HPLC Untuk Penentuan Serentak Empat Komponen Phenylethanol Glycoside dalam Kepingan Rebusan Herba Cistanche Dan Ekstrak Cistanche Tubulosa

Abstrak: Objektif kajian ini adalah untuk mewujudkan akromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC)kaedah untuk penentuan serentak empat glikosida feniletanol dalamKepingan rebusan Herba CistanchesdanEkstrak cistanche tubulosa. Keadaan kromatografi menggunakan lajur Inertsil ODS{{{0}}} (250 mm × 4.6 mm, 5 µm), dengan fasa mudah alih yang terdiri daripada asetonitril - 0.1% asid formik penyelesaian menggunakan elusi kecerunan. Kadar alir ditetapkan pada 1.0 mL/min, suhu lajur dikekalkan pada 30 darjah, dan panjang gelombang pengesanan ialah 330 nm dengan isipadu suntikan 1{ {27}} µL. Kelinearan kawasan puncak dengan kepekatan adalah antara 2.53 hingga 201.60 µg/mL untuk glikosida yang berbeza, dengan pekali korelasi (r) lebih daripada 0.9993. Had pengesanan (LOD) dan kuantifikasi (LOQ) masing-masing adalah antara 0.2249 hingga 1.1004 µg/mL dan 0.3101 hingga 0.8161 µg/mL. Kaedah ini menunjukkan ketepatan, kestabilan dan kebolehulangan yang baik dengan nilai RSD kurang daripada 3.0%. Kadar pemulihan purata adalah antara 97.70% hingga 100.95%, menunjukkan ketepatan dan keberkesanan kaedah untuk kuantiti serentak komponen ini dalam sampel.

Kata kunci:Kromatografi cecair berprestasi tinggi,Cistanches Herba, potongan rebusan,Ekstrak cistanche tubulosa, phenylethanol glycosides, penentuan kandungan.

HETIAN DICHENBILIK HAD MIKROB

Cistanche, juga dikenali sebagai Rou Cong Rong dan Desert Ginseng, tergolong dalam keluarga Orobanchaceae dan digunakan dalam perubatan tradisional untuk batang berisinya yang ditutup dengan sisik. Ia memparasitkan akar tumbuhan Chenopodiaceae seperti Haloxylon dan Tamarix, dan terutamanya ditemui di kawasan gersang Mongolia Dalam, Qinghai, Xinjiang, dan Ningxia di China. Ia pertama kali disenaraikan dalam teks herba klasik "Shennong Bencao Jing" sebagai herba bermutu tinggi. Cistanche rasa manis dan masin, bersifat hangat, dan dikaitkan dengan buah pinggang dan meridian usus besar. Ia terkenal dengan faedahnya dalam menguatkan buah pinggang dan yang, melembapkan usus dan melegakan sembelit, melindungi hati, anti-penuaan, memerangi keletihan, dan meningkatkan imuniti. Secara klinikal, ia sering digunakan untuk merawat keadaan seperti kekurangan buah pinggang, sembelit kekurangan darah, ketidaksuburan pada wanita, lutut dan belakang lemah, dan penurunan daya ingatan. Cistanche dihormati sebagai "Ginseng of the Desert" dan "ubat berharga."

Tumbuhan ini mengandungi phenylethanol glycosides, iridoid terpenes, alkaloid, lignans, dan komponen lain, dengan echinacoside dan acteoside sebagai perwakilan phenylethanol glycosides yang terkenal dengan kesannya dalam meningkatkan yang, anti-penuaan, sifat antioksidan dan peningkatan ingatan. Komponen ini adalah asas utama untuk kesan perubatan Cistanche dan juga merupakan petunjuk utama untuk penilaian dan kawalan kualiti dalam Farmakope Cina edisi 2020.

