Gomisin N Menghalang Melanogenesis Melalui Mengawal Laluan Isyarat PI3K/Akt Dan MAPK/ERK dalam Melanosit

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrak: Gomisin N, salah satu sebatian lignan yang terdapat dalam Schisandra Chinensis telah terbukti mempunyai aktiviti anti-oksidatif, anti-tumorigenik, dan anti-radang dalam pelbagai kajian. Di sini kami melaporkan, buat kali pertama, keberkesanan anti-melanogenik Gomisin N dalam mamalia sel serta dalam embrio ikan zebra. Gomisin N mengurangkan kandungan melanin dengan ketara tanpa ketoksikan selular. Walaupun ia tidak mampu memodulasi aktiviti pemangkin cendawantyrosinasedalam vitro,Gomisin Nmenurunkan tahap ekspresi protein utama yang berfungsi dalammelanogenesis. Gomisin N merendahkan reseptor melanocortin 1 (MC1R), adenilil siklase 2, faktor transkripsi berkaitan mikroftalmia (MITF), tyrosinase,tyrosinase-protein berkaitan-1(TRP-1), dan protein berkaitan tyrosinase-2 (TRP-2). Di samping itu, sel Melan-A yang dirawat Gomisin N menunjukkan peningkatan tahap p-Akt dan p-ERK, yang membayangkan bahawa pengaktifan laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK mungkin berfungsi untuk menghalangmelanogenesis. Kami juga mengesahkan bahawa Gomisin Nmengurangkan pengeluaran melanin dengan menindas ekspresi MITF,tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2dalam sel tetikus dan manusia serta dalam membangunkan embrio ikan zebra. Secara kolektif, kami membuat kesimpulan bahawaGomisin Nmenghalang sintesis melanin dengan menindas ekspresi MITF dan melanogenicenzymes, mungkin melalui modulasi laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK.

Kata kunci:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogenesis; pemutihan kulit

cistanche mempunyai fungsi pemutihan kulit

1. Pengenalan

Melanin adalah pigmen yang terdapat dalam kebanyakan organ haiwan termasuk kulit, rambut, mata, telinga dalam, tulang, jantung, dan otak [1,2].Melanogenesisadalah proses yang kompleks di mana pelbagai laluan isyarat terlibat. Reseptor melanocortin 1 (MC1R) ialah pengawal selia utama dalammelanogenesis, memberi isyarat melalui ligannya seperti melanocyte-stimulating hormone (MSH) dan adrenocorticotropic hormone(ACTH) [3]. Melanin kulit dibiosintesis oleh melanosit dalam epidermis dan kemudian dipindahkan ke keratinosit, di mana ia memainkan peranan penting dalam perlindungan kulit dengan menyerap sinaran UV daripada cahaya matahari dan menghilangkan radikal bebas reaktif [4,5]. Sintesis dan pemindahan melanin dalam kulit dan folikel rambut dikawal oleh ketersediaan prekursornya [6]. L-tirosin dan L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA), substrat utama enzim melanogenik, juga berfungsi sebagai pengawal selia seperti hormon dalam melanogenesis [7]. Sebaliknya, pengeluaran melanin yang berlebihan mengakibatkan masalah kulit yang tidak diingini seperti jeragat dan melasma [8,9]. Melanogenesis boleh menjejaskan tingkah laku melanosit normal dan malignan dengan memodulasi sifat keanjalan sel [10]. Walaupun reseptor untuk serotonin dan melatonin yang dinyatakan dalam sel kulit memainkan peranan penting dalam mengekalkan homeostasis selular, pengeluaran melanin yang berlebihan melalui perubahan hormon yang tidak terkawal boleh menyebabkan keadaan patologi pada kulit [11].

