Ekstrak Herba Cistanche Meningkatkan Status Mitokondria Glutathione Dan Pernafasan dalam Jantung Tikus, Dengan Kemungkinan Induksi Protein Uncoupling

pengenalan

Reperfusi miokardium iskemia sebelum ini menyebabkan satu siri perubahan mitokondria, termasuk peningkatan pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS), Ca2+beban berlebihan, dan penurunan dalam pengeluaran adenosin trifosfat (ATP), yang semuanya boleh menyebabkan nekrosis dan/atau kematian sel pengantara apoptosis (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Oleh kerana mitokondria memainkan peranan penting dalam menentukanDalam nasib kardiomiosit berikutan cabaran iskemia/reperfusi (I/R), perlindungan terhadap kecederaan I/R miokardium hendaklah disasarkan ke arah pemeliharaan integriti struktur dan fungsi mitokondria. Penyelenggaraan metabolisme tenaga mitokondria selepas cabaran I/R adalah amat penting kerana fungsi kontraktil jantung hampir sepenuhnya bergantung kepada ATP yang dijana mitokondria. Kardiomiosit yang masih hidup tetapi tidak mengecut adalah sangat sedikit kegunaannya.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN IMUNITI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, keseluruhan tumbuhan keringCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), ialah tumbuhan parasit yang tumbuh terutamanya di kawasan padang pasir di utara dan timur laut China. Herba Cistanche, diklasifikasikan sebagai herba "Yang-mencergaskan" dalam perubatan Cina, ditetapkan untuk kekurangan buah pinggang, kemandulan wanita, dan sembelit yang timbul daripada kekeringan usus pada pesakit nyanyuk (Chen, 1998). Kajian terdahulu di makmal kami telah menunjukkan bahawa metanolekstrak Herba Cistanchemeningkatkan kapasiti penjanaan ATP miokardium (Leung & Ko, 2008) dan melindungi daripada kecederaan I/R miokardium pada tikus (Leung, 2006). Manakala rangsangan kapasiti penjanaan ATP adalah selari dengan peningkatan dalam pengangkutan elektron mitokondria (Leung & Ko, 2008), perlindungan kardio terhadap kecederaan I/R yang diberikan oleh rawatan Herba Cistanche dikaitkan dengan penurunan pengurangan ATP miokardium (Leung, 2006). Dalam kajian ini, untuk menentukan peranan mitokondria dalam tindakan kardioprotektif Herba Cistanche, kami menyiasat kesan rawatan Herba Cistanche pada status glutation mitokondria, kandungan Ca2+, potensi membran dan kadar pernafasan, dalam hati tikus. .

Bahan dan kaedah

Bahan herba

Herba Cistanche telah dibeli daripada pengedar herba tempatan (berpangkalan di Hong Kong) (Lee Hoong Kee). Herba itu telah disahkan oleh pembekal dan spesimen baucar (HKUST00301) telah disimpan di Jabatan Biokimia, Universiti Sains & Teknologi Hong Kong (HKUST). Pengekstrakan metanol herba telah dijalankan, berdasarkan kajian terdahulu yang menunjukkan bahawa ekstrak sedemikian meningkatkan penjanaan ATP mitokondria dan dilindungi daripada kecederaan I/R dalam hati tikus (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Secara ringkasnya, Herba Cistanche (400 g) dipotong menjadi kepingan kecil dan diekstrak dengan memanaskan di bawah refluks dalam 300mL metanol pada 60 darjah selama 2 jam, seperti yang diterangkan sebelum ini (Leung & Ko, 2008). Prosedur itu diulang dua kali. Ekstrak terkumpul telah dikeringkan dengan menyejat pelarut di bawah tekanan yang dikurangkan; hasil adalah 42% (b/b) mengenai jumlah herba mentah. Ekstrak disimpan pada 4 darjah sehingga digunakan. Walaupun herba Cina secara tradisinya diekstrak air untuk penggunaan oral, metanol telah digunakan dalam kajian awal kami untuk kemudahan pemprosesan dan penyimpanan sampel (Yim & Ko, 2002), dan kami mendapati pengekstrakan metanol adalah memuaskan dalam semua aspek.

