Bagaimanakah Phenylethanoid Glycosides, Bahan Aktif Cistanche, Memainkan Peranan Neuroprotektif?

Xue Gong†a , Yan Xu†b , Kai Renc , Xiaorong Baid , Chunhong Zhanga

ABSTRAKDalam kajian ini, kami mengasingkan lapanphenylethanoidglikosidadari Paraboea martini buat kali pertama dan menilai mekanisme yang mendasari merekaneuroprotektifkesanterhadap kecederaan akibat H2O2- dalam sel PC12. Kaedah MTS digunakan untuk menyaringphenylethanoidglikosidauntuk keupayaan perlindungan. Seterusnya, analisis qRT-PCR dan western blotting digunakan untuk mengesan tahap transkripsi HO-1 dan GCLC, yang dikawal oleh Nrf2. Perencat ZnPP digunakan untuk menganalisis penglibatan Nrf2 dalam ungkapan HO-1. Analisis menunjukkan bahawa caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II juga mengimbangi ungkapan HO-1, tetapi tidak menunjukkan kesan yang jelas pada GCLC. Prarawatan dengan ZnPP mengurangkan dengan ketaraneuroprotektifkesan. Oleh itu, glikosida phenylethanoid yang diasingkan daripada P. martini melindungi sel PC12 daripada H2O2-kerosakan akibat dengan mengawal selia HO-1. Keputusan memberikan bukti bahawa P. martini mungkin merupakan agen terapeutik yang berpotensi untuk rawatanneurodegeneratifpenyakit.

SEJARAH ARTIKELDiterima 8 April 2019 Diterima 30 Julai 2019

KATA KUNCIParaboea martini;glikosida fenilethanoid; kesan neuroprotektif; zink protoporphyrin; HO-1

