Pengenalpastian EST Responsif Hidrogen Peroksida yang Terlibat dalam Biosintesis Glikosida Phenylethanoid dalam Kultur Sel Salsa Cistanche

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

J. CHEN et al

Abstrak
Hidrogen peroksida ialah elisitor abiotik yang berkesan yang boleh mendorong biosintesis metabolit sekunder dalam tumbuhan. Kami menunjukkan bahawa dalam budaya penggantungan sel tumbuhan ubatan yang tahan garamCistanchesalsa, penghasilan komponen bioaktifphenylethanoidglikosida(PeGs) telah meningkat selepas rawatan H2O2. Untuk mengenal pasti gen yang berkaitan dengan PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis yang terjejas oleh H2O2, kami membina perpustakaan hibridisasi subtraktif penindasan gen responsif H2O2 menggunakanCistanchesalsasel dan mengenal pasti 105 tag jujukan (EST) dan 85 gen. Anotasi fungsi perpustakaan EST dan analisis ontologi gen menunjukkan gen yang berkaitan dengan pelbagai tindak balas tekanan, biosintesis metabolit sekunder, dan peraturan transkrip. Antaranya, kami mengenal pasti dua gen yang berkaitan dengan PeG(phenylethanoidglikosida)laluan biosintesis (4-coumarate coenzyme A ligase dan sinamat 4-hydroxylase), dan dua faktor transkripsi jenis WRKY. Ekspresi gen terpilih selepas rawatan H2O2 dianalisis oleh RT-qPCR. Transkripsi awal peningkatan PeG(phenylethanoidglikosida)gen laluan biosintesis selepas rawatan mendedahkan bahawa H2O2 mendorong PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis melalui pengawalseliaan gen utamanya.
Kata kunci tambahan: cinnamate-4-hydroxylase, 4-coumarate coenzyme A ligase, suppression subtractive hybridization.Cistanchesalsa. phenylethanoidglikosida.

pengenalan

Cistanchesalsaialah parasit tumbuhan saka pada akar Haloxylos ammodendrun, dan ia tumbuh di kawasan padang pasir di barat China. Selama berabad-abad,Cistanchespesis telah digunakan sebagai ubat herba tradisional (Wang et al. 2012). Komponen bioaktif ialahphenylethanoidglikosida(PeGs) yang mempunyai kesan yang luar biasa terhadap pelepasan spesies oksigen reaktif (ROS), perlindungan sinaran, peningkatan imuniti dan anti-penuaan (Nan et al. 2013). PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis dalamCistanchedimulakan daripada fenilalanin (Rajah 1 Suppl.) dan asid kafeik yang disintesis diglikosilasi lagi untuk membentuk pelbagai PeG(phenylethanoidglikosida)(Wang et al. 2012). Tiga PeG utama(phenylethanoidglikosida), echinacoside, acteoside, dan 2'-acetylacteoside, dianggap sebagai komponen paling aktif dalamCistanche(Kobayashi et al. 1984). Untuk meningkatkan kandungan mereka dalamCistanchekultur sel, pelbagai elisitor telah diuji termasuk kitosan, putrescine, Ag plus, dan tegasan osmotik (Ouyang et al. 2005a,b, Cheng et al. 2005, 2006, Liu et al. 2007, Liu dan Cheng 2008). Walau bagaimanapun, gen yang terlibat dalam PeGs(phenylethanoidglikosida)biosintesis dalamCistanche, terutamanya gen laluan metabolisme fenilalanin, jarang dikenal pasti. Hanya gen pengekodan fenilalanin ammonia-lyase (PAL) baru-baru ini dikenal pasti dalam Cistanche deserticola (Hu et al. 2011). Pengekodan gen lain, contohnya, sinamat-4-hidroksilase (C4H), yang boleh memangkinkan penukaran sinamat kepada asid cumarik, dan 4-coumarate coenzyme A ligase (4CL), gen penting untuk lignin dan flavanoid biosintesis, tidak ditemui dalamCistanche.
Kami menggunakan budaya selCistanchesalsauntuk mengkaji PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis dan ekspresi gen yang berkaitan. Kami juga menyiasat kesan elicitor H2O2 yang berkesan pada PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis. Tambahan pula, untuk mencari gen responsif awal yang terlibat dalam PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis, kami menjalankan penghibridan tolak penindasan (SSH) untuk membina pustaka cDNA bagi gen H2O2-responsif.

