Ekspresi Human Alpha Defensin 5 dalam Buah Pinggang Dan Saluran Kencing Manusia
Mar 16, 2022
Untuk maklumat lanjut: ali.ma@wecistanche.com
John David Spencer et al
Abstrak
latar belakang:Mekanisme yang mengekalkan kemandulan dalam saluran kencing tidak difahami sepenuhnya. Kajian terbaru telah melibatkan kepentingan peptida antimikrobial (AMP) dalam melindungi saluran kencing daripada jangkitan. Di sini, kami mencirikan ungkapan dan kaitan AMP manusia alpha-defensin 5 (HD5) dalam manusia.buah pinggangdan saluran kencing dalam subjek normal dan dijangkiti.
Metodologi/Penemuan Utama:Menggunakan RNA yang diasingkan daripada manusiabuah pinggang, ureter dan tisu pundi kencing, kami melakukan PCR masa nyata kuantitatif untuk menunjukkan bahawa DEFA5, pengekodan gen HD5, dinyatakan secara konstitutif di seluruh saluran kencing. Dengan pyelonephritis, ekspresi DEFA5 meningkat dengan ketara dalambuah pinggang. Menggunakan analisis imunoblot, pengeluaran HD5 juga meningkat dengan pyelonephritis. Imunostaining HD5 setempat ke urothelium pundi kencing dan ureter. Dalam buah pinggang, HD5 terutamanya dihasilkan dalam nefron distal dan tubul pengumpul. Menggunakan immunoblot dan ujian ELISA, HD5 tidak dikesan secara rutin dalam sampel air kencing manusia yang tidak dijangkiti manakala bermakna pengeluaran HD5 kencing meningkat dengan jangkitan saluran kencing E.coli.
Kesimpulan/Kepentingan:DEFA5 dinyatakan di seluruh saluran kencing dalam subjek yang tidak dijangkiti. Khususnya, HD5 dinyatakan di seluruh urothelium saluran kencing yang lebih rendah dan dalam tubul pengumpulbuah pinggang. Dengan jangkitan, ekspresi HD5 meningkat dalambuah pinggang, dan paras menjadi dapat dikesan dalam air kencing. Untuk pengetahuan kami, penemuan kami mewakili yang pertama untuk mengukur ekspresi dan pengeluaran HD5 dalam buah pinggang manusia. Selain itu, ini adalah laporan pertama untuk mengesan kehadiran HD5 dalam sampel air kencing yang dijangkiti. Keputusan kami menunjukkan bahawa HD5 mungkin mempunyai peranan penting dalam mengekalkan kemandulan saluran kencing.
pengenalan
Saluran kencing, selain daripada meatus uretra, biasanya steril walaupun berdekatan dengan flora najis. Mekanisme tepat di mana saluran kencing mengekalkan kemandulannya tidak difahami dengan baik. Mekanisme yang dicadangkan yang menyumbang kepada pertahanan saluran kencing termasuk aliran air kencing, perubahan dalam pH air kencing dan osmolariti, pengosongan pundi kencing yang kerap, komponen pertahanan kimia uroepitelium, dan penumpahan/kemasukan epitelium sel imun effector dengan rangsangan bakteria [1]. Di samping itu, peptida antimikrobial (AMP) baru-baru ini telah ditunjukkan mempunyai peranan penting dalam mengekalkan kemandulan saluran kencing [2]. AMP, yang berfungsi sebagai antibiotik semula jadi yang dihasilkan oleh hampir semua organisma, adalah komponen di mana-mana sistem imun semula jadi. AMP ialah molekul kationik yang dinyatakan oleh sel putih fagositik dan sel epitelium. Pada manusia dan mamalia lain, defensin ialah keluarga utama AMP. Defensin biasanya mempunyai aktiviti antimikrob spektrum luas terhadap bakteria, virus, kulat dan protozoa gram-positif dan gram-negatif gram-negatif [2,3]. Defensin pada mulanya disintesis sebagai preproprotein dan menjalani pemprosesan untuk menjadi matang, peptida aktif secara biologi [4]. Pada manusia, defensin dikelaskan kepada satu daripada dua keluarga bergantung pada corak penyambung disulfida mereka - alpha-defensin atau beta-defensin [5].