Penjagaan haiwan dan rawatan dadah

Tikus Sprague-Dawley betina dewasa (8–10 minggu; 200–230 g) ditempatkan di dalam bilik terkawal kelembapan, dengan kitaran gelap/cahaya 12 jam, pada kira-kira 22 darjah, dan membenarkan makanan dan air secara ad libitum. Haiwan ditugaskan secara rawak kepada kumpulan yang berbeza, dengan lima haiwan dalam setiap kumpulan. Tikus menerimaEkstrak Herba Cistanchesecara intragastrik ({{0}}.2 g/mL dalam air) pada 0.5g/kg atau 1.0 g/kg selama 3 hari berturut-turut. Haiwan kawalan (tidak dirawat) menerima air sahaja. Dua puluh empat jam selepas dos terakhir, tisu ventrikel jantung diperoleh daripada haiwan yang dibius untuk analisis biokimia. Semua protokol eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Amalan Penyelidikan, HKUST.

Penyediaan pecahan mitokondria

Tisu ventrikel jantung cincang (~{{0}}}.6g) telah dihomogenkan dalam 10-lipatan (w/v) lebihan penimbal sukrosa ais sejuk [0.32M sukrosa, 1mM etilena diamine asid tetraacetic (EDTA), 50mM Tris/HCl; pH 7.4] menggunakan homogenizer kaca Teflon, pada 4000 rpm, dengan 25-30 pukulan. Pelet mitokondria disediakan daripada homogenat tisu dengan sentrifugasi pada 800 × g pada 4 darjah selama 30 minit, dan ketulenan ditentukan dengan pengukuran aktiviti spesifik relatif suksinat dehidrogenase dan laktat dehidrogenase dalam supernatan dan pelet, masing-masing, seperti yang diterangkan sebelum ini (Evans, 1992). Pelet mitokondria digantung dalam 1mL penimbal homogenisasi.

Pengukuran tahap glutation terkurang mitokondria dan glutation teroksida

Tahap glutathione terkurang mitokondria (GSH) ditentukan secara enzimatik menggunakan 5,59-dithiobis(2- asid nitrobenzoik) (DTNB) dan glutathione reductase (GR), dalam protokol yang diubah suai daripada Griffith (198{{17} }). Aliquot (210 µL) pecahan mitokondria telah dicampur dengan 90 µL 10% (v/v) 5-asid sulfosalicylic (SSA) dan campuran diempar pada 600×g selama 10 minit. Untuk mengukur tahap glutation teroksida (GSSG), 100µL jumlah supernatan SSA dicampur dengan 10 µL 20% (w/v) 2-vinylpyridine dan 10 µL 60% (v/v) triethanolamine dalam tiub mikrofuge. Setiap tiub dibenarkan berdiri pada suhu bilik selama sekurang-kurangnya 1 jam. Campuran tindak balas yang mengandungi 0.63mM DTNB dan 0.053mM NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) dalam penimbal fosfat (0.1M, dengan 5mM Na2 EDTA; pH7.5) telah dipraeram pada 30 darjah selama 2 minit. Aliquot (30 µL) sama ada supernatan sampel SSA (jumlah glutation) atau sampel GSSG telah ditambahkan pada telaga 96-plat mikrotiter telaga dan 180 µL campuran tindak balas pra-panas, yang mengandungi 0.525U/ mL GR, seterusnya ditambah. Perubahan penyerapan pada 412nm dipantau secara spektrofotometri selama 5 minit. Kepekatan GSH dan GSSG dianggarkan daripada lengkung penentukuran menggunakan GSH dan GSSG [dilarutkan dalam 3% (w/v) SSA] sebagai piawai dan dinyatakan sebagai nmol/mg protein. Tahap GSH dianggarkan dengan menolak dua kali ganda jumlah GSSG daripada jumlah GSH.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Pengukuran kandungan Ca2+ mitokondria