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Mekanisme kesan neuroprotektif Cistanche deserticola, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Tekanan oksidatif diketahui memainkan peranan penting dalam patogenesis beberapa penyakit. Ia dikaitkan dengan etiologiPenyakit Alzheimer(AD), penyakit Parkinson (PD), epilepsi, dan penyakit lain [1–3]. Pada masa ini, kemajuan berterusan telah dibuat dalam kajian patogenesis AD, PD, dan penyakit lain. Walau bagaimanapun, kerana pengetahuan terhad tentang mekanisme molekul yang mendasari AD, PD, dan penyakit lain, strategi pencegahan atau kuratif yang berkesan untuk penyakit ini belum direalisasikan [4]. H2O2 ialah komponen penting bagi spesies oksigen reaktif (ROS). Sehubungan itu, kecederaan sel PC12 akibat H2O2-adalah model tekanan oksidatif yang paling biasa digunakan dan digunakan secara meluas dalam kajian eksperimen kesan neuroprotektif [5]. Heme oxygenase 1 (HO-1) dan glutamat-cysteine ​​ligase-catalytic subunit (GCLC) ialah enzim antioksidan selular yang penting, dan kedua-dua gen dikawal hiliran faktor nuklear erythroid 2 (Nrf2), yang muncul sebagai terapeutik yang menjanjikan. sasaran untuk perlindungan saraf [6,7].Phenylethanoidglikosida, yang diperoleh daripada unit C-6-C-3, mengandungi banyak kumpulan hidroksil fenolik dan mempunyai aktiviti antioksidan dan antipenuaan yang ketara. Sejak beberapa tahun kebelakangan ini, kajian telah menunjukkan bahawa banyak tumbuhan ubatan mengandungi glikosida phenylethanoid yang menunjukkan aktiviti antioksidan yang ketara. Sebagai contoh, glikosida phenylethanoid yang diperoleh daripada Herba cistanche diketahui memberi kesan perlindungan terhadap defisit kognitif dalam AD. Kajian itu menyiasat mekanisme perlindungan yang berkaitan menggunakan model tetikus rawan 8 (SAMP8) yang dipercepatkan AD senescence. Keputusan menunjukkan bahawa keupayaan glikosida phenylethanoid untuk memperbaiki defisit kognitif dalam tikus SAMP8 mungkin berkaitan dengan promosi keplastikan sinaptik yang melibatkan proses antioksidan [8]. Dalam kajian ini, dua glikosida phenylethanoid diasingkan dan disucikan daripada simpulan kayu Tectona grandis (jati); sebatian ini menunjukkan kesan antioksidan yang ketara yang ditentukan menggunakan kaedah amperometrik [9]. Selanjutnya, sebatian glikosida phenylethanoid caffeoyl dari Lindernia ruellioides memberikan kesan antioksida yang bergantung kepada dos dan kesan penangkapan radikal bebas anion superoksida secara in vitro [10]. Mekanisme tindakan glikosida phenylethanoid berkaitan dengan peraturan laluan isyarat Nrf2/ARE, yang mempengaruhi sintesis SOD, CAT, GSH-PX, dan enzim antioksidan lain [11]. Keluarga Gesneriaceae, yang mengandungi 150 genera dan kira-kira 3700 spesies, diedarkan terutamanya di kawasan tropika dan sederhana di timur dan selatan Asia, Oceania, Amerika Selatan, Afrika, Eropah Selatan, dan Mexico [12]. Terdapat 54 genera dan kira-kira 463 spesies kepunyaan Gesneriaceae di China. Dilaporkan bahawa kira-kira 100 spesies mempunyai keberkesanan perubatan dan kebanyakannya diedarkan terutamanya di wilayah Guangxi dan Guizhou [13]. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, penyelidikan mengenai tumbuhan Gesneriaceae telah meningkat secara beransur-ansur di kawasan yang berbeza di dunia, dan beberapa juzuk baru dengan aktiviti fisiologi telah ditemui [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt tergolong dalam Parabola (Gesneriaceae) dan merupakan tumbuhan herba. Berdasarkan "Rekod Sumber Perubatan Tradisional Cina", telah direkodkan bahawa keseluruhan tumbuhan digunakan sebagai ubat. Selain itu, ia boleh melakukan banyak aktiviti farmakologi pada keadaan seperti hematemesis, edema, disentri, kecederaan traumatik, dan patah tulang [15]. Bai membuktikannyaphenylethanoidglikosidamerupakan salah satu unsur kimia utama tumbuhan Gesneriaceae [16]. Beberapa penyelidik juga mendapati bahawaphenylethanoidglikosidahave significant antioxidant activities [17]. Li demonstrated that phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 peratus ) daripada lapan glikosida fenilpropanoid diukur dengan kaedah normalisasi kawasan puncak HPLC. Sebagai contoh, carta kromatografi paraboside B dan paraboside II ditunjukkan dalam Rajah 1, dan kandungan relatifnya didapati masing-masing 98.23 peratus dan 99.20 peratus. Talian sel pheochromocytoma adrenal tikus yang tidak dibezakan dengan baik (PC12) telah dibeli daripada Bank Sel di Akademi Sains China (Shanghai, China). Medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM) dan serum kuda telah dibeli dari Gibco (Gaithersburg, MD, Amerika Syarikat). Fetal bovine serum (FBS) dibeli daripada Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 diperolehi daripada Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). Trizol telah dibeli daripada Invitrogen (Carlsbad, CA, Amerika Syarikat). Kit reagen PrimeScriptTM RT (Perfect Real Time) diperoleh daripada TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, China). Primer untuk HO-1, GCLC dan GAPDH telah disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, China). Kit Ujian Percambahan Sel (MTS) CellTiter 96® Aqueous One Solution diperoleh daripada Promega Corp. (Madison, Amerika Syarikat). Perencat HO-1 zink protoporfirin (ZnPP) telah dibeli daripada Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Inkubator Thermo311 CO2 (Thermo, USA), StepOnePlusTM Instrumen PCR Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo), dan xCELLigence RTCA DPlus Analyzer dan E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA) turut digunakan .

Kultur dan rawatan sel

Sel PC12 ditanam dalam DMEM yang mengandungi 5 peratus FBS dan 5 peratus serum kuda pada 37 darjah dalam suasana CO2 5 peratus yang lembap. Sel PC12 dibahagikan kepada tiga kumpulan seperti berikut: kumpulan kawalan, kumpulan model dan kumpulan rawatan. Lapan glikosida fenilpropanoid telah dibubarkan dalam DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

Penentuan H2O2

model, Kami menentukan kepekatan H2 O2 yang sesuai menggunakan analisis selular masa nyata (RTCA). Sel PC12 telah disemai dalam plat mikro-16 CIM pada isipadu 100 µL dan kemudian diinkubasi selama 12 jam pada 37 darjah dalam suasana 5 peratus CO2. Sel PC12 dibahagikan kepada kumpulan kawalan dan model. Seterusnya, 10 μL H2O2 (50, 100, 200, dan 400 μM) telah ditambah kepada kumpulan model, dan kumpulan kawalan telah dirawat dengan 10 μL DMEM lengkap, yang disediakan dalam tiga telaga kompleks. E-Plate 16 diletakkan dalam xCELLigence RTCA, dipantau setiap 15 minit, dan hasilnya direkodkan selama 32 jam. Kesan H2O2 pada sel PC12 dianalisis menggunakan perisian analisis data xCELLigence RTCA. Nilai indeks sel (CI) digunakan untuk menentukan kepekatan H2O2 optimum dan tempoh tindakan.