Dalam saluran kencing, beta-defensin diekspresikan secara meluas di seluruh uroepitelium. Sel epitelium melapisibuah pingganggelung Henle, tubulus distal, dan saluran pengumpul secara konstitutif mengekspresikan beta-defensin 1 manusia (hBD1). Walaupun tahap kencing hBD1 tidak mencukupi untuk membunuh bakteria penceroboh, hBD1 menyediakan salutan antimikrobial yang bertindak pantas pada lumen tiub dan menghalang jangkitan dengan menghalang perlekatan bakteria pada urothelium [6]. Kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa keadaan redoks hBD1 dengan ketara mempengaruhi potensi antimikrob, sehingga peptida yang dikurangkan adalah lebih kuat daripada bentuk teroksida berkaitan disulfida [7]. Kepentingan ini pada permukaan urothelial belum ditentukan. Satu lagi defensin, beta-defensin 2 manusia (hBD2) tidak dinyatakan secara konstitutif dalam tisu buah pinggang yang sihat; Walau bagaimanapun, ekspresi hBD2 disebabkan oleh jangkitan [8].
Tidak seperti beta-defensin, peranan alpha-defensin yang berasal dari epitelium tidak diterangkan dengan baik dalam saluran kencing. Ekspresi dan fungsi alpha-defensin HD5 dan HD6 kebanyakannya telah dilaporkan dalam usus kecil di mana ia dirembeskan oleh Panethcells ke dalam crypts usus dan menyumbang kepada keseimbangan mikrobiota usus [9]. HD5 juga telah dilokalkan dalam saluran genital lelaki dan wanita, dengan bukti menunjukkan bahawa ia boleh diinduksi dan penting dalam membasmi jangkitan [10,11,12]. HD5 kencing telah dikesan pada pesakit yang telah menjalani pembinaan semula pundi kencing ileal dan pengalihan saluran kencing di mana sumber pengeluaran HD5 terutamanya dikreditkan kepada sel Paneth ileal [13,14]. HD5 mempunyai aktiviti antibakteria terhadap bakteria gram-positif uropatogenik biasa dan bakteria gram-negatif [15]. HD5 juga mempunyai aktiviti antimikrob terhadap virus uropatogenik seperti adenovirus dan virus BK [16,17,18]. Dalam kajian ini, kami memberikan penerangan awal dan kuantifikasi ekspresi HD5 dalam manusiabuah pinggangdan seterusnya mentakrifkan ekspresinya dalam saluran kencing yang lebih rendah semasa kemandulan dan jangkitan.
Keputusan
MRNA DEFA5 secara konstitutif dinyatakan dalam pundi kencing manusia, ureter, dan buah pinggang
PCR masa nyata kuantitatif menunjukkan bahawa semua pundi kencing, ureter danbuah pinggangspesimen tanpa jangkitan dinyatakan secara konstitutif DEFA5. Ungkapan DEFA5 adalah jauh lebih besar dalam saluran kencing bawah berbanding saluran kencing atas(p= 0.014). Dalam pundi kencing (n=4), min ungkapan DEFA5 ialah 4,656637 transkrip setiap 10 ng RNA dan dalam ureter (n=4) bermakna ungkapan DEFA5 ialah 4,1126170 transkrip setiap 10 ngRNA (Rajah 1A) . Dalam buah pinggang (n=6), purata ungkapan DEFA5 ialah 2,9376274 transkrip setiap 10 ng RNA. Ekspresi DEFA5 dianalisis secara berasingan dalam korteks buah pinggang, medula dan pelvis. Ekspresi DEFA5 tidak berbeza dengan ketara mengikut kawasan buah pinggang(p= 0.45).
Ekspresi DEFA5 dan ekspresi peptida HD5 meningkat dengan pyelonephritis
Analisis PCR masa nyata kuantitatif dilakukan padatisu buah pinggang denganpyelonephritis menunjukkan peningkatan ketara dalam ekspresi DEFA5 berbanding dengan tisu buah pinggang yang tidak dijangkiti. Dengan pyelonephritis (n= 6), min ekspresi DEFA5 meningkat kepada7,82961,052 transkrip setiap 10 ng RNA (p= 0.019) (Rajah 2A).
Untuk menilai lagi peningkatan dalam ekspresi ini dengan pyelone-phritis, kami melakukan analisis imunoblot pada perkara yang samabuah pinggangtisu yang digunakan untuk analisis PCR masa nyata untuk menilai peningkatan serentak dalam pengeluaran peptida HD5 (Rajah 2B, panel tengah).Analisis imunoblot, menggunakan antisera HD5 poliklonal, menunjukkan pengeluaran peptida HD5 yang lebih ketara dalam tisu buah pinggang dengan pyelonephritis (n {{5} }) berbanding tidak dijangkitibuah pinggangtisu(n=6). Tidak dijangkitibuah pinggangtisu menyatakan 300625 ng HD5/gram berat tisu basah manakalabuah pinggangtisu dengan pyelonephritis diekspresikan 600621 ng HD5/gram berat tisu basah (p,0.0001). Blot telah disiasat semula dengan GAPDH untuk berfungsi sebagai kawalan pemuatan (Rajah 2B, panel tengah) dan noda perak juga dilakukan untuk mengesahkan pemuatan protein yang sama (Rajah 2B, panel atas).