Kandungan Ca{{{0}} mitokondria telah diukur menggunakan kuar pendarfluor sensitif Ca2+-, Fluo-5N AM ester (Probe Molekul, Eugene, OR) menggunakan Kaunter Berbilang Label Victor2 (Model 1420; PerkinElmer, Turku, Finland), seperti yang diterangkan dalam Menze et al. (2005). Pemalar pemisahan Ca2+ (nilai Kd) ditentukan menggunakan kit penentukuran Ca2+ yang sah dalam julat kepekatan 1–1000 µM; anggaran nilai Kd ialah 90–100 µM, dengan kebolehpercayaan yang tinggi, menurut data pengeluar kit. Aliquot (25µL) pecahan mitokondria (0.5mg protein/mL kepekatan akhir) dicampur dengan 25 µL penimbal pengeraman {100mM KCl dan 30mM MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]; pH7.2} dalam 96-plat mikrotiter hitam perigi. Campuran diinkubasi pada 25 darjah selama 15 minit; 25 µL digitonin (50 µg/mL) dan 25 µL Fluo-5N AM ester (1 µM dalam 0.005% (w/v) Pluronic F-127) kemudiannya ditambah. Dengan memudahkan resapan membran, digitonin mengantarkan kemasukan mitokondria pewarna pendarfluor. Kami mendapati bahawa tahap Fluo-5N dalam persediaan mitokondria jantung tikus meningkat 20-kali ganda dengan kehadiran digitonin. Campuran tindak balas diinkubasi pada 25 darjah selama 30 minit, dan bacaan pendarfluor diukur pada panjang gelombang pengujaan 488nm dan panjang gelombang pelepasan 532nm. Kandungan Ca mitokondria2+ dianggarkan menggunakan lengkung penentukuran dan dinyatakan sebagai protein µmol/mg.

Pengukuran potensi membran mitokondria

Potensi membran (ΔΨm) dinilai dengan kaedah yang diubah suai daripada Bonavita et al. (2003), menggunakan pewarna pendarfluor, probe kationik lipofilik 5,596,69- tetrachloro-1,193,39-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide, yang biasanya dipanggil JC-1. Aliquot (50 µL) pecahan mitokondria (dilaraskan kepada 1mg protein/mL) diinkubasi pada suhu 37 darjah dengan 50 µL larutan substrat (mengandungi 6mM piruvat dan 6mM malat), 25 µL larutan adenosin difosfat (ADP) yang telah dirawat (30mMM), dan 25 µL 3 µM JC-1, dalam gelap. Nilai ΔΨm diperoleh dengan mengukur pendarfluor pada 535nm (FL1) berbanding 580nm (FL2), menggunakan Victor2 MultiLabel Counter. JC-1 membentuk agregat dalam mitokondria, menghasilkan nilai pendarfluor FL2 yang tinggi dan menunjukkan potensi mitokondria normal. Kehilangan ΔΨm membawa kepada pengurangan dalam pendarfluor FL2 (JC-1 agregat ke tahap yang lebih rendah) dan peningkatan serentak dalam pendarfluor FL1 (daripada JC-1 monomer). Data dinyatakan sebagai nisbah nilai pendarfluor FL1/FL2. Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), agen ΔΨm-collapsing, digunakan untuk mengesahkan ujian.

Pengukuran respirasi mitokondria

Kadar respirasi mitokondria diukur pada 37 darjah menggunakan instrumen Hansatech Oxygraph-Plus yang dilengkapi dengan elektrod oksigen jenis Clark (Sarasota, FL, USA). Fraksi mitokondria (0.6mg protein/mL) digantung dalam penimbal respirasi yang mengandungi 125mM KCl, 20mM MOPS, 10mM Tris, 0.5mM etilena glikol tetraacetic acid (EGTA) dan 2mM KH2 PO4; pH 7.2. Selepas pengeraman pada 37 darjah selama 2 minit, setiap sampel menerima 50 µL larutan substrat (5mM piruvat dan 5mM malate). Kadar pernafasan diukur dengan kehadiran (Negeri 3) 1mM ADP dan selepas fosforilasi semua ADP kepada ATP (Negeri 4). Nisbah Kadar pernafasan Negeri 3:Negeri 4 ialah indeks kawalan pernafasan, yang menunjukkan ketatnya gandingan antara pernafasan dan fosforilasi (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Sebelum penambahan larutan substrat, kadar pernafasan Negeri 1 diukur sehingga permulaan pernafasan Keadaan 2, dan kadar pernafasan Negeri 2 dianggarkan sebelum penambahan ADP.