Pengekstrakan dan pengasingan kompaun

Pecahan dipisahkan berdasarkan kekutuban mereka menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini. P. martinii (4 kg) kering udara dan serbuk telah diekstrak tiga kali berturut-turut dengan larutan etanol akueus 75 peratus [20]. Ekstrak yang diperoleh kemudiannya dipekatkan menggunakan penyejat berputar untuk mengeluarkan etanol, dan ekstrak mentah diperolehi. Sampel telah dilarutkan dalam air ternyahion dan kemudian diekstrak berturut-turut dengan petroleum eter, etil asetat, n-butanol, dan air. Ekstrak n-butanol (400} g) telah difraksinasi menggunakan lajur resin makroporous AB-8 dan larutan etanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 dan 95 peratus ). Enam pecahan (pecahan 1–6) akhirnya diperolehi. Pecahan 3 dan 4 tertakluk kepada pemisahan menggunakan lajur MCI dengan kecerunan langkah MeOH-H2O2 (10–100 peratus ). Seterusnya, produk telah diasingkan menggunakan Sephadex LH-20 dengan 50 peratus MeOH sebagai eluen. Sebatian 1 (41.0 mg) dan 6 (15.6 mg) diasingkan daripada pecahan 3. Sebatian 2 (62.0 mg), 3 (34.7 mg), 7 (11.0 mg), dan 8 (26.0 mg) diperoleh daripada pecahan 4 menggunakan Sephadex Kromatografi LH-20 dengan 50 peratus MeOH sebagai eluen. Pengasingan akhir dilakukan oleh HPLC separa persediaan, fasa terbalik (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) dengan pengesanan MeOH dan UV 50 peratus pada 280 nm untuk menghasilkan sebatian 4 (39.0 mg) dan 5 (9.0 mg) [20].

Ujian daya maju sel

Sel PC12 telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 2 × 1{{10}}4 sel/perigi pada volum akhir 100 µL . Sel PC12 diinkubasi pada 37 darjah dengan 5 peratus CO2 selama 12 jam. Seterusnya, sel telah dirawat dengan pelbagai kepekatan ekstrak kasar (0.025, 0.05, 0.1, 0.2, dan 0.4 mg/mL) dan sebatian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8 pada lima kepekatan (3.125, 6.25, 12.5, 25, dan 50 μM). Selepas prarawatan selama 24 jam, daya maju sel ditentukan oleh ujian MTS. Sel PC12 telah diprainkubasi dengan atau tanpa perencat HO-1 tanpa ZnPP (15 μM) selama 30 minit, kemudian diinkubasi dengan atau tanpa caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II (3.125 μM) selama 12 jam, dan akhirnya diinkubasi dengan 400 μM H2O2 selama 6 jam lagi. Selepas rawatan, bilangan sel yang masih hidup ditentukan oleh ujian MTS [6].

Kesan perlindungan ekstrak mentah dan sebatian monomerik pada H2O2-sel PC12 yang dirawat

Sel-sel telah dikultur dalam {{0}}plat perigi pada isipadu akhir 100 µL. Pencairan bersiri ekstrak mentah (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 dan 0.4 mg/mL) telah ditambahkan pada kumpulan yang dirawat. Selepas prarawatan selama 12 jam, 400 μM larutan H2O2 (kepekatan optimum) telah ditambah kepada kumpulan yang dirawat dan kumpulan H2O2 setiap telaga selama 6 jam. Larutan MTS kemudiannya ditambah kepada setiap telaga, dan plat diinkubasi selama 3 jam pada 37 darjah C. Plat diayunkan pada kelajuan rendah selama 5 minit pada suhu bilik sehingga semua kristal dibubarkan sepenuhnya. Perlindungan sel ditentukan berdasarkan keputusan ujian MTS mengikut pengilang 2204 X. GONG ET AL. Dimuat turun dari https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 oleh tetamu pada 27 Ogos 2021arahan. Ketumpatan optik ditentukan pada panjang gelombang penyerapan 490 nm. Kami selanjutnya mengesan aktiviti sebatian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 yang diasingkan daripada pecahan 3 dan 4. Pencairan bersiri sebatian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 (3.125, 6.25, 12.5, 25 dan 50 μM) telah ditambahkan pada kumpulan yang dirawat untuk menentukan kesan perlindungan masing-masing pada H2O2-sel PC12 yang disebabkan.

