Kesan Hipoglisemik Dan Hipolipidemik Blueberry Anthocyanin Oleh Pengaktifan AMPK: Kajian In Vitro Dan dalam Vivo Bahagian 1

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak:Beri biru kaya dengan anthocyanin bioaktif, dengan tahap malvidin yang tinggi, yang dikaitkan dengan faedah antioksidan yang menyumbang kepada mengurangkan risiko diabetes. Objektif kajian ini adalah untuk menyiasat kesan hipoglisemik dan hipolipidemik ekstrak antosianin beri biru (BAE),malvidin(Mv), malvidin-3-glukosida (Mv-3-GLC) dan malvidin-3-galactoside (Mv-3-gal) dalam kedua-dua saluran sel hepatokarsinoma manusia HepG2 dan dalam diet lemak menggabungkan tikus diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin. Rawatan glukosa tinggi dengan ketara meningkatkan tekanan oksidatif hepatik sehingga 6-kali ganda dan mengurangkan daya maju sel HepG2. Prarawatan dengan BAE, Mv, Mv-3-glc dan Mlv{10}}gal dengan ketara mengurangkan kerosakan ini dengan menurunkan spesies oksigen reaktif (ROS) sebanyak 87,80,76 dan 91 peratus dan meningkatkan daya maju sel masing-masing sebanyak 88,79,73, dan 98 peratus. Prarawatan ini juga berkesan menghalang hiperglikemia dan hiperlipidemia, masing-masing dengan mengurangkan tahap ekspresi enzim yang mengambil bahagian dalam glukoneogenesis dan lipogenesis dan meningkatkan mereka yang terlibat dalam glikogenolisis dan lipolisis, melalui laluan isyarat protein kinase(AMPK) diaktifkan adenosin monofosfat dalam sel HepG2. Untuk menentukan, peranan AMPK dalam tindak balas BAE yang disebabkan oleh glukosa dan metabolisme lipid dalam vivo, dos 100 mg/kg (ekstrak antosianin blueberry-kepekatan rendah, BAE-L) dan 400 mg/kg (ekstrak antosianin blueberry -kepekatan tinggi , BAE-H) ditadbir setiap hari kepada tikus diabetes selama 5 minggu. Rawatan BAE mempunyai signifikan (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">antosianinmenyumbang kepada ekstrak blueberry yang disebabkanhipoglikemiadan kesan hipolipidemik dalam diabetes dan BAE boleh menjadi makanan berfungsi atau ubat yang menjanjikan untuk rawatan diabetes.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Diabetes mellitus (DM) adalah penyakit terkenal yang biasanya dicirikan oleh ketidakupayaan untuk mengekalkan paras glukosa darah yang normal. Gangguan metabolik kronik ini menyebabkan kemudaratan serius kepada kesihatan manusia dan membebankan beban kewangan yang berat kepada sistem penjagaan kesihatan di seluruh dunia [1]. Penyakit ini dikelaskan kepada dua jenis utama berdasarkan punca disregulasi glukosa darah. DM Jenis 1 disebabkan oleh pemusnahan autoimun sel beta yang membawa kepada ketidakupayaan untuk menghasilkan insulin manakala diabetes jenis 2 dicirikan oleh reseptor insulin rintangan insulin, mempunyai fungsi yang berkurangan, tidak membenarkan sel bertindak balas secukupnya terhadap peningkatan glukosa darah.

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

Selain hiperglikemia, pesakit kencing manis cenderung mempunyaihiperlipidemiakedua-dua keadaan yang boleh mengakibatkan kerosakan pada organ dan tisu melalui peningkatan tekanan glycoxidative [2]. Penghasilan insulin dan kerosakan reseptor insulin adalah antara faktor yang menyebabkan hiperglisemia pada pesakit diabetes. Dalam hati, ekspresi berlebihan glukoneogenesis dan glikogenolisis memajak semula glukosa ke dalam aliran darah [3] manakala, dalam usus kecil, ekspresi berlebihan pengangkut glukosa 2(GLUT2) menyebabkan peningkatan dalam pengangkutan glukosa [4]. Hiperlipidemia yang disebabkan oleh ekspresi berlebihan lipogenesis dalam tisu adiposa [5] juga boleh menyebabkan penyerapan glukosa yang dirangsang insulin terjejas dan sintesis glikogen yang membawa kepada rintangan insulin dan dengan itu menyumbang kepada perkembangan diabetes 6]. Komplikasi jangka panjang yang berkaitan dengan diabetes menjejaskan pelbagai organ dan termasuk hipertensi, aterosklerosis, retinopati, nefropati, ulser kaki, dan neuropati periferal [7].