Peptida HD5 dihasilkan di seluruh buah pinggang dan saluran kencing manusia
Imunostaining dilakukan untuk menyetempatkan pengeluaran HD5 dalam saluran kencing. Imunohistokimia (IHC) menunjukkan bahawa HD5imunoreaktiviti hadir di seluruh urothelium ureter dan pundi kencing semua spesimen yang disiasat (n=4, Rajah 3). IHC juga menunjukkan bahawa HD5 dihasilkan dalam tubulus korteks buah pinggang dan medula semua spesimen (n= 6, Rajah 4). Immunofluorescence (IF) menunjukkan bahawa ekspresi HD5 adalah yang paling besar dalam nefron distal dan tubul pengumpul (Rajah 5). Interstitium dan glomeruli tidak menunjukkan imunoreaktiviti HD5. Imunostaining yang ditunjukkan dalam Rajah 3, 4, dan 5 dilakukan menggunakan antibodi anti-HD5 monoklonal tetikus (8C8) yang mengiktiraf propeptida HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Keputusan adalah serupa apabila menggunakan antibodi anti-HD5 poliklonal arnab yang mengiktiraf propeptida HD5 dan peptida matang (data tidak ditunjukkan) - menunjukkan bahawa HD5 disimpan sebagai propeptida.
Dengan pyelonephritis, imunostaining HD5 meningkat dengan ketara. Imunoreaktiviti HD5 meningkat sepanjang nefron proksimal, nefron distal dan tubul pengumpul (Rajah 4 dan Rajah 5). Seperti dalam spesimen yang tidak dijangkiti, glomeruli dan interstitium tidak menunjukkan ekspresi HD5 dengan jangkitan. Kawalan negatif tidak menunjukkan imunoreaktiviti HD5.
Air kencing manusia yang dijangkiti mengandungi kepekatan peptida HD5 yang boleh diukur
Analisis imunoblot, menggunakan antiserum poliklonal arnab yang mengesan prekursor proHD5 dan bentuk yang diproses selanjutnya mengenal pasti tahap HD5 yang boleh diukur dalam 13 daripada 15 sampel air kencing yang diuji yang dijangkiti E.coli uropatogenik (Rajah 6A dan B). Apabila ada, paras HD5, dinormalkan kepada kreatinin air kencing, berjulat antara 299.8–669.7630 ng HD5/mg air kencing Cr (110.67 ng/mL–276.67 ng/mL), yang sepadan dengan 11.10–27.67 nmol/L. Sampel air kencing yang dijangkiti Innon (n=15), HD5 berada pada atau di bawah had pengesanan (,50 ng). Ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA) pada sampel air kencing yang sama, menggunakan antibodi monoklonal tetikus (8C8) yang hanya mengesan prekursor proHD5, mengesan tahap proHD5 yang boleh diukur dalam 13 daripada 15 sampel yang dijangkiti yang diuji. Kepekatan proHD5 urin berjulat dari 122.78–490.060.03 ng HD5/mg urin Cr (30.02 ng/mL–200.5 ng/mL) apabila ada (Rajah 7).
Perbincangan
Dalam kajian ini, kami menyediakan pencirian awal HD5 pada manusiabuah pinggang, ureter dan pundi kencing. HD5 telah ditunjukkan sebagai AMP penting yang menghalang jangkitan invasif dalam usus dan dikawal selia dalam saluran kemaluan semasa jangkitan [11,18,19,20,21]. AMP yang berasal dari epitelium, seperti HD5, telah terbukti penting dalam mengekalkan kemandulan dalam saluran kencing [8,22,23,24]. Kekurangan dalam pertahanan mukosa semula jadi ini boleh mengakibatkan jangkitan akut dan/atau kronik [25,26].