PCR masa nyata kuantitatif (qRT-PCR)

Sel PC12 dituai pada 12 jam selepas rawatan dengan 3.125 μM caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II. Jumlah RNA diekstrak menggunakan reagen TRIzol, dan alikuot jumlah RNA telah ditranskripsikan terbalik menggunakan Kit Master Primescript RT mengikut arahan pengilang. Primer berikut telah digunakan untuk eksperimen mengikut laporan sebelumnya [21]. HO-1: Hadapan 5′ -GC CTGCTAGCCTGTTCAAG-3′, Songsang 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Hadapan 5′ - GTCTCCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Songsang 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Ke hadapan 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Songsang 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Aliquot dari cDNA yang diperoleh kemudiannya dikuatkan oleh PCR. Keadaan tindak balas adalah seperti berikut: denaturasi awal pada 95 darjah (30 saat), diikuti oleh 40 kitaran pada 95 darjah (5 saat), 60 darjah (34 saat), dan 72 darjah (35 saat). Semua primer telah diuji dan isyarat pendarfluor FL dikesan; kemudian, nilai △Ct dikira dan nilai relatif dibandingkan dengan kumpulan kawalan menggunakan persamaan berikut: △Ct=Ct (sampel) − Ct (kawalan endogen), △△Ct {{36} } △Ct (sampel) −△Ct (tidak dirawat), dan lipat tukar=2−△△Ct. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) telah digunakan sebagai kawalan dalaman.

Pengekstrakan protein

Sel PC12 telah disemai pada 100-mm hidangan pada 1 × 107 sel/hidangan. Selepas lampiran, sel masing-masing dirawat dengan caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II (3.125 μM) selama 12 jam. Glikosida kemudiannya dikeluarkan, dan sel-sel diinkubasi dengan H2O2 selama 6 jam lagi. Selepas pengeraman, sel-sel telah dibasuh dua kali dengan PBS sejuk dan dikikis dari pinggan dengan 1 mL PBS. Homogenat sel telah disentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 minit. Selepas rawatan, protein selular diekstrak menggunakan penimbal lisis sel Beyotime RIPA dengan 1 mM PMSF mengikut arahan pengilang. Di samping itu, protein sitoplasma dan nuklear telah diasingkan seperti yang diterangkan dalam protokol kit pengekstrakan nuklear dan sitoplasma Beyotime. Kepekatan protein sampel telah dikesan menggunakan kit ujian protein Beyotime BCA, dan semua sampel disimpan pada −80 darjah untuk analisis western blotting [6].

Analisis Western blot

Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan selepas pengekstrakan dan denaturasi seterusnya jumlah protein daripada kumpulan yang berbeza. Selepas elektroforesis, protein dipindahkan ke membran PVDF, yang kemudiannya disekat dengan susu tepung skim 5 peratus selama 4 jam. Selepas mencuci, antibodi primer (antibodi poliklonal arnab GAPDH (pencairan 1:10,000), antibodi poliklonal arnab HO-1 (pencairan 1:1000), atau antibodi poliklonal arnab GCLC (pencairan 1:1000) telah ditambah pada membran, yang diinkubasi semalaman pada 4 darjah. Keesokan harinya, membran PVDF dibasuh tiga kali dalam TTBS. Seterusnya, antibodi sekunder (konjugasi pertalian kambing tulen anti-arnab IgG (pencairan 1:1000) dilabelkan dengan lobak pedas peroksidase telah ditambah pada membran, yang kemudiannya diinkubasi pada suhu bilik selama 2 jam. Membran PVDF telah dibasuh dan tertakluk kepada reagen pengesan chemiluminescence ECL untuk pendedahan isyarat pada filem sinar-X, yang kemudiannya dibetulkan dan diimbas [22].

Analisis statistik

Data telah dianalisis menggunakan SPSS 19.0, dan hasilnya dibentangkan sebagai min dengan sisihan piawai (SD) bagi tiga eksperimen bebas. Nilai p < 0.05="" dianggap="" menunjukkan="" perbezaan="" ketara="" secara="">

Keputusan Penubuhan model H2O2

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, H2O2 pada 50, 100, dan 200 μM tidak menyebabkan tahap kematian sel yang sesuai. Walau bagaimanapun, 400 μM H2O2 bertindak pada sel PC12 dalam masa 2-6 jam, dan kerosakan oksidatif pada sel cenderung stabil. Oleh itu, kami menganggap bahawa induksi dengan H2O2 pada kepekatan 400 μM selama 6 jam adalah sesuai untuk meniru kecederaan yang disebabkan oleh tekanan oksidatif kepada sel PC12.