Oleh itu, terdapat usaha yang meluas untuk menjelaskan mekanisme molekul yang mengawal melanogenesis sebagai langkah utama untuk merawat gangguan kulit hiperpigmen. Selain itu, pelbagai jenispemutihan kulitagen yang menghalang sintesis melanin telah dikenal pasti daripada ekstrak tumbuhan dan bukan tumbuhan dan digunakan secara komersil dalam kosmeseutikal [12,13]. Ejen pemutihan yang paling banyak digunakan termasuk hydroquinone, mequinol, arbutin, asid Kojic, asid askorbik, dan retinoicacid [12,14]. Walau bagaimanapun, terdapat pelbagai batasan penggunaannya dalam merawat gejala hiperpigmentasi akut atau kronik pada manusia. Sebagai contoh, hidrokuinon, walaupun ia telah lama digunakan untuk depigmentasi sejak tahun 1960-an, boleh menyebabkan kerengsaan kulit dan dermatitis kontak [15,16]. Ia juga membawa kepada kerosakan DNA dengan meningkatkan pengeluaran spesies oksigen reaktif dan perkembangan ochronosis eksogen dalam sel mamalia [17,18]. Lain yang terkenaltyrosinaseperencat seperti asid Kojic dan asid askorbik bukan sahaja mempunyai penembusan kulit yang lemah, kestabilan, dan keberkesanan pemutihan tetapi juga boleh menyebabkan sitotoksisiti, dermatitis, dan eritema daripada penggunaan jangka panjang [19,20]. Dalam hal ini, terdapat keperluan yang semakin meningkat untuk membangunkan agen pemutih yang lebih selamat dan berkesan untuk merawat hiperpigmentasi kulit manusia. Herba semulajadi yang digunakan dalam perubatan tradisional mungkin menyediakan sumber alternatif untuk mengenal pasti agen pemutih baru yang mengawal langkah-langkah penting dalammelanogenesisdengan kurang atau tiada kesan sampingan [21].

Schisandra chinensis, juga dikenali sebagai beri rasa halus utara, secara semula jadi ditemui di timur laut China, timur jauh Rusia, Jepun, dan Korea [22]. Tumbuhan ini telah lama digunakan untuk rawatan rabun malam, kulit terbakar, keradangan aseptik, dan penyakit hati dalam perubatan oriental tradisional [23,24]. Ekstrak buah S. chinensis dan sebatian lignannya telah terbukti mempunyai pelbagai kesan farmakologi dalam garisan sel murine. Sebagai contoh, Schisandra A dan C mempunyai kesan anti-oksidatif, manakala Schisandra B mempunyai aktiviti anti-fibrotik, anti-radang, anti-oksidan, dan anti-apoptosis [25]. Satu lagi sebatian lignanGomisin N(Rajah 1A) telah dilaporkan dapat menekan apoptosis yang disebabkan oleh tekanan oksidatif dengan menghalang pembebasan sitokrom C daripada mitokondria ke sitoplasma, belahan caspase 3 dan PARP, dan peralihan kebolehtelapan mitokondria yang disebabkan oleh Ca2 dalam H9c2 kardiomiosit tikus [7,8]. Menariknya, beberapa kajian menggunakan model tetikus dan garisan sel kulit manusia telah mendedahkan potensi terapeutik S. chinensis untuk merawat gangguan kulit. Lee et al. melaporkan bahawa ekstrak metanol buah S. chinensis mengurangkan gejala dermatitis kontak dengan mengurangkan pengeluaran sitokin pro-radang seperti TNF- dan IFN- apabila digunakan secara topikal [8,24]. Kang et al. menunjukkan bahawa ekstrak air Schisandra Fructus menghalang pengaktifan IκB, dengan itu menyekat pengeluaran TNF- , IL-6 dan GM-CSF dalam garisan sel mast manusia HMC-1 [26]. Penemuan ini membawa kami membuat postulat bahawa S. chinensis lignans mungkin menjejaskan fungsi sel kulit secara lebih meluas. Dalam kajian ini, kami berusaha untuk menyiasat peranan yang didugaGomisin N, salah satu sebatian lignan utama dalam S. Chinensis, dalam mengawal seliamelanogenesis, dengan itu menilai potensi penggunaannya sebagai agen acosmeceutical. Di sini, kami melaporkannyaGomisin Nmenghalang biosintesis melanin tanpa ketoksikan selular dalam sel manusia dan tikus, serta dalam embrio ikan zebra.