Pada masa ini tiada ubat untuk diabetes, bagaimanapun, kesannya dapat dikurangkan [8]. Bagi orang yang didiagnosis dengan diabetes jenis 1, gabungan peraturan diet, dan pengambilan insulin yang sesuai mengikut karbohidrat yang diambil adalah rawatan biasa. Cabaran semasa untuk pesakit diabetes jenis 1 termasuk ketidakupayaan atau kesukaran dalam menganggar jumlah karbohidrat dan dos insulin yang sesuai; namun, hampir idealglisemiktahap mungkin memandangkan kemajuan teknologi termasuk pam insulin [9]. Bagi pesakit yang menghidap diabetes jenis 2, rawatan mungkin lebih kompleks termasuk gabungan peraturan diet, senaman, insulin dan ubat-ubatan lain dengan pelbagai mekanisme tindakan yang berfungsi untuk menurunkan glukosa darah[10]. Cadangan pemakanan yang biasa adalah untuk diikuti. diet rendah karbohidrat [11,12].

Blueberry adalah salah satu buah yang boleh diambil oleh pesakit diabetes dan boleh mengurangkan risiko diabetes mellitus jenis 2 (T2DM) [13,14]. Blueberry kaya dengan pelbagai jenis sebatian yang bermanfaat untuk kesihatan manusia termasuk mineral, asid organik serat, asid fenolik, dan flavonoid termasuk flavonol dan antosianin [15,16]. Walau bagaimanapun, profil anthocyanin tipikal termasuk galactosides, glucosides, dan arabinoside delphinidin, malvidin, cyanidin, petunidin, dan peonidin [17] dengan malvidin dan delphinidin biasanya menjadi penyumbang utama kepada jumlah kandungan antosianin [18,19]. Dalam kajian terdahulu kami [20], malvidin adalah antosianidin yang paling banyak ditemui dalam ekstrak buah blueberry rabbiteye bersama-sama dengan delphinidin, cyanidin, petunidin, dan peonidin yang selaras dengan pengarang lain yang juga mendapati malvidin menjadi penyumbang penting kepada jumlah kandungan antosianin. dalam pelbagai jenis blueberry [17,21].

Antosianin blueberry boleh meningkatkan sensitiviti insulin melalui kapasiti antioksidan dan melalui interaksi pengawalseliaan lain kerana kesannya tidak dapat dijelaskan sepenuhnya oleh bekas [13,22]. Kajian juga telah menemui manfaat antosianin blueberry untuk kebimbangan berkaitan diabetes yang lain. Dalam kajian in vitro, Huang et al. [23] mendapati bahawa anthocyanin blueberry mempunyai kesan anti-radang dan antioksidan pada sel retina manusia dalam keadaan glukosa yang tinggi. Sel yang terdedah kepada glukosa tinggi mempunyai daya maju 64 peratus manakala apabila terdedah kepada ekstrak antosianin beri biru, malvidin, malvidin-glukosida atau malvidin-galaktosida, daya majunya ialah7-9 peratus ,83 peratus ,91- peratus atau { {11}} peratus , masing-masing. Sebaliknya, Song et al. [24] mendapati bahawa antosianin blueberry mengurangkan tekanan oksidatif dan keradangan dalam retina tikus diabetes. Tikus diabetes diberi 20, 40, dan 80 mg/kg antosianin blueberry secara lisan selama 12 minggu. Tikus dengan dos tinggi anthocyanin blueberry mempunyai glukosa darah yang lebih rendah, kapasiti antioksidan yang lebih tinggi dan keradangan yang lebih rendah dalam retina, dan spesies oksigen reaktif yang lebih rendah berbanding dengan yang tidak mempunyai antosianin blueberry.