Analisis statistik

Data dianalisis dengan analisis varians sehala (ANOVA) untuk perbandingan berbilang kumpulan. Nilai perbezaan ketara terkecil (LSD) digunakan untuk mengenal pasti perbezaan ketara antara kedua-dua kumpulan apabila nilai p ialah < 0.05.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Keputusan

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1 dan 2, rawatan dengan metanolekstrak Herba Cistanche({{0}}}.5 atau 1.0g/kg/hari×3) secara ketara meningkatkan status glutation mitokondria dalam hati tikus, seperti yang dibuktikan oleh peningkatan bergantung dos dalam tahap GSH (11–30%) dan penurunan dalam Tahap GSSG (31%).

Rawatan Herba Cistanche bergantung kepada dos mengurangkan tahap Ca2+ mitokondria dalam hati tikus berbanding dengan kawalan; penindasan ialah 41% pada dos 1.0 g/kg (Rajah 3).

Rawatan Herba Cistanche meningkatkan mitokondria ΔΨm, seperti yang dibuktikan oleh penurunan (14-16%) dalam nisbah FL1 / FL2. CCCP (100 µM) menyebabkan ΔΨm runtuh, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan dalam nisbah FL1/FL2 (Rajah 4).

Rawatan Herba Cistancherespirasi mitokondria dipertingkatkan, seperti yang dibuktikan oleh kadar pernafasan State 3 yang lebih tinggi (84%) dalam haiwan ujian berbanding kawalan (Jadual 1). Tahap respirasi Negeri 2 dan Negeri 4 masing-masing meningkat sebanyak 47 dan 80%, tetapi rangsangan pernafasan Keadaan 4 telah ditindas sepenuhnya oleh 1mM guanosin-5'-difosfat, perencat uncoupling protein 2/3. Rawatan Herba Cistanche tidak menjejaskan indeks kawalan pernafasan, seperti yang dianggarkan oleh nisbah kadar pernafasan Negeri 3/Negeri 4.

Perbincangan

Mitokondria yang diasingkan daripada hati tikus yang dirawat Herba Cistanche menunjukkan status glutation yang dipertingkatkan, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan tahap GSH dan penurunan tahap GSSG. Pengekalan status redoks glutation mitokondria adalah penting untuk perlindungan kardio terhadap kecederaan I/R (Chiu & Ko, 2003). Kandungan Ca sitosolik2+ meningkat semasa iskemia miokardium, melalui pengambilan oleh membran dalam Ca2+ uniporter (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), membawa kepada Ca mitokondria{{6} } pengumpulan. Keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan dengan ekstrak Herba Cistanche meningkatkan status redoks glutathione mitokondria dan menurunkan paras Ca2+ mitokondria, yang mungkin memberi perlindungan terhadap kecederaan I/R miokardium (Leung, 2006). Ketidakupayaan rawatan Herba Cistanche, pada dos yang lebih tinggi iaitu 1.0 g/kg, untuk mengurangkan lagi tahap GSSG dan Ca{11}}, mungkin berkaitan dengan kewujudan mekanisme pengawalseliaan mengehadkan sendiri yang mempengaruhi potensi redoks glutation dan status kalsium dalam mitokondria.