2. Keputusan

2.1. Kesan Gomisin N terhadap Pembentukan Melanin dan Daya Tahan Sel

Untuk mengesahkan kesan Gomisin N padamelanogenesis, kami merawat melanosit tetikus dengan kepekatan yang berbezaGomisin Nselama 72 jam, dan kemudian menilai perubahan dalam kandungan melanin. Rawatan Gomisin mengurangkan kandungan melanin dalam kedua-dua garisan sel melanosit normal Melan-A dan dalam sel B16F10melanoma dalam cara yang bergantung kepada dos tanpa ketoksikan selular (Rajah 1B, C). Kami mendapati bahawa Gomisin N menghalang pengeluaran melanin yang disebabkan oleh MSH dalam sel B16F10, yang setanding dengan keputusan yang diperolehi oleh rawatan PTU [27] (Rajah 1C). Untuk menilai sama ada pengurangan melanin padaGomisin Nrawatan adalah disebabkan oleh penurunan aktiviti tyrosinase, kami melakukan ujian pewarnaan L-DOPA dalam sel melanosit epidermis manusia (NHEM) normal. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1E, sel NHEM yang dirawat dengan Gomisin N menunjukkan penurunan tahap L-DOPA berbanding dengan sel yang tidak dirawat. Walau bagaimanapun, kesan perencatan Gomisin N pada pengeluaran melanin tidak ketara dalam sel humanmelanoma MNT-1 (Rajah 1D) .

2.2. Kesan Gomisin N pada Aktiviti Tirosinase

Untuk meneliti sama adaGomisin Nmenghalangtyrosinaseaktiviti in vitro, kami menggunakan tyrosinase cendawan dan lisat sel melanoma B16. Asid kojic, perencat tyrosinase yang terkenal, digunakan sebagai kawalan positif. Apabila dirawat dengan tyrosinase cendawan, manakala asid Kojic mengurangkan aktiviti enzimatik dengan ketara, Gomisin N tidak menyebabkan sebarang perubahan dalam penukaran L-DOPA kepada dopachrome (Rajah 2A). Walau bagaimanapun, apabila dirawat dengan sel melanoma B16, Gomisin N mengakibatkan penurunan. dalamtyrosinaseaktiviti lisat sel dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 2B). Selain itu, apabila dirawat bersama dengan -MSH dalam sel B16,Gomisin Nmembalikkan peningkatan dalam pembentukan dopachrome yang dirangsang oleh -MSH (Rajah 3C). Terutama, Gomisin N kelihatan lebih berkesan daripada asid Kojic untuk menghalang selular.aktiviti tyrosinasesel B16 apabila rangsangan -MSH. Penemuan ini membayangkan bahawa kesan perencatan GomisinN pada pengeluaran melanin yang diperhatikan dalam sel tikus dan manusia (Rajah 1) tidak disebabkan oleh fungsinya untuk secara langsung menghalang aktiviti pemangkin tyrosinase. Walau bagaimanapun, masih ada kemungkinan bahawa Gomisin Nregulates ekspresi tyrosinase atau protein lain yang memainkan peranan penting dalammelanogenesis.

2.3. Kesan Gomisin N terhadap Penyahaktifan Laluan Isyarat MC1R

Kami berusaha untuk menjelaskan mekanisme asas yang bertanggungjawab terhadap kesan perencatan GomisinN pada pengeluaran melanin. Kami beralasan bahawaGomisin Nmungkin mengawal selia protein isyarat yang terlibat dalammelanogenesisdan dengan itu menghalang sintesis melanin. Reseptor Melanocortin 1 (MC1R) ialah reseptor berganding protein G amelanocytic yang berfungsi sebagai pengawal selia utama dalam sintesis melanin. Pengaktifan MC1R oleh ligan -MSH atau hormon adrenocorticotropic (ACTH) membawa kepada peningkatan dalam adenilil siklase, yang seterusnya meningkatkan tahap kem intraselular [2,3]. Akibatnya, tahap transkripsi MITF meningkat melalui laluan Protein kinase-C (PKA)/responsive element-bindingprotein (CREB) [2,28]. Untuk menilai kesan pengawalseliaan Gomisin N pada laluan isyarat MC1R, kami menyemak tahap ekspresi MC1R dan molekul isyarat hilirannya selepas merawat sel Melan-A dengan Gomisin N. Kami mendapati bahawa Gomisin N menurunkan kadar protein kedua-dua MC1R dan adenilil siklase 2 dengan ketara. dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 3A–C). Seperti yang dijangkakan,Gomisin Nsel yang dirawat juga mempamerkan penurunan tahap protein MITF dan sasaran yang diketahui tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2 (Rajah 3A, D–G). Penemuan ini mencadangkan bahawa Gomisin N menghalang enzim penghasil melanin dengan menyahaktifkan MITF melalui laluan isyarat MC1R.

