).ISAC memperoleh TLR yang diperkuatkan dan isyarat intraselular berkaitan Fc R dalam APC myeloid manusiaPengaktifan Fc Rs dan TLR mendorong lata isyarat fosfo yang kompleks, dan magnitud serta ciri tindak balas ini berbeza antara pelbagai subset sel imun 27. Kami menyiasat laluan isyarat intrasel hiliran yang terlibat dalam pelbagai jenis sel dalam kultur tumor PBMC yang dirangsang dengan rituximab T785-ISAC berbanding kawalan campuran ekuimolar menggunakan sitometri jisim (CyTOF) 28. Subkumpulan leukosit (iaitu monosit, CD4 ditambah sel T) dikenal pasti melalui pengelompokan SPADE menggunakan penanda keturunan dengan sel sasaran yang merangkumi kedua-dua sel tumor CD20 ditambah Toledo dan sel B yang sihat 29. Peristiwa fosforilasi yang dikaitkan dengan isyarat TLR (pIRF7) dan Fc R (pERK1/2) telah meningkat 15 minit selepas rangsangan dengan T785-ISAC dalam monosit dan cDC, berbanding dengan campuran komponen individu 30,31. Isyarat intraselular sebahagian besarnya terhad kepada sel asal myeloid (monosit dan cDC) serta pDC, yangsemuanya menyatakan Fc Rs dan TLR7 dan/atau TLR8 yang diperlukan. Dalam monosit dan cDC, rangsangan yang disebabkan oleh ISAC juga menghasilkan fosforilasi MAPKAPK2, p38, CREB, dan protein ribosom S6 (RPS6) yang jauh lebih tinggi, satu keperluan untuk memulakan sintesis protein hiliran (Rajah 2A-C & Rajah Tambahan 7A). CD141 ditambah cDC dan CD1c ditambah cDC menunjukkan tahap pIRF7 yang setanding merentas kedua-dua subset CDC, manakala tahap RPS6 dan pERK1/2 meningkat lebih tinggi dalam CD141 ditambah cDC, yang cemerlang dalam penyebuan sel T CD8 ditambah dan pembentangan silang antigen, berbanding CD1c ditambah cDC (Tambahan Rajah 7B).

Kinetik T785-Stimulasi ISAC adalah konsisten dengan dinamik isyarat yang dijangkakan: fosforilasi ERK1/2 memuncak selepas 5 minit, manakala rakan kongsi hilirannya RPS6 tidak mencapai fosforilasi puncak sehingga 15-titik masa minit (Tambahan Rajah 7C). Kinetik ini menyokong dinamik yang dijangkakan apabila isyarat merambat dari semasa ke semasa, dan mencadangkan bahawa terdapat tindak balas isyarat yang berterusan dan diperkuatkan kepada rangsangan ISAC APC. Memandangkan tindak balas diperkuat yang diperhatikan berikutan rangsangan ISAC yang dikaitkan dengan laluan isyarat Fc R dan TLR, kami seterusnya menggunakan algoritma Anggaran Sampel Semula Ketumpatan Bersyarat bagi Maklumat Bersama (DREMI) dan Penglihatan Berskala Semula Ketumpatan bersyarat (DREVI) untuk mengukur kekuatan perhubungan berpasangan dalam laluan isyarat Fc R dan TLR 32. Algoritma ini menjana plot DREVI untuk visualisasi, di mana kawasan di bawah lengkung (AUC) adalah penunjuk keamatan isyarat keseluruhan, titik infleksi (IP) ialah ukuran ambang pengaktifan, dan Skor DREMI mengukur pergantungan pasangan kedua-dua fosfoprotein yang dipersoalkan. Analisis ini mengenal pasti peningkatan skor DREMI yang menunjukkan pergantungan berpasangan yang dipertingkatkan antara protein yang dikaitkan dengan laluan isyarat Fc R dan TLR berikutan rangsangan T785-ISAC berbanding dengan kawalan campuran ekuimolar (Rajah 2D). Saling bergantung yang kuat antara pERK1/2 dan pIRF7 diperhatikan secara unik berikutan rangsangan dengan T785-ISAC, tetapi bukan campuran, seperti yang ditunjukkan oleh skor DREMI yang meningkat, keamatan isyarat yang dikuatkan dan pengurangan ambang pengaktifan yang diperlukan untuk fosforilasi IRF7 (Rajah 2D ). Analisis ini juga menunjukkan pengurangan ambang pengaktifan yang diperlukan untuk memulakan terjemahan protein (RPS6 fosforilasi) berikutan rangsangan ISAC seperti yang dikira oleh peningkatan skor DREMI dan pengurangan IP untuk gabungan berpasangan pERK1/2-pRPS6 dan pIRF7-pRPS6 . Tambahan pula, tahap fosforilasi RPS6 telah diperkuatkan hasil daripada fosforilasi ERK1/2 atau IRF7 seperti yang ditentukan oleh peningkatan AUC berpasangan (Rajah 2D). Hasil gabungan ini bukan sahaja mengesahkan isyarat ISAC melalui laluan Fc R dan TLR yang dijangkakan tetapi lebih-lebih lagi, menyokong sinergi antara kedua-dua laluan yang mengakibatkan pengurangan ambang pengaktifan dan keamatan isyarat yang dikuatkan.