Keputusan PCR masa nyata kuantitatif kami menunjukkan bahawa DEFA5 secara konstitutif dinyatakan dalam manusiabuah pinggang, ureter, dan pundi kencing. Ekspresi DEFA5 meningkat dari saluran kencing atas ke saluran kencing yang lebih rendah – berikutan aliran aliran kencing dan semakin dekatnya dengan titik pencerobohan mikrobiota. Untuk pengetahuan kami, ini adalah kajian pertama untuk mengukur ekspresi DEFA5 dalam buah pinggang dan pundi kencing manusia. Baru-baru ini, Townes et al menunjukkan bahawa ureter distal normal boleh mengekspresikanDEFA5 [14]. Keputusan kami juga mencadangkan bahawa DEFA5 secara konstitutif dinyatakan oleh ureter distal. Walaupun ungkapan DEFA5 dalam saluran kencing hampir 100-kali ganda lebih rendah daripada yang terdapat dalam tisu gastrousus, ekspresi uroepitelial basal DEFA5 adalah setanding dengan ungkapan amp saluran kencing yang diterangkan sebelum ini seperti cathelicidin, hBD-1, hBD -2, dan ribonuklease 7[6,8,22,24,27].
Berbeza dengan saluran gastrousus matang di mana DEFA5 dinyatakan pada tahap tinggi dalam kedua-dua keadaan kesihatan dan jangkitan/keradangan, data PCR masa nyata kuantitatif kami menunjukkan bahawa ekspresi DEFA5 dalambuah pinggangdikawal dengan ketara dengan jangkitan [27,28,29]. Corak ekspresi yang boleh diinduksi ini adalah sama dengan ekspresi DEFA5 dalam saluran pembiakan wanita di mana ekspresi DEFA5 meningkat dengan salpingitis [30]. Dalam saluran kencing, Townes et al telah menunjukkan trend ke arah ekspresi ureter DEFA5 yang lebih besar pada pesakit dengan UTI yang telah menjalani pengalihan kencing saluran ileal [14]
Analisis imunoblot kami melengkapkan data PCR masa nyata dengan menunjukkan bahawa pengeluaran peptida HD5 meningkat dengan pyelonephritis. Corak teraruh pengeluaran HD5 ini adalah serupa dengan yang dilihat pada sesetengah ahli keluarga beta-defensin.hBD2 menunjukkan corak teraruh pengeluaran dengan jangkitan saluran kencing dan/atau pyelonephritis kronik [8,31,32]. Pengeluaran HD5peptida telah ditunjukkan meningkat dalam saluran kemaluan wanita atas dan uretra lelaki dengan keradangan [11,30].
Menggunakan immunostaining, kami menunjukkan bahawa HD5 dihasilkan secara seragam di seluruh urothelium ureter dan pundi kencing. Oleh kerana sebahagian besar UTI terhasil daripada flora tahi yang naik ke dalam pundi kencing, keputusan ini menunjukkan bahawa ekspresi HD5 hadir di lokasi di mana pendedahan mikrob berlaku paling kerap [33]. Oleh itu, HD5 berada pada kedudukan yang ideal untuk mencegah jangkitan mikrob yang meningkat. Di dalambuah pinggang, HD5 terutamanya dihasilkan dalam nefron distal dan tubul pengumpul. Penemuan ini mencadangkan bahawa HD5 dihasilkan di lokasi di mana ia akan diletakkan untuk mempunyai aktiviti antimikrob yang optimum. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa sifat antimikrob defensin bergantung kepada kepekatan garam - dengan kepekatan garam yang lebih tinggi mengurangkan aktiviti antimikrob [23,34,35]. Kami membuat spekulasi bahawa kepekatan garam rendah nefron distal dan tubul pengumpul memberikan persekitaran yang menggalakkan untuk aktiviti antimikrob HD5.
Analisis imunoblot dan ELISA juga menunjukkan bahawa HD5 dirembeskan ke dalam air kencing pada tahap rendah. Memandangkan saiz (8.1 kDa dan3.7 kDa) dan cas positif proHD5 dan HD5 yang diproses sepenuhnya, ada kemungkinan beberapa peptida HD5 kencing berasal, sekurang-kurangnya sebahagiannya, daripada turasan plasma. Namun, terdapat sedikit bukti yang menunjukkan bahawa HD5 berterusan dalam plasma [27]. Di samping itu, untuk muncul dalam air kencing, HD5 perlu melepaskan mekanisme penyerapan peptida yang cekap dalam tubul proksimal [6,36]. Akhirnya, sampel air kencing yang digunakan menjalani sentrifugasi sebelum ujian dilakukan, mengeluarkan sumber selular HD5.