Kesan perlindungan ekstrak mentah pada sel PC12 yang dirawat dengan H2O2

Berbanding dengan kumpulan model H2O2 (Rajah 3), ekstrak n-butanol pada kepekatan 0.05, 0.1, {{10} }.2, dan 0.4 mg/mL dengan ketara meningkatkan kerosakan oksidatif pada sel PC12 yang disebabkan oleh H2O2 (p < 0.05)="" dalam="" cara="" yang="" bergantung="" kepada="" kepekatan.="" data="" ini="" mencadangkan="" bahawa="" pecahan="" n-butanol="" mengandungi="" aktiviti="" perlindungan="" yang="" lebih="" kuat.="" walau="" bagaimanapun,="" ekstrak="" eter="" petroleum="" dan="" etil="" asetat="" menunjukkan="" aktiviti="" perlindungan="" hanya="" pada="" kepekatan="" tinggi="" (eter="" petroleum:="" 0.1="" dan="" 0.2="" mg/="" ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;="" etil="" asetat:="" 0.2="" dan="" 0.4="" mg/ml,="" p=""><0.05). selain="" itu,="" kepekatan="" ekstrak="" fasa="" akueus="" yang="" berbeza="" tidak="" menunjukkan="" kesan="" perlindungan="" (p=""> 0.05). Tambahan pula, kami telah menambah data daripada kajian pengesahan menggunakan talian sel neuroblastoma manusia SH-SY5Y (SH-SY5Y) dalam Fail Tambahan. Rawatan dengan 250 μM H2O2 mengakibatkan daya tahan sel menurun; bagaimanapun, rawatan caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II (3.125, 6.25, 12.5, 25, dan 50 μM) melemahkan kematian sel SH-SY5Y dengan ketara. Keputusan percubaan membuktikan bahawa caleolarioside B, paraboside B dan paraboside II melindungi sel SHSY5Y daripada H2O2-kecederaan sel yang disebabkan.

Struktur sebatian yang diasingkan daripada pecahan n-butanol

Untuk mengesahkan bahawa ekstrak n-butanol mengandungi komponen aktif, kami membahagikan lagi lapan sebatian daripada pengekstrakan. Struktur sebatian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 telah dikenal pasti dengan data spektrum yang berbeza (1 H-NMR, 13C-NMR, dan ESI-MS) berdasarkan perbandingan kepada data yang diterbitkan untuk paraboside A , paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B dan isonuomioside A, masing-masing [20]. Sebagai contoh, data untuk paraboside B adalah seperti berikut: gusi coklat; ½ 20 D −55.7 (c 0.05, CH3OH) [20]; UVMeOH maks nm (logε): 220 (3.61), 291 (3.54), 330 (3.66) [20]; IRKBr maks cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 8170−; untuk data terperinci spektroskopi 1 H dan 13C NMR ditunjukkan dalam rujukan 20; HR-ESI-MS (negatif) m/z 741.2231 [MH]− (kira. untuk C33H41O19, 741.2242) [20]. Data untuk paraboside II adalah seperti berikut: serbuk amor phous putih; ½ 20 D −80.5 (c 0.05, CH3OH) [20]; UVMeOH maks nm (logε): 229 (3.74), 322 (3.73) [20]; IRKBr maks cm−1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; untuk data terperinci spektroskopi 1 H dan 13C NMR ditunjukkan dalam rujukan 20; ESI-MS (negatif) m/z 637

Kesan perlindungan sebatian terpencil terhadap ketoksikan akibat H2 O2-dalam sel PC12

Ujian MTS digunakan untuk menyiasat kesan sebatian terpencil ke atas daya maju sel PC12 yang terdedah kepada ketoksikan yang disebabkan oleh H2O2-. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5, berbanding dengan kumpulan kawalan, sel PC12 diprarawat dengan lima kepekatan berbeza caleolarioside B, paraboside B, paraboside II atau paraboside A (3.125, 6.25, 12.5, 25 dan 50 μM) selama 24 jam tidak menunjukkan perbezaan ketara dalam daya maju sel (p > 0.05). Oleh itu, prarawatan sel PC12 dengan caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II tidak menghasilkan sitotoksisiti. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6, 400 µM H2O2 telah mengurangkan daya tahan sel dengan ketara berbanding dengan kumpulan kawalan. Selain itu, daya maju sel sel PC12 yang dirawat H2O{22}} meningkat dengan ketara berikutan prarawatan sel PC12 dengan kepekatan caleolarioside B, paraboside B dan paraboside II yang berbeza; Tambahan pula, daya maju sel adalah rawatan tertinggi berikutan dengan 50 µM caleolarioside B, 50 µM paraboside B, dan 12.5 µM paraboside II. Lima sebatian lain tidak menunjukkan kesan perlindungan yang ketara pada H2O2-sel PC12 yang dirawat. Untuk menggambarkan penemuan ini, kami membincangkan salah satu daripada ini sebagai contoh, manakala yang lain tidak diterangkan dalam manuskrip.