2.4. Kesan Gomisin N pada Fosforilasi Akt dan ERK1/2 dalam Sel Melan-A

Laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK diketahui terlibat dalam melanogenesis secara transkripsi atau pasca transkripsi mengawal MITF [29,30]. Untuk menilai sama ada GomisinN menjejaskan laluan isyarat ini, kami menilai status fosforilasi Akt dan ERK1/2 oleh analisis blot Barat. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3H–J, rawatan dos tinggi (30 µM) daripadaGomisin Nmeningkatkan fosforilasi kedua-dua Akt dan ERK dengan ketara. Data ini menunjukkan bahawa kesan perencatan Gomisin N padamelanogenesisberkemungkinan dikaitkan dengan laluan P13K/Akt dan MAPK/ERK.

2.5. Gomisin N Menghalang Melanogenesis dalam Embrio Ikan Zebra

Kami seterusnya bertujuan untuk mengkaji sama ada Gomisin N berkesan dalam menghalangmelanogenesisdalam vivo. Untuk tujuan ini, kami merawat embrio ikan zebra dengan Gomisin N selama 72 jam pada kepekatan 1, 10, 20, dan 30 µM, dan kemudian mengukur tahap ekspresi protein melanogenik. Kami mendapati bahawa rawatan Gomisin N menghalang pembentukan melanin dalam membangunkan embrio ikan zebra.Gomisin N-embrio yang dirawat menunjukkan pengurangan kandungan melanin dalam cara yang bergantung kepada kepekatan berbanding dengan kawalan yang tidak dirawat (Rajah 4). Kami juga mendapati bahawa tahap proteintyrosinase, MITF, TRP-1 dan TRP-2 telah dikurangkan oleh rawatan Gomisin N (Rajah 5). Keputusan ini menunjukkan bahawa Gomisin N menghalang melanogenesis dalam vivo dengan mengawal selia faktor transkripsi MITF dan sasarannyatyrosinase, TRP-1 dan TRP-2.

2.6. Gomisin N membalikkan Melanogenesis yang disebabkan oleh Rapamycin dalam MNT Manusia-1

Walaupun Gomisin N menghalang dengan ketaramelanogenesisdalam sel Melan-A dan B16 serta embrio ikan inzebra, kami tidak melihat kesannya terhadap sel melanoma -1 MNT manusia. Kami menjangkakan bahawa kesan Gomisin N mungkin dapat dikesan dalam sel MNT-1 di bawah keadaan di mana melanogenesis dikawal oleh rangsangan yang sesuai. Rapamycin telah ditunjukkan untuk mendorong melanogenesis dengan meningkatkan aktiviti tyrosinase dan tahap protein MITF, tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2 [31], sebahagiannya melalui pengaktifan autophagy [32]. Kami memantau tahaptyrosinase, MITF,TRP-1 dan TRP-2 dalam sel MNT-1 melalui analisis Western blot, selepas rawatan bersama dengan Gomisin N andrapamycin. Rawatan Rapamycin secara ketara menyebabkan tahap MITF, TRP-1 dan TRP-2 tetapi tidak memberi kesan padatyrosinaseperingkat (Rajah 6). Walau bagaimanapun, rawatan Gomisin N telah membalikkan dengan ketara kesan rapamycin pada MITF, TRP-1 dan TRP-2 dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Kesan terbalik daripadaGomisin Nterhadap rapamycin adalah lebih menjanjikan pada kepekatan 20 dan 30 µM daripada 10 µM. Keputusan ini menunjukkan bahawa Gomisin N menghalangmelanogenesisdalam sel melanoma MNT-1 manusia dengan mengawal selia faktor transkripsi MITF dan sasarannya TRP-1 dan TRP-2.