Rajah 1. Ekspresi gen relatif ditentukan oleh RT-qPCR selepas rawatan H2O2. CsWRKY1 - Faktor transkripsi WRKY (Contig07), CsC4H1 - cinnamate 4-hydroxylase (Contig09), Cs4CL1 - 4-courate: ligase (Contig03), CsHSP{13}} protein kejutan haba 70 kDa (Contig 01) dan CsSOD{16}} superoxide dismutase (Contig16). Sel telah dirawat dengan 80 ug dm{19}} H2O2 dalam medium cecair selama 2 jam dan ekspresi dibandingkan dengan kawalan yang dirawat dengan air. Bermakna tambah - SD tiga ulangan biologi; * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>

Bahan dan kaedah

Barisan sel CS2001 ditubuhkan daripada kelopakCistanchesalsa(CA Mey.) Beck dikumpulkan di wilayah Neimenggu dan disubkultur. Kaedah kultur adalah serupa dengan protokol yang diterbitkan sebelum ini (Liu et al. 2007). Umumnya, medium pepejal Murashige dan Skoog (1962; MS) digunakan untuk subkultur dan medium cecair untuk PeGs.(phenylethanoidglikosida)biosintesis (ia adalah medium MS yang diubah suai ditambah dengan 30 g dm-3 glukosa dan 2.0 mg dm-3 indol-3-asid asetik). Untuk rawatan H2O2, 5.0 ± 0.2 g sel dalam tempoh pertumbuhan yang cepat, biasanya 20 hingga 30 hari selepas ia disubkultur dalam medium pepejal, telah diinokulasi ke dalam medium cecair 50 cm3 dalam kelalang Erlenmeyer 250 cm3. dan dibiakkan dalam gelap dengan atau tanpa kepekatan H2O2 yang berbeza. PeGs(phenylethanoidglikosida)kandungan selepas 10 d aruhan oleh H2O2 dianalisis mengikut kaedah yang diterbitkan sebelum ini (Liu et al. 2007) berdasarkan kromatografi cecair berprestasi tinggi fasa terbalik dengan elusi kecerunan metanol.

Sel-sel 2 jam selepas rawatan H2O2 dikumpulkan daripada medium dengan kertas turas menggunakan corong Büchner, dan kemudiannya dibekukan dalam nitrogen cecair dan dikisar menjadi serbuk. Setiap 2 g serbuk sel telah dilisiskan menggunakan campuran 1 cm3 2-mercaptoethanol, 1 cm3 daripada 200 g dm{{10}} sarcosyl, dan 8 cm3 penimbal GTC (5 M guanidinium isothiocyanate, 62.5 mM Tris-HCl, pH 8.0, 6.25 mM EDTA, pH 8.0, 5 mM thiourea, dan 10 mM dithiothreitol). Sel-sel itu kemudiannya diinkubasi di atas ais selama 15 minit, kemudian 1/3 isipadu 8.5 M CH3COOK, pH 6.0, ditambah, dan sel-sel itu diinkubasi pada ais selama 15 minit dan kemudian disentrifugasi pada 15 000 g selama 15 minit . Supernatan itu ditambah kepada isipadu isopropanol yang sama untuk memendakan jumlah RNA. Jumlah RNA telah disucikan lagi oleh kit mini RNeasy (Qiagen, Hilden, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengeluar. RNA Messenger telah diasingkan daripada jumlah RNA menggunakan kit midi mRNA Oligotex (Qiagen).