Rajah 3: ISAC memerlukan fungsi efektor Fc dan agonis TLR untuk mengantara pengaktifan myeloid. APC myeloid manusia yang baru diasingkan telah dikultur selama 18 jam dengan kehadiran sel tumor CD20 ditambah Toledo pada nisbah kesan 3:1 kepada sasaran dan (a) 80 nM daripada rituximab-ISAC dengan atau tanpa 1 μM R406, (b) rituximab-ISAC pada isotype antibodi yang ditunjukkan, (c) rituximab-ISAC atau deglycosylated rituximab-ISAC (ISAC-deglycosylated). (ac) Sel dianalisis oleh sitometri aliran dan data dilaporkan sebagai intensiti pendarfluor median. (d) Sel wartawan HEK-Blue-TLR7 atau TLR8 telah dibiakkan selama 18 jam dengan kehadiran T785 atau TLRnull sebelum penilaian aktiviti SEAP yang disebabkan oleh NF-κB. Data yang ditunjukkan ialahdaripada 1 eksperimen dan mewakili sekurang-kurangnya 3 eksperimen. (e) APC myeloid manusia yang baru diasingkan telah dibiakkan selama 18 jam dengan kehadiran sel tumor CD20 ditambah Toledo dan rituximab-ISAC yang ditunjukkan dan dianalisis oleh sitometri aliran (data ditunjukkan sebagai mediankeamatan pendarfluor). (ae) Data yang ditunjukkan mewakili 1-4 percubaan tambahan dan Lebih daripada atau sama dengan 3 penderma untuk setiap percubaan (min dan SEM). Kepentingan statistik ditakrifkan sebagai *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

ISAC memerlukan fungsi efektor Fc untuk menengahi pengaktifan APC myeloidSumbangan aktiviti Fc kepada fungsi ISAC telah disiasat berikutan ablasi isyarat Fc R hiliran dengan R406, perencat kinase molekul kecil Syk yang menghalang transduksi isyarat hiliran Fc Rs yang mengaktifkan 33,34 . Penambahan R406 telah membatalkan pengaktifan myeloid pengantaraan T785-ISAC seperti yang dibuktikan oleh kekurangan penyelarasan CD molekul kostimulasi86 tetapi tidak mengubah tindak balas selular kepada pengaktifan TLR7/8 oleh T785 (Rajah 3A & Tambahan Rajah 8). Perencatan Syk dengan R406 juga isyarat yang dimansuhkan diperhatikan dalam monosit berikutan rangsangan T785-ISAC, dengantahap terfosforilasi MAPKAPK-2, ERK1/2 dan IRF7 diukur dengan ketara (Tambahan Rajah 7D).Memandangkan data ini, rituximab T785-ISAC telah dirumuskan dengan DAR yang setanding pada setiap satu daripada empat isotaip semula jadi untuk menentukan sejauh mana aktiviti T785-ISAC berbeza dengan pertalian pengikatan Fc R yang diketahui 35,36. ISAC rituximab aglycosylated dan fucosylated juga disiasat, kerana glikosilasi mengecilkan pengikatan Fc R manakala fucosylation meningkatkan pertalian pengikatan untuk FCGR3A 37. Kapasiti imunostimulasi rituximab T785-ISAC berkorelasi dengan pertalian Fc R isotype antibodi (Rajah 3B). Sebaliknya, IgG1 terfukosilasi (IgG1-AF), wildtype IgG1 dan IgG3 T785-ISAC menimbulkan pengaktifan myeloid, dengan IgG1-AF T785-ISAC mendorong tertinggi tahap penyelarasan CD{15}} (Rajah 3B). Deglycosylation of wildtype rituximab T785-ISAC dengan PNGase F, yang mengurangkan pertalian pengikatan Fc-Fc R mengakibatkan pengurangan aktiviti rangsangan imun ISAC secara in vitro, menyokong kepentingan rantau Fc yang berfungsi secara aktif (Rajah 3C).