Tahap transkripsi HO-1 dan GCLC

Kami seterusnya menguji tahap transkrip HO-1 dan GCLC dalam sel PC12 yang dirawat dengan caleolarioside B, paraboside B dan paraboside II. Jumlah mRNA dikumpulkan daripada sel PC12 yang dirawat dan tidak dirawat selama 12 jam, dan kemudian tertakluk kepada analisis ekspresi oleh qRT-PCR. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7(a,c,e), tahap transkrip HO-1 meningkat dengan ketara selepas

Sel PC12 telah dirawat terlebih dahulu dengan kepekatan caleolarioside B, paraboside B dan paraboside II yang ditunjukkan selama 12 jam (p < 0.{{10}}5).="" seperti="" yang="" ditunjukkan="" dalam="" rajah="" 7(b),="" tahap="" transkrip="" gclc="" juga="" meningkat="" dengan="" ketara="" dalam="" sel="" pc12="" yang="" diprarawat="" dengan="" kepekatan="" caleolarioside="" b="" yang="" ditunjukkan="" selama="" 12="" jam.="" walau="" bagaimanapun,="" tahap="" gclc="" dalam="" sel="" pc12="" pra-rawatan="" dengan="" paraboside="" b="" selama="" 12="" jam="" menurun="" dengan="" ketara="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" model="" (p=""><0.05; rajah="" 7(d)).="" tambahan="" pula,="" dengan="" rawatan="" paraboside="" ii,="" tahap="" gclc="" dalam="" sel="" pc12="" tidak="" jauh="" berbeza="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" model="" (p=""> 0.05; Rajah 7(f)).

Ungkapan HO-1 dan GCLC

HO{{0}} dan GCLC ialah enzim antioksidan selular yang penting, dan kedua-duanya ialah gen hiliran Nrf2-yang dikawal. Ekspresi protein HO-1 dan GCLC juga diperhatikan selepas rawatan [6]. Rajah 8 menunjukkan tahap protein HO-1 dan GCLC dalam sel PC12 selepas rawatan dengan 400 μM H2O2; keputusan menunjukkan bahawa keamatan pendarfluor FL HO-1 dalam kumpulan caleolarioside B dan paraboside B adalah lebih besar daripada kumpulan yang dirawat H2O2-(Rajah 8(a,c)). Walau bagaimanapun, ungkapan GCLC tidak berubah dengan ketara oleh sebatian, kecuali untuk caleolarioside B (Rajah 8(b)). Seterusnya, perencat kimia HO-1 digunakan untuk menilai lebih lanjut peranan enzim antioksidan dalam mengawal selia kesan perlindungan yang dikenakan oleh caleolarioside B, paraboside B atau paraboside II terhadap sitotoksisiti yang disebabkan oleh H2O2-. Caleolarioside B, paraboside B dan paraboside II (3.125 µM) menghalang sitotoksisiti akibat H2O2-tetapi kesan perlindungan tersebut telah diterbalikkan oleh perencat HO-1 ZnPP (p < 0.01)="" pada="" 15="" µm="" (rajah="" 8="">

Perbincangan

Penuaan penduduk adalah masalah global yang teruk. Banyak penyakit yang berkaitan dengan nyanyuk, seperti AD dan PD, yang merupakan ancaman serius kepada kesihatan awam. AD dan PD telah muncul sebagai penyakit ketiga paling mematikan di dunia, selepas penyakit kardiovaskular dan kanser. Oleh itu, neurodegeneration telah menjadi topik penyelidikan yang mendesak di seluruh dunia. Walau bagaimanapun, patogenesis AD dan PD, penyakit neurodegeneratif sistem saraf pusat, masih tidak jelas sehingga kini. Tambahan pula, terdapat hanya beberapa ubat yang berkesan merawat AD atau PD kerana mekanisme patogeniknya yang kompleks [23]. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa ROS, seperti anion superoksida (O2−) dan H2O2, adalah faktor utama yang menyumbang kepada penyakit neurodegeneratif. Perubahan patologi semasa PD termasuk degenerasi neuron dan kematian substantia nigra dan dopamin striatal [24,25]. Sehubungan itu, adalah penting untuk membangunkan ubat antioksidan yang berkesan untuk merawat PD, dan penemuan ubat tersebut telah menjadi hala tuju penyelidikan yang penting [26]. Pada masa ini, laluan isyarat Nrf2/ARE nampaknya merupakan laluan tekanan antioksidan endogen yang paling penting [27]. ARE terletak di kawasan gen 5′-flflanking, seperti HO-1 dan GCLC [28,29]. HO-1 dan GCLC ialah gen berkaitan Nrf2-yang dikawal selia di hiliran protein ini [6]. ARE seterusnya boleh menjejaskan tahap antioksidan dan mengaktifkan ekspresi hiliran HO-1 dan gen pelindung lain, yang boleh meningkatkan aktiviti perlindungan sel [30,31]. Tambahan pula, penemuan mencadangkan bahawa kesan perlindungan resveratrol terhadap ketoksikan teraruh A 1-42- dalam sel PC12 berlaku melalui penyelarasan ekspresi HO-1 melalui pengaktifan laluan isyarat intrasel Nrf2 [32].