phenylethanoidglikosidadalamCistancheSalsa

Pustaka SSH telah dijana daripada kawalan dan 30 peratus H2O2-menimbulkan sampel sel 2 jam selepas elisitasi menggunakan kit penolakan cDNA pilihan PCR (Clontech, Mountain View, USA). Untuk pembinaan perpustakaan, produk telah disucikan secara berasingan menggunakan kit penulenan gel (Qiagen) dan diklonkan ke dalam vektor pGEM menggunakan kit pengklonan TA (Tiangen, Beijing, China). Plasmid daripada klon bebas telah diasingkan dan disusun menggunakan primer T7. Semua jujukan tag jujukan (EST) dari perpustakaan (dengan jujukan vektor dialih keluar) digunakan untuk pemasangan contig dengan CAP3 (//doua.prabi.fr/software/cap3). EST telah dikumpulkan ke dalam contigs dan singletons; mereka digunakan untuk carian homologi menggunakan program BLASTx di NCBI (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Urutan kemudian diberi anotasi, dianalisis dan dikelaskan mengikut istilah ontologi gen (GO) menggunakan Blast2GO (//www. blast2go.com).
Tindak balas rantai polimerase kuantitatif masa nyata (RT-qPCR) telah dilakukan mengikut Bustin et al. (2009). Sampel cDNA telah disintesis menggunakan kit reagen PrimeScript RT (Takara, Dalian, China) daripada 0.5 ug daripada jumlah RNA. RT-qPCR telah dijalankan menggunakan kit SYBR Premix Ex Taq II dan ROX plus (Takara) pada sistem PCR masa nyata ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, USA) dengan tiga replika teknikal. Primer direka bentuk menggunakan perisian Primer3 dalam talian mengikut arahan yang dibekalkan oleh Takara; primer yang digunakan dalam kajian ini disenaraikan dalam Jadual 1 Suppl. Ekspresi gen telah dinormalisasi kepada RNA 18S, ekspresi yang stabil dalam semua sampel.

Keputusan dianalisis menggunakan R versi 3.1.1, kepentingan perbezaan telah disahkan oleh ujian-t Pelajar.

Keputusan

Hidrogen peroksida yang disebabkan oleh biosintesis ketiga-tiga PeG utama(phenylethanoidglikosida)dalamCistanchesalsasel penggantungan (Jadual 1) tetapi tanpa kesan yang jelas terhadap pertumbuhan sel (Rajah S2). Kandungan echinacoside sudah meningkat selepas rawatan 10 ug dm-3 H2O2 (P < 0.05),="" peningkatan="" yang="" lebih="" tinggi="" telah="" direkodkan="" selepas="" 20="" ug="" dm="" -3="" rawatan="" h2o2="" (p="">< 0.01),="" dan="" peningkatan="" tertinggi="" adalah="" selepas="" rawatan="" 40,="" 80="" dan="" 160="" ug="" dm-3="" h2o2.="" keputusan="" yang="" sama="" ditunjukkan="" untuk="" acteoside,="" tetapi="" kandungannya="" memuncak="" selepas="" rawatan="" 80="" ug="" dm-3="" h2o2.="" biosintesis="" 2'-acetylacteoside="" adalah="" kurang="" sensitif="" terhadap="" rawatan="" h2o2;="" peningkatan="" ketara="" kandungannya="" (p="">< 0.05)="" adalah="" pada="" kepekatan="" h2o2="" melebihi="" 40="" ug="" dm-3.="" selepas="" rawatan="" 80="" ug="" dm-3="" h2o2,="" jumlah="" ketiga-tiga="" peg="">(phenylethanoidglikosida)meningkat dengan ketara (P < 0.01)="" berbanding="" kawalan.="" oleh="" itu,="" kepekatan="" ini="" digunakan="" dalam="" eksperimen="">
Untuk menjana perpustakaan yang diperkaya untuk gen responsif awal yang dikawal selia oleh H2O2, kami menggunakan cDNA daripadaCistanchesalsasel penggantungan dirawat dengan 80 ug dm-3 H2O2 selama 2 jam. Penjujukan satu laluan 129 klon rekombinan dalam perpustakaan SSH menghasilkan 105 EST bersih selepas pengecualian jujukan vektor. EST yang jelas ini digunakan untuk pemasangan oleh CAP3, dan 18 contigs dan 67 singleton telah dihasilkan (Jadual 2). Oleh itu, 85 gen telah diasingkan di perpustakaan ini. Purata panjang 105 EST bersih ialah 527 bp, yang memadai untuk klasifikasi fungsi berasaskan persamaan jujukan.