Terdapat laporan mengenai penentuan kandungan phenylethanol glikosida dalam spesies Cistanche menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC), tetapi ini terhad kepada bahan dan hirisan Cistanche mentah. Pada masa ini, tiada piawaian kebangsaan untuk ekstrak Cistanche tubulosa, dan penentuan kandungannya belum dilaporkan. Penyelidikan awal kami mendapati bahawa Cistanche tubulosa dari Xinjiang terutamanya mengandungi empat wakil glikosida feniletanol: echinacoside, isoacteoside, acteoside, dan tubuloside A. Kajian ini mewujudkan kaedah HPLC untuk penentuan serentak empat komponen ini dalam kedua-dua kepingan rebusan Cistanche dan ekstrak Cistanche tubulosa, bertujuan untuk menilai dengan lebih baik kualiti potongan rebusan Cistanche dan membantu mewujudkan piawaian kualiti untuk ekstraknya. Laporan tersebut adalah seperti berikut.

1 Instrumen dan Reagen

1.1 Instrumen

• LC-20AT kromatografi cecair berprestasi tinggi, termasuk pengesan tatasusunan diod (Shimadzu, Jepun)

• Baki elektronik AB135-S (Mettler Toledo, Switzerland)

• Pembersih ultrasonik KQ-500DE (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Sistem air ultra tulen Aike (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Reagen

• Bahan piawai Pinoresinol diglucoside (Nombor kelompok S-003-01904003), Isomucronulatol 7-O-glucoside (Nombor kelompok Y-073-11803024), Mucronulatol 7-O-glucoside (Nombor kelompok M{ {6}}), dan Tubuloside A (Nombor kelompok G-066-11812016), semuanya dibeli daripada Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., dengan ketulenan lebih 98%.

• Asetonitril dan metanol gred kromatografi, asid formik gred analitik, air adalah sangat tulen.

• Empat kelompok rebusan Cistanches Herba (kod S1, S2 dari Inner Mongolia; kod S3, S4 dari Xinjiang) semuanya dibeli dari empat farmasi di Urumqi.

• Ekstrak cistanche tubulosa (kod S5, pengekstrakan air kepingan kering yang tidak diaktifkan enzim; kod S6, pengekstrakan alkohol hirisan kering enzim yang tidak diaktifkan; kod S7, pengekstrakan terikat resin alkohol kepingan kering yang tidak diaktifkan enzim) semuanya dibeli daripada Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co ., Ltd.

2 Kaedah dan Keputusan

2.1 Keadaan Kromatografi

• Lajur kromatografi: Lajur Inertsil ODS-3 (250 mm × 4.6 mm, 5 µm)

• Fasa mudah alih: Acetonitrile (A) - 0.1% larutan akueus asid formik (B) dengan elusi kecerunan (dari 17% A hingga 20% A melebihi 0-12 min, 20% A hingga 22% A melebihi 12-30 min, 22% A hingga 17% A selama 30-35 min)

• Kadar alir: 1.0 mL/min

• Panjang gelombang pengesanan: 330 nm

• Suhu lajur: 30 darjah

• Isipadu suntikan: 10 µL

  

Makmal Fiziko-kimia Hetia Dichen

2.2 Penyediaan Penyelesaian

• Penyelesaian standard campuran: Timbang setiap satu daripada empat piawaian dengan tepat dan pindahkan ke dalam kelalang volumetrik 10 mL yang berasingan, buat sehingga isipadu dengan 50% metanol untuk mendapatkan larutan piawai tunggal dengan kepekatan 1.008, 1.011, 1.012 dan 1.012 mg/L untuk Pinoresinol diglucoside, Tubuloside A, Mucronulatol 7-O-glucoside, dan Isomucronulatol 7-O-glucoside, masing-masing. Ukur jumlah yang sesuai bagi setiap satu, gabungkan dalam kelalang volumetrik 10 mL, bawa ke isipadu dengan 50% metanol, gaul rata untuk menyediakan larutan standard campuran dengan kepekatan 201.60, 50.55, 101.20, dan 50.60 µg/mL, masing-masing, dan penapis melalui penapis membran 0.45 µm.