Mitokondria menjana kecerunan proton elektrokimia merentasi membran dalam, melalui pengangkutan elektron. Kecerunan ini digunakan oleh ATP sintase untuk memfosforilasi ADP kepada ATP. Mengurangkan potensi membran mitokondria, seperti dalam hipoksia/reoksigenasi selepas kecederaan kardiomiosit berbudaya (Chiu et al., 2008), mengakibatkan pengurangan dalam penjanaan ATP. Rawatan Herba Cistanche, yang boleh meningkatkan potensi membran mitokondria miokardium, mungkin meningkatkan penjanaan ATP, terutamanya semasa reperfusi selepas iskemia. Sekali lagi, kewujudan mekanisme pengawalseliaan mengehadkan diri mungkin menjelaskan mengapa kesan rawatan Herba Cistanche pada potensi membran mitokondria tidak bergantung kepada dos.

Rawatan Herba Cistanche telah meningkatkan kadar pernafasan State 3 dalam mitokondria jantung tikus, seperti yang dinilai oleh penggunaan oksigen. Dapatan ini konsisten dengan keputusan yang diperoleh daripada pengukuran in vitro dan situ kapasiti penjanaan ATP mitokondria (Leung & Ko, 2008). Menariknya, walaupun rawatan Herba Cistanche mengurangkan tahap mantap ATP miokardium (data tidak ditunjukkan), rawatan itu meningkatkan penjanaan ATP mitokondria. Penglibatan pernafasan yang tidak bergandingan mungkin menjelaskan pemerhatian yang berbeza ini. Fosforilasi oksidatif tidak berganding berlaku apabila proton dialihkan merentasi membran dalam mitokondria kembali ke dalam matriks mitokondria, dengan itu melesapkan potensi membran yang dibentuk oleh rantai pengangkutan elektron. Ini mengakibatkan pengurangan daya motif proton yang mendorong pembentukan ATP (Garvey, 2003). Akibatnya, kepekatan Ca2+ dan pengeluaran ROS dalam mitokondria dilemahkan secara mendadak (Teshima et al., 2003). Cadangan ini konsisten dengan keputusan kajian ini, yang menunjukkan penurunan dalam paras Ca2+ mitokondria dalam hati yang dirawat Herba Cistanche. Berkenaan pernafasan tidak bergandingan, sintesis protein tidak bergandingan (UCP) mungkin disebabkan oleh rawatan Herba Cistanche. UCP dikenali untuk membongkar fosforilasi oksidatif, dan ekspresi UCP1 dalam hati tikus transgenik dilindungi daripada kerosakan miokardium yang disebabkan oleh I / R (Hoerter et al., 2004). Kesan uncoupling UCPs telah dihalang oleh purin nukleotida difosfat dan trifosfat (seperti ADP, ATP, guanosin difosfat (KDNK), dan GTP) (Echtay et al., 2002). Dalam kajian ini, parameter mitokondria seperti potensi membran dan kadar respirasi diukur dengan kehadiran ADP (sebagai substrat); Oleh itu, kesan uncoupling UCP telah dihalang. Walau bagaimanapun, apabila kadar respirasi State 4 mitokondria diukur tanpa ketiadaan ADP, kadar ini adalah lebih tinggi dalam mitokondria yang disediakan daripada hati yang dirawat Herba Cistanche berbanding dengan hati yang tidak dirawat. Kadar respirasi State 4 mencerminkan penggunaan oksigen oleh mitokondria apabila proton bocor semula ke dalam matriks mitokondria melalui mekanisme yang tidak melibatkan F1 F0 -ATPase (Garvey, 2003). Kemungkinan penglibatan UCP dalam peningkatan yang disebabkan oleh Herba Cistanche dalam pernafasan Negeri 4 disokong oleh penemuan bahawa peningkatan ini telah ditindas oleh KDNK (Bento et al., 2007).

Kesimpulannya, rawatan dengan Herba Cistanche boleh meningkatkan status glutation mitokondria, mengurangkan tahap Ca2+ mitokondria dan meningkatkan potensi membran mitokondria dan kadar pernafasan dalam hati tikus. Peningkatan status glutation mitokondria dan keupayaan berfungsi, dan induksi dugaan UCP, mungkin berkaitan dengan perlindungan kardio yang diberikan olehRawatan Herba Cistancheselepas kecederaan I/R.

EKSTRAK CISTANCHE TANAMAN ASLI TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%