phenylethanoidglikosidadalamCistancheSalsa

Kesemua 85 gen yang diperolehi dalam perpustakaan telah diambil oleh BLASTx terhadap pangkalan data protein tidak berlebihan GenBank untuk persamaan jujukan (E-nilai Kurang daripada atau sama dengan 0.001). Dua puluh satu gen tidak menunjukkan hits dalam pangkalan data, ia mungkin khusus untuknyaCistanchesalsa. Keputusan dengan BLASThits telah diimport ke perisian Blast2GO untuk analisis pengayaan laluan GO dan KEGG selanjutnya. Daripada 64 gen dengan hits BLAST, 50 telah dianotasi mengikut perihalan gen homolog daripada spesies lain. Gen beranotasi dinamakan mengikut perihalan hits BLAST. Analisis GO (Rajah 3 Suppl.) menunjukkan bahawa antara 50 gen ini, terdapat 14 gen yang terlibat dalam tindak balas terhadap rangsangan, dan lebih 30 gen yang berkaitan dengan proses metabolik (Jadual 1 dan 2). Antara gen ini, dua homolog gen laluan biosintesis PeG telah diasingkan seperti yang dijangkakan: 4-coumarate coenzyme A ligase (dinamakan Cs4CL1: Contig03) dan cinnamate 4-hydroxylase (dinamakan CsC4H1: Contig14). Selanjutnya, RT-qPCR dilakukan untuk mengesahkan ekspresi gen yang diinduksi dari perpustakaan selepas rawatan H2O2.

Untuk mengesahkan bahawa gen penting yang dikenal pasti dari perpustakaan SSH adalah responsif terhadap rawatan H2O2, ungkapan dua PeG(phenylethanoidglikosida)gen berkaitan laluan biosintesis (Cs4CL1, CsC4H1), dua gen yang disebabkan oleh ROS (CsSOD1: Contig 16, CsHSP1: CISTH099), dan satu gen seperti faktor transkripsi keluarga WRKY (CsWRKY1: Contig 07) diukur oleh RT-qPCR selepas rawatan dengan H2O2 (Rajah 1). Ungkapan CsC4H1, Cs4CL1, CsSOD1 dan CsWRKY1 dikawal selia lebih daripada 15-kali ganda, 3-lipat ganda, 45-kali ganda dan 4-kali ganda, masing-masing 2 jam selepas H2O2 rawatan. Ekspresi CsHSP1 telah diubah hanya 1.8 kali ganda selepas rawatan H2O2.
Tempoh masa bagi ungkapan CsWRKY1, CsC4H1, dan Cs4CL1 selepas rawatan H2O2 dianalisis selanjutnya oleh RT-qPCR (Rajah 2). Ungkapan CsC4H1 dan Cs4CL1 telah meningkat dengan sangat tinggi (masing-masing melebihi 80-kali ganda dan 50-kali ganda) selepas rawatan 16-h dan kemudian dikawal ke bawah selepas 32 jam. Ungkapan CsWRKY1 dikawal selia lebih daripada 20-kali ganda pada 4 jam dan kemudian menurun daripada 8 jam selepas itu (Rajah 2).

Rajah 2. Ungkapan relatif CsWRKY1 (A), CsC4H1 (B) dan Cs4CL1 (C) pada masa yang berbeza selepas rawatan dengan 80 ug dm-3 H2O2. Ungkapan telah dinormalisasi kepada kawalan; (dirawat dengan air). Bermakna tambah - SD tiga ulangan biologi; * - P < 0.05,="" **="" -="" p=""><>

Perbincangan

Hidrogen peroksida adalah elisitor tumbuhan yang terkenal yang menunjukkan pelbagai kesan pada tumbuhan. Seperti ROS, ia boleh mendorong sistem penghapusan ROS yang terdiri daripada superoksida dismutase, katalase, peroksidase, dsb., dan ia berfungsi sebagai isyarat hiliran garam, osmotik, dan dehidrasi

tekanan (Wi et al. 2006, Kar 2011, Furlan et al. 2013, Sathiyaraj et al. 2014). Adalah dicadangkan bahawa penjanaan H2O2 dalam tumbuhan disertai dengan biosintesis metabolit sekunder teraruh dalamCistanchesalsakultur sel. Seperti yang dijangkakan, keputusan kami mendedahkan bahawa PeGs(phenylethanoidglikosida)biosintesis dalamsalsa cistanchekultur sel telah diinduksi selepas rawatan H2O2 (Jadual 1). Kandungan tiga PeG utama(phenylethanoidglikosida)meningkat selepas rawatan H2O2 yang menunjukkan peranan pentingnya dalam biosintesis PeGs. Gen yang diperkaya dalam perpustakaan SSH seterusnya mencadangkan kesannya pada PeG(phenylethanoidglikosida)induksi biosintesis dalamsalsa cistanche.