Pada kepekatan yang dikesan, HD5 kencing tidak mungkin menjadi antimikrob secara langsung terhadap mikroorganisma uropatogenik kerana HD5 yang diproses sepenuhnya mempunyai kepekatan perencatan minimum (MIC) antara 6-10 mg/mL terhadap bakteria uropathogenik gram negatif biasa [15]. Walau bagaimanapun, kepekatan permukaan mukosa mungkin lebih tinggi. Tambahan pula, analisis imunoblot menunjukkan bahawa kepekatan HD5 adalah jauh lebih besar dalambuah pinggang. Keputusan ini menunjukkan bahawa HD5 terlibat dalam pertahanan mukosa saluran kencing. Corak analog dilihat denganhBD1, di mana kepekatan urin hBD1 tidak mencukupi untuk mempamerkan aktiviti antimikrob tetapi kepekatan peptida yang lebih tinggi dikesan berhampiran tubul renal [6,31].
Kerana IHC menunjukkan bahawa proHD5 ialah bentuk utama HD5 dalambuah pinggangdan kerana kedua-dua matang dan proHD5 dikesan dalam air kencing, kami membuat spekulasi bahawa HD5 terutamanya dirembeskan molekul prekursor dan kemudian menjalani pemprosesan proteolitik untuk menghasilkan bentuk matang - serupa dengan saluran gastrousus dan genitouriner [11,30,37]. Dalam usus kecil, sel Paneth menghasilkan trypsin, yang membelah propeptida HD5 supaya peptida yang diproses sepenuhnya adalah bentuk utama dalam lumen usus [37]. Dalam uretra lelaki, pemprosesan utama dan enzim pengaktifan untuk HD5 adalah protease neutrofil yang disumbangkan oleh neutrofil yang direkrut ke tapak jangkitan [11]. Sumbangan trypsinogen epitelium, trypsin kencing dan/atau protease neutrofil pada pemprosesan HD5 dalam saluran kencing semasa jangkitan masih perlu ditentukan. Selain itu, kesan perubahan dalam persekitaran kencing pada fungsi HD5 (perubahan dalam osmolariti, pH, dan kepekatan kationik) juga masih perlu ditentukan.
Kesimpulannya, ini adalah kajian pertama untuk mengenal pasti dan mengukur ekspresi dan pengeluaran HD5 dalam saluran kencing. Keputusan kami menunjukkan bahawa HD5 ialah AMP yang berasal dari epitelium yang mungkin memainkan peranan penting dalam imuniti semula jadi uroepite lium manusia yang menghalang pemindahan patogen yang menyerang ke dalam peredaran. Penjelasan tentang faktor-faktor yang mengawal pengeluaran HD5 boleh memberi gambaran baru tentang patogenesis UTI pada pesakit yang berisiko untuk UTI dan pesakit dengan jangkitan kronik.
Kaedah
Kelulusan belajar
Keizinan bertulis yang dimaklumkan diperoleh daripada semua pesakit yang mengambil bahagian dalam kajian ini. Bagi subjek yang berumur kurang daripada 18 tahun, kebenaran bertulis ibu bapa/penjaga telah diperolehi. Lembaga Semakan Institusi Hospital Kanak-Kanak Nationwide (NCH) meluluskan kajian ini bersama-sama dengan proses persetujuan dan dokumen (IRB07-00383).
Tisu Manusia dan Sampel Air Kencing
Ureter distal dan tisu pundi kencing (n= 4) yang tidak dijangkiti diperoleh daripada kanak-kanak yang menjalani implantasi semula ureter atas sebab selain daripada jangkitan berulang. Tidak dijangkitibuah pinggangsampel (n=6) diperoleh daripada pesakit yang menjalani nefrectomy untuk tumor buah pinggang. Sampel tisu bebas daripada tanda makroskopik penyakit atau keradangan.buah pinggangtisu daripada pesakit dengan pyelonephritis kronik telah disediakan oleh Rangkaian Tisu Manusia Koperasi (n=6) [38]. Dua ahli patologi bebas mengesahkan diagnosis histopatologi pyelonephritis. Sampel tisu dibekukan atau dipelihara sebagai bahagian yang dibenamkan parafin tetap formalin neutral. Bahagian tisu buah pinggang yang tidak dijangkiti telah dibedah ke dalam korteks, medula atau pelvis buah pinggang sebelum disimpan(n=4).