ISAC memerlukan agonisme TLR untuk mengantara pengaktifan myeloidSumbangan aktiviti TLR pada fungsi ISAC telah disiasat berikutan ablasi agonisme TLR dengan mengeluarkan 2-piridin amino daripada T785 yang dipercayai membentuk jambatan garam dengan sisa aspartat kritikal dalam pengikatan poket TLR7 dan TLR8 38 (TLRnull, Rajah 3D). Kompaun TLRnull telah dikonjugasikan kepada rituximab (TLRnull ISAC) dan dinilai untuk potensi pengaktifan myeloid dengan kehadiran CD20 ditambah sel tumor secara in vitro. ISAC TLRnull tidak mendorong pengawalan semula CD molekul kostimulasi86 atau memodulasi ekspresi CD14 atau CD123, menunjukkan bahawa agonisme TLR diperlukan untuk fenotip pengaktifan yang diperhatikan dengan T785-ISAC (Rajah 3E). Selain itu, TLRnull ISAC tidak mendorong fosforilasi IRF-7 dalam monosit, selaras dengan ketidakupayaannya untuk melibatkan TLR7/8 (Tambahan Rajah 7E). Trastuzumab T785-ISAC yang ditadbir secara sistematik menghapuskan tumor tanpa ketiadaan Aktiviti sel B, T, atau NK dalam model tumor xenograf manusiaKeupayaan ISAC untuk mendorong pemusnahan tumor pepejal yang dimediasi myeloid dan neutrofil tanpa ketiadaan aktiviti sel B, T, dan NK dinilai menggunakan model xenograf manusia 39,40. Trastuzumab, antibodi sasaran HER2-yang disahkan secara klinikal, telah dipilih untuk penyiasatan untuk menentukan sama ada trastuzumab T785-ISAC boleh mengatasi rintangan tumor terhadap trastuzumab dalam model tumor pepejal HER2 ditambah (Rajah 4 dan Rajah Tambahan 9 ) 41,42. Pertama, pentadbiran sistemik trastuzumab T785-ISAC dibandingkan dengan penghantaran intra-tumoral campuran trastuzumab dan T785. Trastuzumab T785-ISAC mencetuskan regresi dan pembersihan tumor manakala penyampaian campuran equimolar komponen memberikan faedah terapeutik yang minimum berbanding dengan trastuzumab sahaja (Rajah 4A). Kajian seterusnya yang membandingkan ISAC yang disasarkan tumor dengan kawalan isotype yang sesuai mengesahkan bahawa aktiviti anti-tumor memerlukan penyasaran tumor (Rajah 4B dan Rajah Tambahan 10). Yang penting, pentadbiran sistemik ISAC trastuzumab T785- dan kawalan isotaipnya diterima dengan baik, dengan kesan minimum pada berat badan (Tambahan Rajah 11).Untuk menentukan sama ada mekanisme tindakan yang menyumbang kepada keberkesanan ISAC dalam vivo adalah serupa dengan yang diterangkan secara in vitro, Fc-incompetent (trastuzumab N297A-ISAC) dan trastuzumab TLRnull-ISACs telah diuji dalam model xenograf tumor payudara yang sama dalamselari dengan jenis liar trastuzumab T785-ISAC.Walaupun trastuzumab T785-ISAC membawa kepada regresi dan pembersihan tumor, kedua-dua ISAC yang tidak cekap Fc dan TLRnull gagal menimbulkan aktiviti anti-tumor (Rajah 4C).Bersama-sama data ini menunjukkan keperluan untuk penyasaran tumor dan kedua-dua penglibatan Fc R dan TLR untuk aktiviti anti-tumor ISAC.

Sumbangan pembezaan neutrofil berbanding sel myeloid lain dalam mengantarkan kesan anti-tumor dinilai oleh pengurangan khusus sel.Neutrofil telah habis menggunakan antibodi Ly6G, manakala kekurangan kedua-dua neutrofil dan APC yang tidak matang (monosit)dicapai dengan antibodi anti-Gr1.Sel fagositik telah habis menggunakan liposom yang dimuatkan clodronate.Kami mendapati bahawa sel fagositik, mungkin makrofaj, menyumbang dengan ketara kepada pengantara aktiviti anti-tumor berikutan rawatan ISAC (Rajah 4D).Walau bagaimanapun, pengurangan neutrofil dengan anti-Ly6G tidak mempunyai kesan ke atas keberkesanan ISAC.Pengurangan Gr1 tidak serta-merta memberi kesan kepada keberkesanan pengantaraan ISAC tetapi mengurangkan tempoh kawalan tumor (Rajah 4D).Untuk menyiasat keupayaan T785-ISAC mengawal pertumbuhan tumor dalam model yang lebih rendahEkspresi HER2, kami seterusnya memodelkan keberkesanan dalam model tumor ekspresi sederhana yang tahan trastuzumab,2-HER, JIMT-1.Barisan sel kanser JIMT-1 dianggarkan mempunyai kira-kira 6.5 x105 salinan HER2 permukaan dan menyatakan tahap penguranganHER2 berbanding dengan garis sel tumor HCC1954 oleh sitometri aliran 43.Sementaratrastuzumab T785-ISAC dengan ketara memperlahankan pertumbuhan tumor berbanding dengan isotype ISAC atau kawalan trastuzumab, tiada regresi atau pelepasan tumor diperhatikan (Rajah 4E).Kami membuat hipotesis bahawa pertuzumab, yang mengikat epitope HER2 yang berbeza daripada tapak pengikatan trastuzumab, akan meningkatkan pengelompokan Fc, dan seterusnya meningkatkan ADCP dan keberkesanan ISAC dalam model JIMT-1.Gabungan trastuzumab T785-ISAC dengan pertuzumab membawa kepada keberkesanan yang dipertingkatkan dengan ketara dan regresi tumor yang ketara (Rajah 4F).Tanpa rangsangan imun trastuzumab T785-ISAC, gabungan pertuzumab dengan trastuzumab tidak memberikan manfaat.