• Contoh penyelesaian: Kira-kira 1.0 g serbuk rebusan Cistanches Herba (melepasi ayak No. 4) ditimbang dengan tepat dan dipindahkan ke dalam 1{{10}}0 mL kelalang volumetrik ambar . Tambah tepat 50 mL metanol 50%, timbang, ekstrak secara ultrasonik selama 40 minit dengan kuasa 250 W dan frekuensi 35 kHz, sejukkan, timbang semula, dan isikan jisim yang hilang dengan metanol 50%. Gaul rata, tapis, dan kumpulkan turasan. Melewati penapis membran 0.45 µm untuk mendapatkan larutan sampel Cistanches Herba. Begitu juga, sediakan larutan sampel ekstrak Cistanche tubulosa menggunakan kira-kira 0.2 g serbuk ekstrak.

1. Echinacoside 2. Tubuloside A 3. Acteoside 4. Isoacteoside A. Larutan rujukan campuran B. Larutan ujian keping merebus Cistanches Herba C. Larutan ujian ekstrak Cistanche Tubulosa

2.3 Peperiksaan Metodologi

Ujian Kesesuaian Sistem: Isipadu yang sesuai bagi tiga larutan daripada bahagian 2.2 telah diambil sampel di bawah keadaan kromatografi yang digariskan dalam bahagian 2.1, dan kromatogram telah direkodkan. Keputusan menunjukkan bahawa nombor plat teori untuk puncak echinacoside hendaklah tidak kurang daripada 3000, dengan darjah pemisahan lebih daripada 1.5, menunjukkan pemisahan garis dasar yang baik. Lihat Rajah 1 untuk butiran.

Penilaian Kelinearan: Isipadu tepat penyelesaian rujukan campuran daripada bahagian 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 dan 10.0 mL ) dipindahkan ke dalam 10 mL kelalang volumetrik, dibawa ke isipadu dengan 50% metanol, dicampur dengan baik, dan digunakan untuk mencipta satu siri penyelesaian rujukan campuran. Tepat 10 µL larutan ini disuntik di bawah keadaan kromatografi bahagian 2.1. Kawasan puncak direkodkan, dan regresi linear dilakukan menggunakan kepekatan komponen (X, µg/mL) sebagai pembolehubah bebas dan kawasan puncak (Y) sebagai pembolehubah bersandar. Persamaan regresi dan julat lineariti boleh didapati dalam Jadual 1.

Had Pengesanan dan Kuantiti: Isipadu tepat larutan rujukan campuran dari bahagian 2.2 telah diambil, dicairkan dengan sewajarnya, dan dianalisis di bawah keadaan kromatografi bahagian 2.1. Kepekatan yang sepadan dengan nisbah isyarat kepada hingar 3:1 dan 10:1 digunakan sebagai had pengesanan dan kuantiti, masing-masing. Keputusan dibentangkan dalam Jadual 1.

Ujian Kepersisan: Isipadu yang sesuai bagi larutan rujukan campuran dari bahagian 2.2 dianalisis enam kali berturut-turut di bawah keadaan kromatografi bahagian 2.1. Nilai RSD untuk kawasan puncak echinacoside, tubuloside A, acteoside dan isoacteoside ialah 1.31%, 0.91%, 1.58% dan 0.58%, masing-masing (n {{12} }), menunjukkan ketepatan instrumen yang baik.

Ujian Kestabilan: Penyelesaian sampel ujian telah disediakan dan dibiarkan pada suhu bilik selama 0, 2, 4, 6, 8, 12 dan 24 jam sebelum dianalisis di bawah syarat bahagian 2.1. Nilai RSD untuk kawasan puncak echinacoside, tubuloside A, acteoside dan isoacteoside masing-masing adalah 1.84%, 2.18%, 1.05% dan 1.55% (n=7), menunjukkan bahawa penyelesaian ujian adalah stabil di dalam bilik. suhu sehingga 24 jam.