Sampel air kencing yang tidak dijangkiti dan dijangkiti diperoleh daripada kanak-kanak yang dihantar ke jabatan kecemasan NCH atau klinik thenefrologi. Diagnosis UTI dibuat oleh budaya air kencing yang positif menurut American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Semua sampel air kencing yang dijangkiti mempunyai .106 CFU/mL E.coli. Nilai pH air kencing adalah antara 5.5 hingga 8.5 (min air kencing 6.9). Komposisi ion urin tidak diukur. Sampel air kencing telah disentrifugasi untuk mengeluarkan sedimen air kencing, dan koktel perencat protease telah ditambah (Thermo Scientific, Rockford, IL, Amerika Syarikat).
Pengasingan Asid Ribonukleik dan Transkripsi Songsang
Jumlah RNA telah diasingkan daripada tisu beku menggunakan Sistem Pengasingan RNA PromegaTotal (Promega, Madison, WI, Amerika Syarikat). Sintesis ForcDNA, 4-8 mg jumlah RNA telah ditranskripsi terbalik dengan transkripase terbalik Superscript III menggunakan primer oligo-(dT)12-18 mengikut protokol pembekal (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat).
Pengklonan Plasmid Khusus Gen untuk Lengkung Standard
Pengekodan cDNA DEFA5 dan GAPDH telah diklonkan menjadi 4-vektor plasmid Topo (Invitrogen) mengikut arahan pengeluar. Plasmid telah disusun untuk mengesahkan bahawa ia betul
konstruk diperolehi. Pencairan bersiri plasmid khusus gen telah dikuantisasi (mengikut penyerapan spektrofotometri pada 260 dan elektroforesis gel agarose yang diwarnai etidium bromida) dan digunakan dalam PCR masa nyata untuk menjana lengkung standard bagi setiap tindak balas.
PCR Masa Nyata Kuantitatif
PCR masa nyata kuantitatif dilakukan menggunakan cDNA terkandas tunggal daripada manusiabuah pinggang, ureter dan tisu pundi kencing dengan pasangan primer oligonukleotida tertentu menggunakan Sistem PCR Masa Nyata 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Primer rentang simpang ekson PCR telah direka bentuk dan jujukan telah disahkan menggunakan DNAstarH Laser Gene SeqBuilder (primer hadapan DEFA5. : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 dan DEFA5 reverse primer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
Secara ringkasnya, cDNA yang sepadan dengan 10 ng RNA berfungsi sebagai atemplat dalam tindak balas 25 ml yang mengandungi 2.0 mM setiap primer dan16 Campuran Master DNA Master SYBR Green Light-Cycler-Fast Start. Keadaan PCR ialah: denaturasi awal pada 95uC selama 10 minit, diikuti oleh 40 kitaran dengan setiap kitaran terdiri daripada denaturasi pada 94uC selama 30 saat, penyepuhlindapan pada 64uC selama 30 saat, dan lanjutan pada 72uC selama 30 saat. Pelepasan pendarfluor kitaran ke kitaran dipantau pada 530 nm dan dianalisis menggunakan 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Piawaian plasmid khusus gen disertakan dengan setiap set tindak balas. Sebagai kawalan positif, RNA ileum terminal disertakan dengan setiap set tindak balas, dan keputusan dibandingkan dengan piawaian yang diterbitkan sebelum ini [27].
Untuk mengesahkan penguatan PCR produk yang dimaksudkan, sampel representatif dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose 1.5 peratus. Produk telah divisualisasikan oleh etidium bromidestaining dan dibandingkan dengan standard saiz DNA untuk mengesahkan saiz produk yang dijangkakan (tidak ditunjukkan). Di samping itu, lengkung profil suhu lebur bagi setiap tindak balas PCR ditentukan pada akhir setiap tindak balas.
Antibodi HD5
Propeptida HD5 (AA20-94) dan bentuk yang diproses separa (AA36-94 dan 56–94) telah dikenal pasti menggunakan antibodi anti-HD5 (Abcam) monoklonal (8C8) tetikus yang tersedia secara komersil (Abcam). Propeptida HD5 dan peptida matang (AA63-94) telah dikenal pasti menggunakan antiserum poliklonal arnab yang diterangkan sebelum ini[13,40].
Immunoblot
Bahagian yang samabuah pinggangspesimen yang digunakan untuk analisis PCR masa nyata kuantitatif (3-6 mg berat basah) telah dihancurkan menggunakan mortar dan alu dalam nitrogen cecair dan dilarutkan dalam penimbal RIPA dengan perencat protease. Protein urin diekstrak daripada sampel air kencing menggunakan Kit Mikro Kepekatan Protein Urin ProteospinTM (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Kanada). Kepekatan protein buah pinggang dan air kencing dikira menggunakan Bradford Assay yang diubah suai dan disahkan menggunakan bacaan anOD280 nm. Kepekatan tisu buah pinggang atau protein kencing yang sama telah dimuatkan ke dalam gel kecerunan natrium dodesil sulfat 18 peratus dan tertakluk kepada elektroforesis. Untuk memastikan pemuatan protein yang sama, pewarnaan perak dilakukan.