Kami seterusnya menyiasat peristiwa molekul dan selular yang dicetuskan oleh trastuzumab T785-ISAC yang akhirnya menghasilkan keberkesanan anti-tumor.Perubahan ekspresi gen awal dalam tumortelah diukur dengan panel pemprofilan imun pan-kanser tetikus NanoString, mendedahkan peningkatan yang ketara sebanyak 13.7 peratus daripada gen dalam tempoh 24 jam rawatan termasuk gen yang dikaitkan dengan isyarat dan pengaktifan TLR7 (IRF-7, gen berkaitan NF-kB)berbanding dengan 0-0.1 peratus selepas rawatan trastuzumab atau isotype T785-ISAC (Rajah 4G) 44.Analisis laluan ekspresi gen yang dinilai oleh Skor Laluan Analisis Lanjutan nSolver mendedahkan pengawalseliaan ketara bagi tandatangan gen berkaitan imun utama (Fungsi Makrofaj, Fungsi DC, Pemprosesan & Persembahan Antigen) yangselaras dengan penemuan in vitro dan in vivo bahawa interaksi Fc-Fc R adalah kritikal untuk aktiviti pengantaraan ISAC (Rajah 4H dan Rajah Tambahan 12).Skor tandatangan gen yang dikaitkan dengan kemokin dan sitokin sangat tinggi selepas rawatan trastuzumab T785-ISAC, selaras dengan kuantifikasi protein yang dilakukan mengukur rembesan sitokin dan kemokin dalam tumor 24 jam selepas pentadbiran (Rajah 4Hdan Rajah Tambahan 13).Penemuan ini, bersesuaian dengan data keberkesanan in vitro dan in vivo, menunjukkan tindak balas pengantara TLR- dan Fc R yang teguh didorong oleh ISAC.

Sitometri aliran dan IHC digunakan untuk menilai sama ada peningkatan pengaktifan pengantara T785-ISAC dan ekspresi chemokine akhirnya membawa kepada pengambilan sel effector imun.Infiltrat imun myeloid telah diprofilkan oleh sitometri aliran 24 jam dan 7 hari selepas pentadbiran dos tunggal trastuzumab T785-ISAC atau trastuzumab dan dibandingkan dengan kawalan yang tidak dirawat.Analisis tumor 24 jam selepas rawatan didedahkanpenyusupan CD11b ditambah Ly6C ditambah monosit dan CD11b ditambah Ly6G ditambah granulosit dalam tumor yang dirawat dengan trastuzumab atau trastuzumab T785-ISAC berbanding dengan kawalan yang tidak dirawat (Rajah 4I).Tujuh hari selepas rawatan, CD11b ditambah CD11c ditambah F4/80 ditambah APC myeloid positif telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan trastuzumab T785-ISAC yang dirawat berbanding dengantrastuzumab atau kawalan yang tidak dirawat (Rajah 4I) 45,46.Peningkatan dalam APC myeloid ini mungkindisebabkan oleh peningkatan ketara dalam pengeluaran kemokin berkaitan myeloid berikutan rawatan trastuzumab T785-ISAC.Walaupun tidak terdapat peningkatan yang ketara dalam kekerapan APC myeloid pada 24-titik masa jam, sel fenotip ini diaktifkan selepas rawatan trastuzumab T785-ISAC, seperti yang diukur oleh pengawalseliaan CD40 pada permukaan sel , berbanding populasi yang sama daripada trastuzumab atau kawalan yang tidak dirawat (Rajah 4I).Dapatan ini, bersama-sama dengan data NanoString, menunjukkan lagi keupayaan trastuzumab T785-ISAC untuk melibatkan dan mengaktifkan sel mieloid dalam persekitaran mikro tumor.Memandangkan positif CD11b APC myeloid yang diperhatikan seminggu selepas rawatan, penyusupan awal monosit mungkin menjadi prekursor kepada populasi APC myeloid yang matang dalam tumor yang dirawat ISAC tetapi tidak dalam tumor yang dirawat trastuzumab.Walau bagaimanapun, masih perlu ditentukan bagaimana peristiwa proksimal pro-radang diukur 24 jam selepas rangsangan ISAC oleh NanoString dan MSD akhirnya mempengaruhi peristiwa distal seperti kematangan sel mieloid dalam persekitaran mikro tumor yang berubah pada 6-titik masa hari kemudian , dan akhirnya, mempengaruhi regresi dan pembersihan tumor.