Banyak gen H2O2-responsif yang diketahui, seperti ascorbate peroxidase (CISTH069, Karyotou dan Donaldson 2005), h-quinone oxidoreductase (CISTH125, Bello, et al. 2001), CsSOD1, CsHSP1 (Baruah et al. 201). dan gen tindak balas rintangan penyakit (Contig10, Nanda, et al. 2010), telah diperkaya dalam perpustakaan SSH (Jadual 3, Jadual 2 Suppl.). Beberapa gen responsif ROS tipikal ini dengan ekspresi teraruh selepas rawatan H2O2 disahkan selanjutnya oleh RT-qPCR (Rajah 1 dan 2) yang menunjukkan bahawa perpustakaan SSH yang layak telah dibina di sini. Dua gen laluan biosintesis PeG, CsC4H1 dan Cs4CL1, juga ditemui dalam perpustakaan ini dan kedua-dua ekspresi gen ini telah diinduksi oleh rawatan H2O2 dalam cara yang bergantung pada masa (Rajah 2). Ia mencadangkan bahawa rawatan H2O2 menyebabkan PeGs(phenylethanoidglikosida)biosintesis pada peringkat genetik melalui peraturan gen laluan PAL. Walau bagaimanapun, PAL dan gen biosintesis PeG hiliran lain (Wang et al. 2012) tidak dikenal pasti dalam perpustakaan SSH; ia mungkin kerana perpustakaan tidak disusun dengan cukup. Hubungan antara ungkapan yang disebabkan oleh CsC4H1 dan Cs4CL1 dan peningkatan biosintesis PeG selepas rawatan H2O2 harus dijelaskan dengan analisis lanjut.

Sebagai tambahan kepada gen laluan PAL yang disebabkan oleh rawatan H2O2, dua faktor transkripsi keluarga WRKY (CsWRKY1, CsWRKY2) ditemui di perpustakaan SSH (Jadual 3 dan Jadual 2 Suppl.), dan ungkapan yang disebabkan oleh CsWRKY1 telah disahkan oleh RT-qPCR . Ekspresinya responsif terhadap rawatan H2O2 lebih awal daripada ekspresi dua gen laluan PAL, Cs4CL1 dan CsC4H1 (Rajah 2). Daripada kajian terdahulu, ekspresi bersama beberapa faktor transkripsi WRKY dan gen laluan PAL telah diperhatikan dalam beras (Gupta et al. 2012). Tambahan pula, ekspresi gen PAL dikawal selia dalam mutan ekspresi berlebihan OsWRKY03 (Liu et al. 2005). Dua faktor transkripsi keluarga WRKY yang disebutkan di atas mungkin juga terlibat dalam PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis dalamCistanchesalsa. Menariknya, EST berkaitan dehidrasi (CISTH067, CISTH064) ditemui di perpustakaan SSH, yang mungkin mencadangkan bahawa rawatan H2O2 berkaitan dengan ekspresi gen responsif dehidrasi dalamCistanchesalsaseperti yang diperhatikan pada tumbuhan lain (Schmidt et al. 2013, Zhou et al. 2013). Satu gen berkaitan isyarat gibberellin (GA), reseptor gibberellin gid1b-like (CISTH092), telah dikenal pasti dalam perpustakaan SSH yang membayangkan sambungan isyarat GA dan rawatan H2O2 dalamCistanchesalsa, yang juga dilaporkan dalam barli (Bahin et al. 2011). Walau bagaimanapun, lebih banyak kajian diperlukan untuk mengesahkan sama ada gen ini berkaitan dengan PeG(phenylethanoidglikosida)biosintesis. Selain daripada gen yang disebutkan di atas, pustaka SSH yang dibina di sini juga membentangkan gen dengan atau tanpa hits BLAST. Ia meningkatkan pemahaman kita tentang kesan H2O2 pada C. salsa dan mula-mula membekalkan maklumat gennya yang terlibat dalam biosintesis PeGs.