Sel PC12 adalah model sel saraf yang diterima dan digunakan secara meluas dalam kajian kesan neuroprotektif [33]. H2O2 boleh dengan mudah melalui membran sel dan bergabung dengan besi untuk membentuk radikal bebas yang sangat aktif, yang menyebabkan tekanan oksidatif dan kecederaan sel [34]. H2O2 ialah ROS yang penting, dan radikal bebas mudah dihasilkan dan agak stabil, oleh itu, ia biasanya digunakan untuk mewujudkan model tegasan oksidatif menggunakan sel PC12 [5]. Dalam kajian ini, prarawatan sel PC12 dengan kepekatan bukan toksik ekstrak tumbuhan melindungi sel daripada H2O2-mengakibatkan sitotoksisiti dengan mengurangkan penjanaan ROS. Glikosida phenylethanoid mengandungi banyak kumpulan hidroksil fenolik yang mempunyai aktiviti antioksidan dan antipenuaan. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa pengekstrakan n-butanol menghasilkan perlindungan yang lebih baik daripada pecahan kekutuban lain (Rajah 3). Oleh itu, kami terus menyaring aktiviti perlindungan lapan sebatian yang diasingkan daripada pecahan n-butanol. Keputusan menunjukkan buat kali pertama bahawa Rajah 8. Analisis tahap protein HO-1 dan GCLC pada sel PC12. (a) Analisis Western blotting bagi ungkapan HO-1 dan GCLC serta GAPDH telah digunakan sebagai kawalan pemuatan. ( b ) Analisis Western blot ekspresi protein GCLC. (c) Analisis Western blot HO{{20}} ekspresi protein. (d) perencat HO-1 ZnPP mengurangkan kesan neuroprotektif. Data dibentangkan sebagai min ± SD, n=3. ***p < 0.001="" berbanding="" kumpulan="" kawalan;="" #p="">< 0.05="" berbanding="" kumpulan="" h2o2="" (tanpa="" znpp="" dirawat),="" ##p="">< 0.01="" berbanding="" kumpulan="" h2o2="" (tanpa="" znpp="" dirawat),="" ###p="">< 0.001="" berbanding="" kumpulan="" h2o2="" (tanpa="" znpp="" dirawat);="" dan="" p=""><0.01, berbanding="" kumpulan="" h2o2="" (dengan="" znpp="" dirawat),="" dan="" &="" p=""><0.001, berbanding="" kumpulan="" h2o2="" (dengan="" znpp="" dirawat).="" (kumpulan="" kawalan;="" kumpulan="" model:="" h2o2;="" kumpulan="" negatif="" znpp:="" caleolarioside="" b="" campur="" h2o2,="" paraboside="" b="" campur="" h2o2,="" paraboside="" ii="" campur="" h2o2;="" kumpulan="" positif="" znpp:="" znpp="" campur="" caleolarioside="" b="" campur="" h2o2,="" znpp="" tambah="" paraboside="" b="" campur="" h2o2,="" znpp="" tambah="" paraboside="" ii="" ditambah="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" dimuat="" turun="" oleh="" tetamu="" pada="" 27="" ogos="" 2021caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" dan="" paraboside="" ii="" mempunyai="" kesan="" perlindungan="" yang="" ketara="" terhadap="" kerosakan="" oksidatif="" akibat="" h2o2-="" dalam="" sel="" pc12.="" keputusan="" juga="" menunjukkan="" bahawa="" rawatan="" h2o2="" menyebabkan="" kecederaan="" sel="" pc12="" yang="" ketara="" dan="" daya="" tahan="" sel="" menurun,="" manakala="" rawatan="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" dan="" paraboside="" ii="" mengurangkan="" kesan="" ini="" dengan="" ketara="" (rajah="" 6).="" kajian="" terdahulu="" melaporkan="" bahawa="" laluan="" nrf2/are="" ialah="" salah="" satu="" daripada="" laluan="" antioksidan="" endogen="" yang="" paling="" penting,="" dan="" boleh="" mengawal="" selia="" ekspresi="" penanda="" hiliran,="" seperti="" ho-1,="" untuk="" melindungi="" sel="" [7].="" hasil="" analisis="" qrt-pcr="" dan="" western="" blotting="" menunjukkan="" bahawa="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" dan="" paraboside="" ii="" secara="" signifikan="" meningkatkan="" tahap="" ho-1.="" walau="" bagaimanapun,="" tahap="" transkrip="" gclc="" meningkat="" dengan="" ketara="" dalam="" sel="" pc12="" yang="" diprarawat="" dengan="" caleolarioside="" b="" tetapi="" menurun="" dalam="" mereka="" yang="" dirawat="" dengan="" paraboside="" b="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" model.="" selanjutnya,="" arabinoside="" ii="" tidak="" mengubah="" ungkapan="" penanda="" ini,="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" model="" (rajah="" 7="" dan="" 8(a–c)).="" selain="" itu,="" kesan="" perlindungan="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" dan="" paraboside="" ii="" terhadap="" kecederaan="" sel="" pc12="" yang="" disebabkan="" h2o{78}}diterbalikkan="" oleh="" perencat="" ho-1="" znpp="" (rajah="" 8(d)).="" kesimpulannya,="" phenylethanoid="" glycosides="" caleo="" larioside="" b,="" arabinoside="" b,="" dan="" paraboside="" ii="" secara="" berkesan="" melindungi="" sel="" pc12="" daripada="" h2o2-kerosakan="" oksidatif="" yang="" disebabkan.="" sehubungan="" itu,="" sebatian="" ini,="" diasingkan="" daripada="" p.="" martini,="" mungkin="" mewakili="" calon="" ubat="" yang="" berpotensi="" untuk="" rawatan="" penyakit="">