Akhir sekali, IHC dilakukan untuk menilai kehadiran dan lokasi populasi sel imun utama dalam tumor berikutan rawatan dengan trastuzumab T785-ISAC berbanding dengan kawalannya.Selaras dengan sitometri aliran hari ke-7, F4/80 mengekspresikan sel masukkawasan tumor dan peritumoral telah dinaikkan pada hari ke-9 selepas rawatan tunggal dengan trastuzumab T785-ISAC (Rajah 4J).Tambahan pula, rawatan ISAC yang disasarkan menghasilkan peningkatan dramatik dalam sel CD11c plus di kawasan peritumoral yang tidak dilihat selepas rawatan atau rawatan antibodi rHER2 dengan isotype atau isotype-ISAC (Rajah 4J).Ketinggian dalam CD11c plus sel oleh kedua-dua sitometri aliran dan IHC juga dibuktikan dalam data NanoString, di mana ekspresi mRNA ITGAX meningkat dengan ketara pada hari 6 dan 9 selepas pentadbiran trastuzumab T785-ISAC (Tambahan Rajah 14).

Rajah 5: T785-ISAC menimbulkan kesan anti-tumor yang mantap dalam model tumor syngeneik MMC. (ah) Tikus FVB / N-TgN (MMTV-Erbb2) telah ditanam dengan garis sel tumor MMC. ( a ) Tikus betina secara rawak apabila jumlah tumor mencapai kira-kira 500 mm3. Tikus kemudian dirawat melalui suntikan intraperitoneal dengan 5 mg/kg q5d x 2 antibodi HER2 anti tikus tikus, HER2 T{16}}ISAC atau isotype T{17}}ISAC (TA99) (n) =4-7 tikus setiap lengan). ( b, c ) Tikus jantan secara rawak apabila jumlah tumor mencapai kira-kira 500 mm3 dan telah dirawat terlebih dahulu bermula sehari sebelum tarikh rawatan awal dengan liposom yang dimuatkan clodronate atau kawalan untuk pengurangan fagosit (6 kitaran, hingga Hari 15) atau anti -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 hari selepas rawatan terakhir mereka dicabar dengan garis sel tumor MMC. Tikus naif tumor berfungsi sebagai kawalan implantasi (n=5 tikus setiap kumpulan). (ad) Data mewakili sekurang-kurangnya 2 percubaan. Tikus telah dibunuh secara manusiawi setelah tumormencapai 2,000 mm3. Data ditunjukkan untuk kumpulan yang tiada tumor telah dicapai2,000 mm3. (ei) Kohort tikus secara rawak apabila jumlah tumor tumor MMC mencapai kira-kira 500 mm3 dan dirawat dengan 5 mg/kg ISAC atau antibodi kawalan yang didos pada hari 0 dan hari 5. Tumor telah diproses untuk pengukuran sitokin oleh MSD , analisis flow cytometry, kuantifikasi mRNA NanoString, atau formalin-fixed dan parafin-embedded untukimunohistokimia pada masa yang ditunjukkan. (e) Plot gunung berapi menggambarkan perubahan log2 kali ganda ekspresi gen dalam tumor kawalan yang dirawat vs isotype yang diukur oleh NanoString pada 24 jam (n=5 tikus setiap kumpulan). Perubahan dengan nilai p terlaras < 0.05="" ditunjukkan="" dalam="" warna="" merah.="" (f)="" skor="" tandatangan="" gen="" yang="" dikuantifikasi="" oleh="" skor="" laluan="" analisis="" lanjutan="" nsolver="" untuk="" tumor="" yang="" dianalisis="" 24="" jam="" selepas="" rawatan="" (n="5" tikus="" setiap="" kumpulan).="" (g,="" h)="" analisis="" sitometri="" aliran="" komposisi="" selular="" tumor="" dan="" keadaan="" pengaktifan="" 24="" jam="" dan="" 6="" hari="" selepas="" permulaan="" rawatan="" (n="4" tikus="" setiap="" kumpulan).="" data="" mewakili="" sekurang-kurangnya="" 2="" percubaan.="">Imej perwakilan serta kuantifikasi F4/80, CD11c, dan CD8 IHC tumor yang dituai 6 hari selepas setiap rawatan yang ditunjukkan. Bar skala ialah 50 μm. (ai) Data dilaporkan sebagai min dan SEM; *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

T{1}}ISAC sasaran tumor menimbulkan regresi tumor dalam model tumor MMC syngeneik