Walaupun anthocyanin blueberry memberikan manfaat kesihatan kepada hati dan organ lain untuk pesakit kencing manis, tindakan hipoglisemik dan hipolipidemik ekstrak antosianin blueberry (BAE) dalam sel hepatik manusia adalah tidak jelas. Dalam kajian ini, telah dibuat spekulasi bahawa BAE, serta Mv, Mv-3-glc dan Mv-3-gal, mempunyai aktiviti hipoglisemik dan hipolipidemik dalam sel hepatokarsinoma manusia (HepG2) dan tikus dan mereka boleh mengekalkan homeostasis glukolipid sekali gus mengurangkan perkembangan diabetes.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Kimia dan reagen

Brightwell rabbiteye blueberries(Vaccinium ashei dituai dari Fujiabian Orchard Picking (Nanjing, China) dan ekstrak antosianinnya kemudiannya diperoleh dan disimpan dalam gelap pada darjah {{0}} . Ejen semula 3- (4.5 dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil-2H-tetrazolium bromida (MTT) dan piawaian malvidin (Mv), malvidin-3-glukosa (Mv{ {11}}glc), dan malvidin-3-galaktosa(Mv-3-gal) diperoleh daripada Sigma Aldrich (Shanghai, China). Sel primer HepG2, kit ujian protein asid bicinchoninic (BCA) dan dipertingkatkan reagen pengesanan chemiluminescence (ECL) western blotting diperoleh daripada CW Biotechnology (Beijing, China). Serum lembu janin (FBS), medium Eagle diubah suai Dulbecco (DMEM) dan penicillin-streptomycin diperoleh daripada Gibco (Auckland, New Zealand). BioFroxx streptozotocin (STZ) telah dibeli daripada Saiguo Biotech (Guangzhou, China). Kit pengesanan Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) telah dibeli daripada Beyo-time Institute of Technology(Shan). ghai, China). Albumin serum lembu (BSA) diperoleh dari Shyuanye (Shanghai, China). Makanan tinggi lemak dan tinggi gula (lemak 35.5 peratus, protein 20 peratus, karbohidrat 36.4 peratus, 0.1 peratus selulosa) dan makanan biasa (lemak 4.5 peratus, protein 23 peratus, karbohidrat 31.9 peratus, 3.7 peratus fruktosa, dan 5.3 peratus selulosa) untuk tikus diperoleh daripada Xietong Bioengineering Co., Ltd (Nanjing, China). Kit ujian insulin, trigliserida (TG), jumlah kolesterol (TCHD, glutathione peroksidase(GSH-Px), dan superoxide dismutase (SOD) telah dibeli daripada Institut Penyelidikan Bioengineering Jiancheng (Nanjing, China). Kotak Forkhead manusia AndyGene O1(FOXO1) , glukosa-6-fosfatase(G6Pase), glikogen synthase-phosphorylation (p-GS), glikogen sintase kinase-3 beta-phosphorylation (p-GSK3 ), pengangkut glukosa 2(GLUT2), asetil koenzim A karboksilase (ACC), trigliserida lipase sensitif hormon (HSL),3-hidroksi-3-metilglutaryl-coenzyme reductase (HMGCR) dan kit ujian imunosorben berkait enzim insulin berpuasa (ELISA) semuanya dibeli daripada Bluegene Biotech (Shanghai, China) Bahan kimia dan reagen yang digunakan dalam kajian ini adalah kesemuanya gred analitikal tulen.

2.2. Antibodi

Antibodi utama terhadap GS, p-GS (Ser641), protein pengikat unsur pengawalseliaan sterol-1c(SREBP-1c), dan phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) diperoleh daripada Abcam (Cambridge, United Kingdom) . Antibodi utama terhadap adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha (AMPKa), p-AMPK a (Thr172), peroxisome-proliferator-activated receptor-y-coactivator-1 (PGC-1 ), ACC, p- Antibodi sekunder konjugasi ACC (Ser79), dan lobak peroksidase (HRP) telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel (Beverly, MA, Amerika Syarikat). Antibodi terhadap gliseraldehid 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) telah dibeli daripada Nanjing Beidi Biomed Technology (Nanjing, China) manakala antibodi terhadap -actin dibeli daripada Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA). Antibodi primer digunakan pada 1:1000 pencairan manakala 1:4000 pencairan digunakan untuk antibodi sekunder.