Ujian Kebolehulangan: Satu sampel (ID: S2) ditimbang dengan tepat dan dibahagikan kepada enam bahagian. Setiap bahagian disediakan sebagai larutan sampel ujian mengikut kaedah dalam bahagian 2.2 dan dianalisis di bawah keadaan kromatografi bahagian 2.1. Purata kandungan echinacoside, tubuloside A, acteoside dan isoacteoside ialah 0.779%, 0.020%, 0.155% dan 0.074%, masing-masing , dengan nilai RSD sebanyak 1.21%, 3.12%, 2.65% dan 2.96% (n=6), menunjukkan kebolehulangan kaedah yang baik.

Ujian Pemulihan: Kuantiti sampel yang diketahui (ID: S2) telah diambil dan dibahagikan kepada sembilan bahagian. Setiap bahagian telah dicucuk dengan kepekatan rendah, sederhana atau tinggi bagi penyelesaian rujukan individu, disediakan mengikut kaedah dalam bahagian 2.2, dan dianalisis di bawah keadaan kromatografi bahagian 2.1. Kawasan puncak direkodkan, dan kadar pemulihan dikira. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 2.

Makmal HPLC Hetian DiChen

2.4 Penentuan Kandungan Contoh

Isipadu yang sesuai bagi setiap kelompok sampel telah disediakan sebagai penyelesaian ujian mengikut kaedah dalam bahagian 2.2, kemudian dianalisis di bawah keadaan kromatografi bahagian 2.1. Setiap sampel diuji dalam tiga kali ganda, kawasan puncak direkodkan, dan kandungan sampel dikira. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 3.

3 Perbincangan

Dalam kajian ini, pengesan tatasusunan diod telah digunakan, dan imbasan penyelesaian rujukan campuran dan penyelesaian sampel ujian dilakukan dalam julat panjang gelombang 200 hingga 450 nm. Keputusan menunjukkan bahawa echinacoside dan acteoside mempamerkan penyerapan maksimum pada 330 nm, tubuloside A pada 331 nm, dan isoacteoside pada 327 nm. Selain itu, merujuk kepada Farmakope Cina edisi 2020, yang menentukan panjang gelombang pengesanan 330 nm untuk echinacoside dan acteoside, didapati bahawa banyak komponen mempunyai puncak kromatografi yang ketara dan nilai tindak balas yang tinggi pada 330 nm, yang membawa kepada pemilihan 330 nm sebagai panjang gelombang pengukuran akhir.

Daripada hasil penentuan kandungan kepingan rebusan Cistanches Herba, didapati bahawa echinacoside mempunyai kandungan yang paling tinggi dalam kedua-dua Cistanche tubulosa dan desert Cistanche, diikuti dengan acteoside, manakala tubuloside A dan isoacteoside mempunyai kandungan yang agak rendah. Terdapat kebolehubahan yang ketara dalam kandungan empat komponen phenylethanol glikosida, dan kebolehubahan ini juga dinyatakan antara kelompok yang berbeza dari lokasi yang sama atau lokasi yang berbeza. Variasi ini boleh dikaitkan dengan faktor-faktor seperti persekitaran geografi, suhu, iklim, dan proses penuaian bahan mentah, yang mempengaruhi pengumpulan juzuk kimia dalam tumbuhan. Walaupun komponen kimia Cistanche yang diperoleh daripada asal yang berbeza adalah serupa, kepekatan komponen ini berbeza-beza, yang membawa kepada perbezaan dalam kesannya. Oleh itu, adalah wajar untuk memilih bahan mentah berdasarkan keberkesanannya untuk mencapai hasil klinikal yang lebih baik.

Secara ringkasnya, kaedah yang diwujudkan dalam kajian ini adalah mudah, pantas, tepat dan berkesan. Ia boleh digunakan untuk menentukan secara serentak empat komponen phenylethanol glikosida dalam kepingan rebusan Cistanches Herba dan ekstrak Cistanche tubulosa. Keputusan penentuan kandungan boleh mencerminkan tahap kualiti kumpulan berbeza dan ekstrak berbeza dari lokasi yang sama atau berbeza, menyediakan asas teori untuk mewujudkan piawaian kualiti yang berkaitan.