Untuk menilai kapasiti ISAC untuk menengahi keberkesanan anti-tumor dengan kehadiran sel B, T, dan NK, kami menggunakan garis sel karsinoma mamma (MMC) tikus syngeneik tikus syngeneik HER2 (rHER2) yang berasal dari mamma spontan. karsinoma dalam rHER2- mengekspresikan tikus FVB.Untuk meminimumkan imunogenisiti rentas spesies yang dikaitkan dengan ekspresi rHER2 dalam MMC, tikus transgenik yang secara endogen mengekspresikan Her2 tikus di bawah kawalandaripada penganjur MMTV telah digunakan sebagai hos (Tambahan Rajah 15) 47. Memanfaatkan kehadiran sistem imun yang utuh sepenuhnya, kami bertujuan untuk menilai keupayaan ISAC untuk memerangi tumor dengan beban tumor yang besar sebanyak 500 mm3, kerana tumor yang lebih besar secara amnya lebih sukar untuk dirawat dalam model pra-klinikal 48. Pentadbiran sistemik semua rawatan, termasuk rHER2 T785-ISAC, diterima dengan baik, dengan kesan minimum pada berat badan (Tambahan Rajah 16A). Hanya rHER2 T785-ISAC, walau bagaimanapun, dapat menyembuhkan tikus yang mempunyai tumor yang besar dan mantap (Rajah 5A). Seperti yang dilihat dalam model xenograf, kajian pengurangan sel menunjukkan bahawa aktiviti anti-tumor yang ketara telah hilang apabila sel-sel fagosit telah habis dengan liposom yang dimuatkan clodronate (Rajah 5B). Walaupun ISAC tidak dijangka bertindak secara langsung pada sel T, tikus yang telah dirawat terlebih dahulu dengan antibodi{17}}CD kehilangan keupayaan untuk membersihkan tumor selepas dua pentadbiran rHER2 T785-ISAC (Rajah 5C). Ini menunjukkan ISAC yang disasarkan tumor boleh bertindak secara tidak langsung melalui sel T, berikutan pembentangan antigen yang berkaitan dengan tumor. Selaras dengan kehadiran memori imunologi, tikussembuh daripada tumor MMC berikutan rawatan RHER2 T785-ISAC dilindungi daripada cabaran semula tumor (Rajah 5D).

Untuk menyiasat lebih lanjut mekanisme yang mendasari keberkesanan ISAC dalam model syngeneic, kami seterusnya menyiasat perubahan selular, transkrip dan sitokin dalam persekitaran mikro tumor berikutan dos ISAC. Dua kohort tikus yang mempunyai tumor MMC besar telah dirawat dengan rHER2 T785-ISAC atau kawalan. Tumor dari kohort pertama dituai 24 jam selepas dos (Hari 1) apabila semua tumor mempunyai saiz yang sama (Tambahan Rajah 16B). Kohort yang lain diberi dos kedua 5 hari selepas yang pertama, kemudian dituai 24 jam kemudian (Hari ke-6), di mana tumor dalam semua kumpulan rawatan telah berkembang dengan ketara kecuali yang dirawat dengan T785-ISAC (Tambahan Rajah 16B ). Tumor dianalisis oleh IHC, ekspresi mRNA, dan rembesan sitokin dalam lisat protein. Menyokong lebih lanjut pemerhatian kami dalam model xenograf bahawa penyasaran tumor diperlukan untuk aktiviti ISAC, analisis mRNA tumor 24 jam selepas rawatan rHER2 T785-ISAC menunjukkan regulasi dramatik sebanyak 34.1 peratus daripada gen dalam imunisasi pan-kanser tetikus NanoString panel profil berbanding tumor yang dirawat isotype. Antibodi anti-rHER2 sahaja mempunyai sedikit impak pada ekspresi gen (3.5 peratus daripada gen yang dianalisis) manakala isotype T785-ISAC yang tidak disasarkan tidak menjejaskan ekspresi gen (Rajah 5E). Seperti yang dilihat dalam model xenograf HCC1954, gen yang dikaitkan dengan isyarat pengantaraan TLR7-dan pengaktifan dikawal dengan ketara oleh rHER2 T785-ISAC yang menyasarkan tumor, yang menunjukkan tindak balas pengantaraan TLR yang mantap (Rajah 5E). Analisis laluan ekspresi gen sekali lagi mendedahkan pengawalseliaan ketara bagi tandatangan gen berkaitan imun utama, termasuk tandatangan untuk analisis laluan ekspresi gen, mendedahkan pengawalseliaan ketara tandatangan gen berkaitan imun utama selepas rawatan rHER2 T785-ISAC, termasuk yang dikaitkan dengan kemokin dan sitokin (Rajah 5F). Kuantifikasi protein dilakukan pada tumor yang sama seperti yang dianalisis oleh NanoString, dan selaras dengan penemuan tandatangan gen, paras sitokin dan kemokin pro-radang yang meningkat dengan ketara diukur pada 24 jam selepas rawatan rHER2 T785-ISAC (Tambahan Rajah 17). ). Skor tandatangan gen juga meningkat dengan ketara untuk Pemprosesan & Pembentangan Antigen, Fungsi Sel Dendritik dan Fungsi Makrofaj, seterusnya menyokong tindak balas pengantara anFc-Fc R dan didorong fagositosis 24 jam selepas rHER2 T785-ISACrawatan (Rajah 5F dan Rajah Tambahan 18). Sebagai tambahan kepada skor tandatangan gen yang meningkat dengan ketara yang dikaitkan dengan tindak balas pengantara TLR dan Fc R yang mantap, skor tandatangan gen untuk Fungsi sel T juga meningkat dengan ketara dalam masa 24 jam selepas rawatan rHER2 T785-ISAC, seterusnya menyokong mendapati bahawa sel T diperlukan untuk keberkesanan pengantaraan ISAC (Rajah 5F dan Rajah Tambahan 18).