Sumbangan pengarangLM, dan ZC menyusun dan mereka bentuk eksperimen. GX, RK dan BX melakukan eksperimen. GX dan XY menulis kertas itu. GX, XY, RK, BX, ZC, dan LM membincangkan keputusan, mengulas manuskrip. Semua pengarang membaca dan meluluskan manuskrip akhir.

Kenyataan pendedahanTiada potensi konflik kepentingan dilaporkan oleh pengarang. Pembiayaan Kerja ini disokong oleh Dana Penyelidikan Kolej Perubatan Baotou [nombor geran: BYJJ-YF 201727], dan subsidi perkhidmatan kesihatan awam perubatan Cina 2018 khas "kaji selidik keempat mengenai sumber bahan perubatan Cina" [nombor geran: Persatuan Kewangan [2018] ] 43].

Rujukan

[1] Butterfield DA. Perspektif mengenai tekanan oksidatif dalam penyakit Alzheimer dan ramalan penekanan penyelidikan masa depan. J Alzheimers Dis. 2018;64:1–11.

[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Tekanan oksidatif dan peptida amyloid-beta dalam penyakit Alzheimer. Biol Redoks. 2018;14:450–464.

[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Kerosakan kepada neuron dopaminergik oleh tekanan oksidatif dalam penyakit Parkinson (kajian semula). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.

[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Persatuan polimorfisme rs823128, rs1572931, dan rs823156 dengan mengurangkan risiko penyakit Parkinson. Neuroreport. 2017;27:936–941.

[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. Tindakan antioksidan 7,8-dihydroxyflflavone melindungi sel PC12 daripada 6-sitotoksisiti akibat hidroksidopamin. Neurochem Int. 2014;64:18–23.

[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Kesan neuroprotektif empat glikosida phenylethanoid pada apoptosis teraruh H2O2-pada sel PC12 melalui laluan Nrf2/ARE. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.

[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Laluan Nrf2-ARE: sasaran yang muncul terhadap tekanan oksidatif dan keradangan saraf dalam penyakit neurodegeneratif. Terapi Farmakol. 2016;157:84–104.

[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, et al. Kesan glikosida phenylethanoid, yang diperoleh daripada Herba cistanche, pada defisit kognitif dan aktiviti antioksidan dalam tikus SAMP8 jantan. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.

[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Glikosida phenylethanoid daripada simpulan kayu jati dan aktiviti antioksidannya. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.

[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Aktiviti antioksidan sebatian glikosida phenylethanoid caffeoyl daripada Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.

[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Peranan Nrf2-ARE laluan dalam kecederaan tekanan oksidatif dan hubungannya dengan laluan isyarat lain. Sci Makanan Penternakan Anim. 2016;37:42–48.

[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Kemajuan dalam kajian Gesneriaceae. Dadah Baru Chin J. 2003;12:261–263.

[13] Wen F, Li ZD. Kemajuan penyelidikan mengenai tumbuhan Gesneriaceae. Chin Wild Plant Resour. 2006;25:1–6.

[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. Kemajuan penyelidikan triterpenoid tumbuhan Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.

[15] Syarikat ubat herba Cina. Rekod sumber perubatan tradisional Cina. China: Akhbar Sains; 1994.

[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG, et al. Taburan glikosida phenylethanoid dalam tumbuhan ubatan Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.

[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Aktiviti antioksidan glikosida phenylethanoid daripada Brandisia hancei. J Ethnopharmacol. 2000;71:483–486.

[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. Kajian tentang aktiviti antioksidan glikosida phenylethanoid daripada Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.

[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Kesan perlindungan glikosida cistanche pada kerosakan sel PC12 PARABOLA MARTINI MELINDUNGI SEL PC12 DARIPADA H2O2-KECEDERAAN TERINDUCED 2211