Selepas pemisahan elektroforesis, protein dipindahkan ke membran nitroselulosa. Selepas penetapan dengan 0.05 peratus glutaraldehid dalam TBS, membran telah disekat dalam 5 peratus susu tanpa lemak selama 30 hingga 60 minit dan diinkubasi dalam 1:1,000 pencairan antiserum HD5 poliklonal arnab semalaman . Selepas mencuci, antibodi sekunder, IgG anti-arnab terkonjugasi lobak pedas peroksidase anti-arnab dicairkan 1:10,000 (Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA, USA), digunakan selama 1 jam pada suhu bilik. Imunoblot daripadabuah pinggangtisu juga disiasat dengan antibodi anti-GAPDH (Sigma Aldrich) selama dua jam pada suhu bilik dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder yang diterangkan di atas. Protein telah divisualisasikan menggunakan sistem pengesanan ECL dan filem chemiluminescence mengikut arahan pengeluar (BioExpress, Kaysville, UT, Amerika Syarikat).
HD5 dikira dengan membandingkan intensiti jalur yang terhasil dengan pencairan bersiri protein proHD5 standard rekombinan (Peptides International, Louisville, KY, Amerika Syarikat).buah pinggangKepekatan HD5 diseragamkan kepada berat tisu basah. Kepekatan urinaryHD 5 dibahagikan dengan kreatinin air kencing untuk menetapkan nisbah HD5-kepada kreatinin (mg/mg) air kencing piawai untuk mengambil kira pencairan air kencing. Kepekatan kreatinin air kencing ditentukan menggunakan ujian mikroplate kreatinin Penyelidikan Bioperubatan Oxford (Rochester Hills, Michigan, Amerika Syarikat).
Imunohistokimia
Selepas penyahparafinan, penghidratan semula, dan pengambilan antigen, blok biotin dan blok protein bebas serum telah dilakukan (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Slaid tersebut diinkubasi semalaman pada suhu 4uC dengan antibodi HD5(8C8) tetikus monoklonal (1:2{{10}}0; Abcam) atau antiserum poliklonal arnab(1:500) diikuti dengan antibodi terbiotinilasi anti-polivalen yang tercampur Streptavidin/HRP (ScyTek Laboratories). Bahagian telah dibangunkan menggunakan 0.1 peratus diaminobenzidine tetraklorida dengan 0.02 peratus hidrogen peroksida dan diwarnakan dengan hematoksilin. Bahagian kawalan negatif diinkubasi dengan serum bukan imun sebagai pengganti antibodi HD5.
Imunofluoresensi
Imunofluoresensi berlabel dua dilakukan untuk membantu menyetempatkan ekspresi HD5 dalambuah pinggang. Saluran pengumpul telah dilabel dua kali untuk sel utama dengan antibodi aquaporin{2}} anti-manusia poliklon kambing (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Gelung Henle dilabel dua kali dengan antibodi uromodulin anti-manusia poliklonal tetikus (Sigma-Aldrich) dan tubul proksimal dilabel dua kali dengan aquaporin poliklonalantihuman kambing -1 (Santa Cruz) [41,42]. Anti-kambing poliklonal keldai rhodamine (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA), anti-tikus kambing rhodamine (Makmal Penyelidikan JacksonImmunoResearch), dan anti-arnab poliklonal keldai FITC (Santa Cruz) berfungsi sebagai antibodi sekunder.
Semua bahagian telah disediakan seperti yang digariskan di atas. Mereka telah diinkubasi dengan campuran antisera tetikus terhadap HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) atroom suhu selama 90 minit. Antibodi sekunder disapu selama 90 minit pada suhu bilik dan bahagiannya dipasang menggunakan media pelekap dengan DAPI. Serum bukan imun digunakan sebagai kawalan negatif. Slaid telah diperiksa dengan mikroskop aLeica DM4000B dan difoto secara digital menggunakan kamera/perisian Spot RT (Instrumen Diagnostik, SterlingHeights, MI, Amerika Syarikat).