2.3. Penyediaan ekstrak antosianin blueberry (BAE)

Pengekstrakan antosianin blueberry telah dilakukan menggunakan kaedah kami sebelumnya Huang et al. [25]. Beri biru rabbiteye beku disimpan pada suhu bilik sehingga dicairkan. Kemudian, mereka dipukul pada 10 000 rpm selama 30 saat menggunakan penghomogen asas ULTRA-TURRAX T18 (IKA Works Guangzhou, China). Sejumlah 250 g blueberry kemudiannya direndam dalam larutan 1000 mL metanol yang mengandungi 1 peratus HCl selama 24 jam. Ekstrak kemudiannya dikumpul berikutan sentrifugasi pada 5000×g selama 15 minit. Selepas penyejatan pelarut pada 40 darjah dalam vakum, sisa diekstrak dengan 1:1 (v/v) etil asetat tiga kali. Fasa air yang mengandungi anthocyanin dikumpul dan dipekatkan menggunakan penyejatan vakuo untuk mendapatkan ekstrak antosianin mentah. Ekstrak telah disucikan lagi dengan resin makroporous AB-8 (Sigma Aldrich, Shanghai, China). Untuk mengeluarkan fruktosa dan protein, ekstrak telah tertakluk kepada kromatografi lajur pada resin makroporous 1000 g AB-8 untuk penyerapan 24 jam dan kemudian dielusikan dengan air suling berganda. Pecahan antosianin telah dicairkan dengan 80 peratus etanol yang mengandungi 1 peratus larutan HCl, tertumpu dalam vakuo, dan kemudian dikeringkan menggunakan pengering beku Eyela FDU-1200 (Tokyo Rikakikai, Jepun) untuk mendapatkan ekstrak antosianin blueberry (BAE) serbuk.

2.4. Kultur sel dan rawatan

Garis sel HepG2, yang diperoleh daripada karsinoma hepatoselular manusia yang dibezakan khusus, mempunyai bahagian protein khusus hati yang tinggi. Atas sebab ini, ia biasanya digunakan sebagai model makmal untuk kajian sel hati manusia [26]. Sel HepG2 ditanam dalam DMEM yang mengandungi D-glukosa (5.5 mM) biasa ditambah dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus penisilin-streptomisin dan disimpan pada suhu 37 darjah C dan 5 peratus inkubator atmosfera CO2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Selepas mencapai 70-80 peratus pertemuan, sel HepG2 telah disubkultur. Empat jam sebelum eksperimen, sel HepG2 telah disenyapkan dalam medium serum yang dikurangkan. Selepas prarawatan dengan 5 ug/mLof Mv, Mv{18}}glc, Mv{19}}gal atau BAE selama 24 jam, sel telah terdedah kepada kepekatan glukosa normal (5.5 mM) atau tinggi (30 mM) kepada meniru keadaan normal dan kencing manis. Sel-sel telah disediakan untuk analisis Western Blot dan supernatan dikumpulkan untuk analisis ELISA.