Untuk mencirikan sel-sel imun yang boleh menyumbang kepada peningkatan awal dalam pengeluaran sitokin dan kemokin proinflamasi, tumor dianalisis oleh sitometri aliran 24 jam selepas dos pertama rHER2 T785-ISAC atau kawalan, dan 6 hari selepas permulaan rawatan, 24 jam selepas dos kedua. Analisis tumor pada Hari 1 mendedahkan penyusupan CD11b ditambah Ly6C serta monosit dalam tumor yang dirawat dengan rHER2 T785-ISAC dan CD11b ditambah Ly6G ditambah granulosit dalam tumor yang dirawat dengan rHER2 mAb atau rHER2 T785-ISAC , tetapi bukan ISAC atau kawalan antibodi isotaip (Rajah 5G). Tahap monosit meningkat lagi dalam tumor yang dirawat rHER2 T785-ISAC selepas 6 hari. Sama seperti apa yang kita perhatikan dalam model xenograf HCC1954, APC mieloid (CD11b campur CD11c tambah F4/80 tambah ) meningkat dengan ketara pada hari ke-6 selepas rawatan rHER2 T785-ISAC berbanding kawalan (Rajah 5G dan Rajah Tambahan 19 ). Tambahan pula, APC myeloid didapati diaktifkan secara khusus dalam kumpulan yang dirawat rHER2 T785- ISAC pada kedua-dua titik masa, seperti yang diukur oleh pengawalseliaan CD40 pada permukaan sel (Rajah 5H). Yang penting, peningkatan dalam APC myeloid tumor tidak diukur berikutan pengurangan fagosit menggunakan liposom yang dimuatkan clodronate (Tambahan Rajah 20). Akhir sekali, IHC dilakukan untuk menilai kehadiran dan lokasi populasi sel imun utama dalam model MMC berikutan rawatan dengan RHER2 T785-ISAC. Seperti yang dilihat dalam model xenograf HCC1954, rawatan dengan RHER2 T785-ISAC menghasilkan peningkatan dramatik dalam sel CD11c plus dan F4/80 plus di kawasan peritumoral yang tidak dilihat selepas rawatan atau rawatan antibodi rHER2 dengan isotype atau isotype T785-ISAC (Rajah 5I). Selaras dengan ekspresi awal kemokin sel T dan peningkatan skor tandatangan gen untuk Fungsi Sel T, penyusupan ketara sel CD8 tambah telah dilihat oleh IHC dalam tumor tikus yang dirawat rHER2 T785-ISAC pada hari ke-6, manakala Pewarnaan CD8 pada tikus yang dirawat dengan antibodi anti-rHER2 atau kawalan isotype kekal rendah (Rajah 5I). Peningkatan pewarnaan CD8 ditambah IHC, bersama-sama dengan ekspresi gen yang diperkuatkan bagi gen yang berkaitan dengan fungsi sel T dan pelepasan tumor bergantung8-CD, menyokong potensi T785-ISAC untuk menjadikan tumor sejuk menjadi panas.CL{ {58}}ISAC menimbulkan regresi tumor dalam HER2-medium mengekspresikan model tumor xenografUntuk menunjukkan bahawa ISAC ialah platform yang teguh merentas berbilang muatan merangsang imun, kami membangunkan ISAC menggunakan agonis TLR7 yang terkenal, CL264 dengan DAR setanding dengan trastuzumab T785-ISAC (Rajah 6A dan Rajah Tambahan 21). Kapasiti ISAC trastuzumab yang dihasilkan dengan CL264 atau T785 untuk menengahi pengaktifan myeloid intra-tumoral dinilai dalam model xenograf HCC1954 24 jam selepas satu pentadbiran trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC atau trastuzumab T785-ISAC . Pengaktifan myeloid yang dipertingkatkan diperhatikan dengan trastuzumab CL264-ISAC seperti yang dibuktikan dengan peningkatan ekspresi CD40 pada CD11b yang menyusup tumor ditambah CD11c ditambah F4/80 ditambah APC myeloid berbanding dengan trastuzumab atau trastuzumab T785-ISAC (Rajah 6B ).Untuk menentukan sama ada kapasiti pengaktifan myeloid yang dipertingkatkan CL264-ISAC diterjemahkan kepada aktiviti anti-tumor yang lebih besar dalam vivo, trastuzumab CL264-ISAC telah dibandingkan denganT785-ISAC dalam model tumor HER2High HCC1954 dan HER2Med JIMT-1. Manakala kedua-duanyatrastuzumab ISACs mengantarkan regresi tumor lengkap dalam model HCC1954 HER2High, CL264-ISAC menunjukkan peningkatan aktiviti anti-tumor dalam model JIMT-1 HER2Med yang menunjukkan bahawa potensi ISAC dan keupayaan untuk menyasarkan tumor ketumpatan antigen yang lebih rendah mungkin dipautkan (Rajah 6C–D).