ELISA
Kit Pelabelan Antibodi Biotin Pautan, Novus Biologicals) antibodi monoklonal tetikus selama 2 jam pada suhu bilik, peroksidase lobak streptavidin-kuda (Biolegend, San Diego CA, USA) ditambah selama 30 minit. Selepas pengeraman dengan larutan substrat TMB selama 15 minit (Diagnostik Kem-En-Tec), tindak balas telah ditamatkan dengan larutan STOP (Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA, Amerika Syarikat) dan dibaca pada panjang gelombang 450 nm. Kepekatan HD5daripada ujian ELISA dibahagikan dengan kreatinin urin untuk mewujudkan nisbah HD{8}}kepada kreatinin(mg/mg) air kencing piawai untuk mengambil kira pencairan air kencing seperti yang diterangkan di atas.
Rujukan
1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Konsep semasa mekanisme pertahanan molekul yang beroperasi semasa jangkitan saluran kencing. Jurnal penyiasatan klinikal Eropah 38 Suppl 2: 29–38.
2. Zasloff M (2007) Peptida antimikrob, imuniti semula jadi, dan saluran kencing yang biasanya steril. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.
3. Lehrer RI, Lichtenstein AK, Ganz T (1993) Defensin: peptida antimikrob dan sitotoksik sel mamalia. Annu Rev Immunol 11: 105–128.
4. Valore EV, Ganz T (1992) Pemprosesan pascatranslasi defensin dalam sel myeloid manusia yang tidak matang. Darah 79: 1538–1544.
5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Beta-defensin-1 dan alpha-defensin manusia dikodkan oleh gen bersebelahan: dua keluarga peptida dengan topologi disulfida yang berbeza berkongsi keturunan yang sama. Genomik 43: 316–320.
6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Beta-defensin manusia-1: peptida antimikrob bagi tisu urogenital. J Clin Invest 101: 1633–1642.
7. Schroeder BO, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski M, et al. (2011) Pengurangan ikatan disulfida membuka topeng aktiviti antimikrob yang kuat beta-defensin manusia 1. Alam 469: 419–423.
8. Lehmann J, Retz M, Harder J, Krams M, Kellner U, et al. (2002) Ekspresi beta-defensin 1 dan 2 manusia dalam buah pinggang dengan jangkitan bakteria kronik. BMC Infect Dis 2: 20.
9. Bevins CL (2006) Defensin sel Paneth: molekul pengesan utama imuniti semula jadi. Urus niaga Persatuan Biokimia 34: 263–266.
10. Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Ekspresi gen, imunolokalisasi dan rembesan defensin manusia-5 dalam saluran pembiakan wanita manusia. Am J Pathol 152: 1247–1258.
11. Porter E, Yang H, Yavagal S, Preza GC, Murillo O, et al. (2005) Profil defensin yang berbeza dalam Neisseria gonorrhoeae dan Chlamydia trachomatis urethritis mendedahkan interaksi sel-neutrofil epitelium novel. Jangkitan Immun 73: 4823–4833.
12. Com E, Bourgeon F, Evrard B, Ganz T, Colleu D, et al. (2003) Ekspresi defensin antimikrob dalam saluran pembiakan lelaki tikus, tikus, dan manusia. Biologi pembiakan 68: 95–104.
13. Porter EM, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et al. (1998) Pengasingan defensin usus manusia daripada air kencing neobladder ileal. Surat FEBS 434: 272–276.
14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Toleransi bakteria selepas pengalihan air kencing dikaitkan dengan aktiviti peptida antimikrobial. Urologi 77: 509 e501–508.
15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Keaktifan anbakteria dan mekanisme alfa defensin 5 manusia rekombinan terhadap strain tahan antibiotik klinikal. Afr J Microbiol Res 4: 626–633.
16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Defensin epitelium menjejaskan jangkitan adenoviral: implikasi untuk terapi gen pengantara adenovirus. Terapi gen manusia 10: 957-964.
17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mekanisme peneutralan adenovirus oleh alpha-defensin Manusia. Perumah sel & mikrob 3: 11–19.
18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley K, et al. (2008) Alfa-defensin manusia menghalang jangkitan virus BK dengan mengagregatkan virion dan menyekat pengikatan pada sel perumah. Jurnal kimia biologi 283: 31125–31132.
19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et al. (2009) Kajian imuniti tempatan jangkitan saluran genital bawah. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.
20. Quayle AJ (2002) Tindak balas imun semula jadi dan awal terhadap cabaran patogen dalam saluran genital wanita dan peranan penting sel epitelium. Jurnal imunologi pembiakan 57: 61–79.