2.5. Haiwan dan reka bentuk eksperimen

C57BL/6J tikus jantan yang sihat (20 ± 2 g) dari GemPharmatech (Nanjing, Jiangsu, China) disimpan dalam keadaan makmal standard, termasuk suhu malar 25 darjah dan 12-j siang dan malam bergantian. Jawatankuasa Kecil Akademi Sains Pertanian Jiangsu mengenai Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Penyelidikan sebelum ini telah meluluskan semua prosedur eksperimen haiwan. Diet tinggi lemak dan streptozotocin (STZ) digunakan untuk mendorong T2DM dalam model haiwan mengikut kaedah yang digunakan oleh Islam dan Loots [27]. Semua tikus diberi makan dengan diet tinggi lemak dan tinggi gula kecuali bagi kumpulan kawalan yang mengambil diet biasa. Selepas 4 minggu, tikus dipuasakan selama 12 jam dan disuntik secara intraperitoneal dengan 100 mg/kg STZ yang dilarutkan dalam larutan penimbal natrium sitrat (pH 4.2-4.5). Seminggu selepas induksi STZ, sampel darah diambil dari urat ekor tikus yang berpuasa semalaman. Tikus yang menunjukkan simptom diabetes termasuk poliuria, polidipsia, dan hiperglikemia (paras glukosa darah puasa > 11.1 mmol/L) telah diiktiraf sebagai T2DM dan digunakan untuk kajian akan datang. Untuk memeriksa kestabilan T2DM model, semua tikus diberi makan dengan diet biasa selama satu minggu. Tikus biasa digunakan sebagai kumpulan kawalan. Tikus diabetes kemudiannya dibahagikan secara rawak kepada tiga kumpulan: model, BAE dos rendah (100 mg/kg), dan BAE dos tinggi (400 mg/kg). Selama 6 hari berturut-turut, pentadbiran intragastrik sama ada jumlah pelarut yang sama （100 μL）, 100 mg/kg atau 400 mg/kg BAE diberikan kepada kumpulan kawalan, kumpulan model, BAE dos rendah dan BAE dos tinggi masing-masing. Pada hari ketujuh, berat badan dan glukosa darah puasa diukur. Pentadbiran intragastrik yang sama berterusan selama 5 minggu. Tikus kemudiannya dipuasakan semalaman, dan sampel darah dikumpulkan untuk penyediaan serum dari vena kava inferior dan disimpan pada-20 darjah . Selepas pensampelan darah, semua tikus dibius dan dikorbankan. Tisu hati, limpa, buah pinggang dan timus tikus telah dikeluarkan, ditimbang dan disimpan pada -80 darjah untuk eksperimen selanjutnya.

2.6. Pengesanan daya maju sel

Daya maju sel ditentukan oleh kaedah MTT. Lima ug/mL Mv, Mv{{0}}glc, Mv-3-gal atau BAE telah digunakan untuk prarawatan sel selama 24 jam. Sel-sel tersebut kemudiannya dirawat dengan 5 mMor 30 mM glukosa selama 24 jam dan 10 μL 0.5 peratus （5 mg/mL） MTT telah ditambah kepada sel yang kemudiannya dikultur semula. Selepas 4 jam, larutan MTT dikeluarkan, dan 100 μL dimetil sulfoksida(DMSO) ditambah sebelum campuran digoncang perlahan selama 10 minit untuk melarutkan kristal sel. Penyerapan pada 490 nm diukur pada pembaca plat mikro StatFax{14}}(Awareness Tech-nology Inc., Plam, FL, USA) untuk mendapatkan nilai ketumpatan optik (OD). Sel yang dikultur dengan paras glukosa normal (5.5 mmol/L) digunakan sebagai kumpulan kawalan, manakala telaga tanpa sel digunakan sebagai kosong. Formula berikut digunakan untuk menentukan daya maju sel: Daya maju sel( peratus )=(kumpulan sampel nilai OD kumpulan kosong nilai OD)/(kumpulan kawalan nilai OD kumpulan kosong nilai OD)x 100 peratus .

2.7. Visualisasi pendarfluor ROS

Spesies oksigen reaktif (ROS) dalam sel HepG2 dinilai menggunakan kit pengesanan DCFH-DA. Selepas rawatan awal dengan 5 ug/mL Mv, Mv-3-glc, Mv-3-gal atau BAE selama 24 jam yang kemudiannya diikuti dengan rawatan 5 mM atau 30 mMglukosa selama 24 jam, sel-sel telah dibasuh dengan PBS, dan kemudian 10 μM DCFH-DA ditambah kepada setiap telaga dan dibenarkan untuk bertindak balas selama 20 minit pada 37 darjah. Sel-sel itu sekali lagi dibasuh dengan teliti dengan PBS dan kemudian sekumpulan sel ini segera diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor terbalik IX53 (Olympus, Tokyo, Jepun) pada pancaran 530 nm dan penapis pengujaan 485 nm. Imej dipersembahkan di bawah pembesaran 200x. Selepas pemisahan, kumpulan sel lain telah dikumpulkan dan pendarfluor mereka direkodkan oleh pembaca plat mikro pelbagai mod Synergy H4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). Jumlah intensiti pendarfluor sel dalam setiap telaga telah diperhatikan, dan penjanaan ROS diukur sebagai lipatan Kawalan.