Tab. 2 Keputusan ujian pemulihan (n=9)

Tab. 3 Keputusan penentuan kandungan empat glikosida fenilethanoid dalam sampel(%,n=3)

Faedah Cistanche

Rujukan:

1. 中文 (Bahasa Cina): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:中国凌}}.
   英文 (Bahasa Inggeris): Suruhanjaya Farmakope Kebangsaan. Farmakope Republik Rakyat China (Jilid 1) [M]. Beijing: Akhbar Sains dan Teknologi Perubatan China, 2020: 140-141.

2. 中文 (Bahasa Cina): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (Bahasa Inggeris): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng, et al. Kajian perbandingan pada cap jari Cistanche deserticola dan Cistanche tubulosa [J]. Jurnal Farmaseutikal Cina, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (Bahasa Cina): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (Bahasa Inggeris): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui, et al. Perbandingan Cistanche deserticola dan Cistanche tubulosa [J]. Jurnal Kolej Perubatan Baotou, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (Bahasa Cina): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (Bahasa Inggeris): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei, et al. Kajian tentang kesan julap dan tonifikasi buah pinggang Cistanche deserticola dan Cistanche tubulosa [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (Bahasa Cina): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊,2017,35(11):2882-2885.
   英文 (Bahasa Inggeris): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu, et al. Kesan Cistanche deserticola sebelum dan selepas pemprosesan pada fungsi anti-penuaan dan imun dalam tikus model penuaan [J]. Jurnal Perubatan dan Farmasi Cina Tradisional Cina, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (Bahasa Cina): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (Bahasa Inggeris): Wu Bo, Fu Yumei. Kajian tentang kesan peroksidasi anti-lipid glikosida Cistanche pada tikus penuaan subakut [J]. Buletin Farmakologi Cina, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (Bahasa Cina): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4):370-373.
   英文 (Bahasa Inggeris): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying, et al. Kajian tentang kesan glikosida Cistanche terhadap pembelajaran dan fungsi ingatan dalam tikus normal [J]. Jurnal Perubatan Pencegahan Cina, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (Bahasa Cina): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (Bahasa Inggeris): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai, et al. Membangunkan industri ekologi Cistanche deserticola untuk mempromosikan tamadun ekologi di kawasan gurun barat [J]. Perubatan Cina Moden, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (Bahasa Cina): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (Bahasa Inggeris): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei, et al. Analisis kualitatif glikosida phenylethanoid dan polisakarida dalam Cistanche deserticola daripada asal-usul yang berbeza [J]. Jurnal Universiti Perubatan Tradisional Cina Liaoning, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (Bahasa Cina): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［J［. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (Bahasa Inggeris): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu, et al. Penentuan komponen aktif dalam Cistanche deserticola oleh kromatografi cecair berprestasi ultra-tandem triple quadrupole spektrometri jisim [J]. Jurnal Bahan Perubatan Cina, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (Bahasa Cina): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (Bahasa Inggeris): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Kajian tentang teknologi pengekstrakan kilat echinacoside dan verbascoside dalam Cistanche deserticola [J]. Penyelidikan dan Pembangunan Makanan, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (Bahasa Cina): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理,2019(13):111-112.
    英文 (Bahasa Inggeris): Yu Yifan. Kemajuan penyelidikan mengenai juzuk kimia dan aktiviti farmakologi Cistanche [J]. Pengurusan Kimia, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (Bahasa Cina): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102–103.
    英文 (Bahasa Inggeris): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Kesan Cistanche deserticola pada anti-keletihan dan ingatan pada tikus [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (Bahasa Cina): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (Bahasa Inggeris): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu, et al. Kemajuan penyelidikan mengenai juzuk kimia dan kesan farmakologi Cistanche deserticola dan analisis ramalan penanda kualitinya [J]. Jurnal Universiti Perubatan Tradisional Cina Liaoning, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (Bahasa Cina): 刘涛,殷松娜,栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志,2019,35(23):3084-3087.
    英文 (Bahasa Inggeris): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Kesan Cistanche deserticola pada faktor imun dan protein berkaitan apoptosis pada tikus dengan kegagalan ovari pramatang [J]. Jurnal Farmakologi Klinikal Cina, 20