Kesimpulannya, kami menilai kesan H2O2 pada PeG(phenylethanoidglikosida)induksi dalamCistanchesalsakultur sel. Perpustakaan SSH telah dibina selepas rawatan H2O2, dan ekspresi gen terpilih telah disahkan oleh RT-qPCR. Dua gen berkaitan laluan biosintesis PeG dan gen H2O2-responsif lain telah dikenal pasti. Penemuan ini akan memanjangkan pemahaman kita tentang PeG tercetus H2O2-(phenylethanoidglikosida)biosintesis dalamCistanchesalsake peringkat molekul, menyediakan maklumat untuk manipulasi genCistanchesalsakultur sel untuk meningkatkan PeG(phenylethanoidglikosida)pengeluaran.

Daripada: ' Pengenalpastian EST responsif hidrogen peroksida yang terlibat dalam biosintesis glikosida phenylethanoid dalam kultur sel salsa Cistanche' olehJ. CHEN et al.

--- BIOLOGIA PLANTARUM 59 (4): 695-700, 2015 J. CHEN et al. DOI: 10.1007/s10535-015-0541-t

Rujukan

Bahin, E., Bailly, C., Sotta, B., Kranner, I., Corbineau, F., Leymarie, J.: Crosstalk antara spesies oksigen reaktif dan laluan isyarat hormon mengawal dorman bijirin dalam barli. - Persekitaran Sel Tumbuhan. 34: 980-993, 2011.
Baruah, K., Norouzitallab, P., Linayati, L., Sorgeloos, P., Bossie,r P.: Spesies oksigen reaktif yang dijana oleh produk induksi protein kejutan haba (Hsp) menyumbang kepada pengeluaran Hsp70 dan Hsp{{1} } pengantaraan imuniti perlindungan dalam Artemia franciscana terhadap vibrio patogenik. - Dev. Komp. Immunol. 46: 470-479, 2014.
Bello, RI, Gomez-Diaz, C., Navarro, F., Alcain, FJ, Villalba, JM: Ungkapan NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 dalam sel HeLa  peranan hidrogen peroksida dan fasa pertumbuhan. - J. biol. Kimia. 276: 44379-44384, 2001.
Bustin, SA, Vandesompele, J., Pfaffl, MW: Penyeragaman qPCR dan RT-qPCR. - Genet. En. Bioteknol. Berita 29: 40-43, 2009.
Cheng, XY, Wei, T., Guo, B., N, I W., Liu, CZ:Cistanchekultur penggantungan sel deserticola:phenylethanoidglikosidabiosintesis dan aktiviti antioksidan. - Proses Biokim. 40: 3119-3124, 2005.
Cheng, XY, Zhou, HY, Cui, X., Ni, W., Liu, CZ Penambahbaikanphenylethanoidglikosidabiosintesis dalamCistanchekultur ampaian sel deserticola oleh elisitor kitosan. - J. Bioteknol. 121: 253-260, 2006.
Furlan, A., Llanes, A., Luna, V., Castro, S.: Asid absisik mengantara pengeluaran hidrogen peroksida dalam kacang tanah yang disebabkan oleh tekanan air. - Biol. Tumbuhan. 57: 555-558, 2013.
Gupta, SK, Ra,i AK, Kanwar, SS, Chand, D., Singh, NK, Sharma, TR: Gen rintangan letupan berfungsi tunggal Pi54 mengaktifkan mekanisme pertahanan kompleks dalam beras. - J. exp. Bot. 63: 757-772, 2012.
Hu, GS, Jia, JM, Hur, YJ, Chung, YS, Lee, JH, Yun, DJ, Chung, WS, Yi, GH, Kim, TH, Kim, DH: Pencirian molekul gen ammonia-lyase fenilalanin daripadaCistanchedeserticola. - Mol. biol. Rep. 38: 3741-3750, 2011.
Kar, RK: Tindak balas tumbuhan terhadap tekanan air: peranan spesies oksigen reaktif. - Gelagat Isyarat Tumbuhan 6: 1741-1745, 2011.
Karyotou, K., Donaldson, RP: Ascorbate peroxidase, pemusnah hidrogen peroksida dalam membran glyoxysomal. - Lengkok h. Biokim. Biophys. 434: 248-257, 2005.
Kobayashi, H., Karasawa, H., Miyase, T., Fukushima, S.: Kajian tentang konstituencistancheadalah herba. 4. Pengasingan dan struktur 2 glikosida fenilpropanoid baharu, cistanoside-C dan cistanoside-D. - Kimia. Pharm. lembu jantan. 32: 3880-3885, 1984.