2.8. ELISA

Kit ELISA digunakan untuk mengukur protein yang terlibat dalam glukoneogenesis (FOXO1, G6Pase, p-GS), glikogenolisis (p-GSK3), pengangkut glukosa (GLUT2), lipogenesis (ACC dan HMGCR), dan lipolisis (HSL) dalam supernatan HepG2. sel. Kuantiti GLUT2 dalam hati tikus juga ditentukan. Kit ujian protein BCA digunakan untuk mengukur jumlah protein sel supernatan. Penyerapan pada 450 nm diukur pada 37 darjah pada pembaca plat mikro StatFax{10}} (Awareness Technology Inc., Plam, FL, USA) untuk menentukan tahap protein.

2.9. Analisis Western blotting

Western blotting dilakukan pada lisat HepG2 untuk mengukur tahap protein AMPK, p-AMPK, glukoneogenesis (PGCl, PEPCK, glikogenolisis(GS, p-GS) dan lipolisis (ACC, p-ACC, SREBP{{4} }c) dalam sel. Western blotting juga dilakukan untuk menentukan kuantiti AMPK,p-AMPK pada hati tikus yang disebabkan oleh diabetes. Sama ada GAPDH atau -Actin digunakan sebagai kawalan pemuatan. Pengimejan LAS-3000 sistem (Fuji, Tokyo, Jepun) digunakan untuk memerhati jalur protein, dan ketumpatannya dikira menggunakan perisian Bio Profile 1D plus plus (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallee, Perancis). Semua data dinyatakan sebagai perubahan lipatan kepada kawalan itu.

2.10. Ujian glukosa darah puasa dan toleransi glukosa

Glukosa darah puasa diukur sekali seminggu untuk tempoh 5 minggu selepas 12-h tempoh berpuasa. Untuk ujian toleransi glukosa, tikus dipuasakan selama 16 jam dan diberi makan dengan 2 g/kg 20 peratus glukosa （200 μL）intra-gastrik(ig)untuk menentukan glukosa darah pada 0 ,0.5,1,1.5 dan 2j. Darah diambil dari urat ekor dan paras glukosa diukur menggunakan glucometer (Sinocare, Changsha, China). Paras glukosa dalam air kencing tikus yang menerima ig juga diukur untuk tempoh lima minggu.

2.11. Anggaran indeks biokimia serum dan aktiviti enzim dalam hati tikus

Kuantiti insulin, trigliserida dan jumlah kolesterol dalam serum diukur, manakala aktiviti enzim SOD dan GSH-PX dianggarkan menggunakan kit komersial mengikut protokol pengeluar. Penyerapan pada 500 nm untuk trigliserida (TG) dan jumlah kolesterol (TCH), dan 450 nm untuk yang lain (insulin, SOD dan GSH-PX) diukur pada 37 darjah pada pembaca plat mikro StatFax-2100 (Teknologi Kesedaran InC., Plam, FL, USA).

2.12. Analisis statistik

Semua data dibentangkan sebagai nilai min±sisihan piawai(SD) bagi sekurang-kurangnya tiga eksperimen bebas. Angka tersebut diperoleh menggunakan GraphPad Prism Versi 8(GraphPad Software, Inc., CA, USA). Analisis varians sehala (ANOVA), ujian-t, atau ujian perbandingan berbilang Sidak telah dilakukan untuk menentukan perbezaan statistik antara kumpulan yang berbeza. Perbezaan dianggap penting di P<>

Artikel ini diekstrak daripada https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 Diterima 21 Julai 2021; Diterima dalam borang semakan 9 Ogos 2021; Diterima pada 11 Ogos 2021