Kedua-dua ISAC diterima dengan baik, tetapi kami memerhatikan penurunan berat badan sementara sebanyak 5-10 peratus pada haiwan yang dirawat dengan sama ada trastuzumab CL264-ISAC atau rituximab CL264-ISAC, dengan berat badan pulih kepada atau melebihi garis dasar dengan dos ketiga (Tambahan Rajah 16A). Rembesan sitokin sistemik diukur selepas rawatan dengan T785-ISAC atau CL264-ISAC. Tahap rendah TNF diukur dalam serum haiwan empat jam selepas pentadbiran T785-ISAC, manakala kedua-dua CL264-ISAC yang disasarkan dan isotaip menimbulkan tahap rembesan TNF yang lebih tinggi secara sistemik (Tambahan Rajah 11) . Tidak mungkin kesan antara T785 dan CL264 ISAC ini disebabkan oleh kesan langsung ISAC pada pertumbuhan sel tumor, kerana ISAC tidak menghalang percambahan sel kanser secara in vitro (Tambahan Rajah 9).

CL264-ISAC menimbulkan pelepasan tumor dan ingatan imunologi dalam model tumor syngeneik Memandangkan peningkatan potensi dan keberkesanan yang diperhatikan dengan CL264-ISAC dalam model xenograf tumor manusia dengan ketumpatan antigen HER2 yang berbeza-beza, kami seterusnya mencirikan aktiviti CL 264-ISAC dalam model tumor syngeneik. Sama seperti T785-ISAC dalam model MMC, CL264-ISAC membawa kepada regresi dan pembersihan tumor dalam cara yang bergantung kepada sel T, yang membawa kepada ingatan imunologi yang tahan lama (Tambahan Rajah 22A). Untuk menilai keberkesanan ISAC dalam model tumor syngeneik dengan ekspresi antigen yang dikurangkan, kami membangunkan garisan sel CT26 yang secara stabil menyatakan HER2 tikus (CT26-rHER2). Yang penting, kira-kira 8.5 peratus daripada sel CT26 tidak menyatakan rHER2 selepas implantasi tumor (Rajah 6E). Tikus Wildtype Balb/c yang dirawat dengan rHER2 CL264-ISAC menunjukkan imuniti anti-tumor yang besar dalam 75 peratus (6 daripada 8) tikus membersihkan tumor mereka dan kekal bebas tumor sepanjang tempoh percubaan, manakala tiada tikus yang dirawat dengan antibodi anti-rHER2 mempunyai regresi lengkap (Rajah 6F). Kehilangan berat badan sementara kira-kira 10 peratus berat badan berikutan rawatan rHER2 CL264-ISAC diperhatikan, dengan berat badan pulih selepas lapan hari selepas permulaan kajian (Tambahan Rajah 22B). Kami menilai sama ada memori imunologi pengantara rHER2 CL264-ISAC terhadap tumor yang tidak mempunyai ekspresi antigen yang disasarkan, rHER2, dengan mencabar tikus yang telah disembuhkan sebelum ini daripada tumor CT26-rHER2 dengan talian sel CT26 ibu bapa yang kekurangan rHER2 ungkapan. Tikus yang sebelum ini disembuhkan daripada tumor CT26-rHER2 dengan rHER2 ISAC telah dilindungi sepenuhnya daripada cabaran dengan garisan sel CT26 ibu bapa (Rajah 6I). Kehabisan sel T CD4 dan CD8 sebelum cabaran semula tumor menunjukkan bahawa sel T diperlukan untuk perlindungan. Akhirnya, kami menguji sama ada memori imunologi yang dibangunkan pada tikus yang sebelum ini disembuhkan dengan ISAC adalah khusus untuk antigen yang berkaitan dengan tumor tumor utama yang dirawat. Semasa cabaran semula tumor CT26 ibu bapa, tikus secara serentak dicabar dengan tumor yang berbeza, 4T1, ditanam di sayap kontralateral. Data menunjukkan bahawa perkembangan ingatan imunologi adalahkhusus untuk antigen berkaitan tumor CT26 yang berbeza daripada rHER2, kerana pertumbuhan tumor tumor 4T1 tidak terjejas (Rajah 6G).