Liu, CZ, Cheng, XY: Peningkatanphenylethanoidglikosidabiosintesis dalam kultur sel bagiCistanchedeserticola oleh tekanan osmotik. - Rep. Sel Tumbuhan 27: 357-362, 2008.
Liu, JY, Guo, ZG, Zeng, ZL: Peningkatan pengumpulanphenylethanoidglikosidaoleh penyuapan prekursor kepada budaya penggantunganCistanchesalsa. - Biokim. En. J. 33: 88-93, 2007.
Liu, XQ, Bai, XQ, Qian, Q., Wang, XJ, Chen, MS, Chu, CC: OsWRKY03, pengaktif transkrip beras yang berfungsi dalam laluan isyarat pertahanan di hulu OsNPR1. - Sel Sel. 15: 593-603, 2005.
Murashige, T., Skoog, F.: Medium yang disemak untuk pertumbuhan pesat dan bioassay dengan kultur tisu tembakau. - Fisiol. Tumbuhan. 15: 473-497, 1962.
Nan, ZD, Zeng, KW, Shi, SP, Zhao, MB, Jiang, Y., Tu, PF:Phenylethanoidglikosidadengan aktiviti anti-radang daripada batangCistanchedeserticola ditanam di padang pasir Tarim. - Fitoterapia 89: 167-174, 2013.
Nanda, AK, Andrio, E., Marino, D., Pauly, N., Dunand, C.: Spesies oksigen reaktif semasa interaksi awal tumbuhan-mikroorganisma. - J. Integr. Biol Tumbuhan. 52: 195-204, 2010.
Ouyang, J., Wang, XD, Zhao, B., Wang, YC: Pengeluaran dipertingkatkanphenylethanoid glikosidadengan memberi prekursor kepada kultur selCistanchedeserticola. - Proses Biokim. 40: 3480-3484, 2005a.
Ouyang, J., Wang, XD, Zhao, B., Wang, YC: Peningkatan pengeluaranphenylethanoidglikosidaolehCistanchesel deserticola dibiakkan dalam bioreaktor pengangkat udara gelung dalaman dengan penaik penapis. - Mikrobiol Enzim. Tech. 36: 982-988, 2005b.
Salcedo-Morales, G., Jimenez-Aparicio, AR, Cruz-Sosa, F., Trejo-Tapia, G.: Pencirian anatomi dan histokimia haustorium in vitro daripada akar Castilleja tenuiflora. - Biol. Tumbuhan. 58: 164-168, 2014.
Sathiyaraj, G., Srinivasan, S., Kim, YJ, Lee, OR, Parvin, S., Balusamy, SR, Khorolragchaa, A., Yang, DC: Aklimasi hidrogen peroksida meningkatkan toleransi garam dengan mengaktifkan protein berkaitan pertahanan dalam Panax ginseng CA Meyer. - Mol. biol. Rep. 41: 3761-3771, 2014.
Schmidt, R., Mieulet, D., Hubberten, HM, Obata, T., Hoefgen, R., Fernie, AR, Fisahn, J., Segundo, BS, Guiderdoni, E., Schippers, JHM, Mueller-Roeber, B.: SALTRESPONSIVE ERF1 mengawal isyarat bergantung spesies oksigen reaktif semasa tindak balas awal kepada tekanan garam
dalam nasi. - Sel Tumbuhan 25: 2115-2131, 2013.
Wang, T., Zhang, XY, Xie, WY:Cistanchedeserticola YC Ma, "Ginseng Gurun": ulasan. - Amer. J. dagu. Med. 40: 1123-1141, 2012.
Wi, SG, Chung, BY, Kim, JH, Lee, KS, Kim, JS Corak pemendapan hidrogen peroksida dalam sarung daun beras di bawah tekanan garam. - Biol. Tumbuhan. 50: 469-472, 2006.
Zhou, XF, Jin, YH, Yoo, CY, Lin, XL, Kim, WY, Yun, DJ, Bressan, RA, Hasegawa, PM, Jin, JB: CYCLIN H1 mengawal tindak balas tekanan kemarau dan pembukaan stomata akibat cahaya biru oleh menghalang pengumpulan spesies oksigen reaktif dalam Arabidopsis. - Fisiol Tumbuhan. 162: 1030-1041, 2013.