3. Perbincangan

Fungsi utama melanin adalah untuk melindungi sel kulit daripada sinaran UV [33–35]. Hiperpigmentasi, hasil daripada pengeluaran berlebihan melanin dalam kulit, menyebabkan kebimbangan kosmetik yang tidak diingini dan dikaitkan dengan dermatitis dan kanser kulit. Beberapa laporan telah mencadangkanmelanogenesissebagai sasaran penting untuk merawat melanoma metastatik [36,37]. Oleh itu, terdapat peningkatan keperluan untuk membangunkan agen anti-melanogenik yang mengawal melanogenesis tanpa ketoksikan selular [38]. Terdapat beberapa laluan yang terlibat dalam melanogenesis kulit [39,40]. Selepas pengikatan ligan, MC1R meningkatkan aktiviti adenylyl cyclase, yang seterusnya meningkatkan tahap intrasel cAMP [41,42]. Pengaktifan laluan PKA/CREB yang bergantung kepada cAMP telah dilaporkan secara meluas untuk mengimbangi tahap transkrip MITF, dengan itu meningkatkan sintesis melanin [43]. MITF berfungsi sebagai pengawal selia induk bagi tiga enzim melanogenik utama tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2dalam vertebrata [3,21,44]. Enzim ini adalah protein transmembran yang terletak di dalam membran melanosomal melanosit. Tyrosinase mengawal langkah mengehadkan kadar masukmelanogenesisdengan menukar L-tyrosinase kepada L-DOPA [23]. TRP-1 dan TRP-2 juga memainkan peranan penting dalam sintesis melanin, walaupun fungsinya tidak difahami sepenuhnya.

Dalam kajian ini, Gomisin N, sebatian lignan S. chinensis menunjukkan aktiviti penyahpigmenan tanpa ketoksikan selular. Gomisin N menghalang sintesis melanin dalam garisan sel mamalia berbudaya serta dalam embrio ikan zebra. Gomisin N nampaknya lebih berkesan daripada kawalan positif PTU yang menghalang pengeluaran melanin dalam sel Melan-A (Rajah 1B). Gomisin N mengurangkan kandungan melanin dengan cara yang bergantung kepada kepekatan. Berbanding dengan kumpulan kawalan yang tidak dirawat, 10 µM daripadaGomisin Nmengurangkan kandungan melanin sebanyak kira-kira 40 peratus, tanpa ketoksikan selular. Aktiviti anti-melanogenik 10-µM Gomisin N adalah setanding dengan 100-µM PTU dalam sel Melan-A. Begitu juga, Gomisin Nampak lebih kuat daripada PTU dalam sel B16F10 yang diaktifkan -MSH, di mana kesan 5- dan10-µM Gomisin N adalah setanding dengan kesan 10- dan {{12 }}µM PTU, masing-masing (Rajah 1C). Sel NHEM yang dirawat dengan Gomisin N mempamerkan tahap pengurangan L-DOPA, yang menunjukkan bahawa GomisinN menghalangtyrosinaseaktiviti dalam sel berbudaya (Rajah 1E). Penemuan ini membawa kami untuk menyiasat lebih lanjut mekanisme asas yang mana Gomisin N menghalang melanogenesis.

Kami meneliti sama adaGomisin Nsecara langsung memodulasi aktiviti pemangkin bagityrosinasein vitro.Tidak seperti asid Kojic, Gomisin N tidak menunjukkan kesan perencatan pada aktiviti tyrosinase cendawan (Rajah 2A). Walau bagaimanapun, aktiviti tyrosinase selular dalam lisat sel melanoma B16 telah dikawal dengan ketara oleh Gomisin N dengan dan tanpa rawatan -MSH (Rajah 2B, C). Perencatan aktiviti tyrosinase selular Gomisin N apabila rangsangan -MSH didapati lebih ketara daripada kawalan positif asid Kojic (Rajah 2C).

Kami mengandaikan bahawa fungsi anti-melanogenik Gomisin N mungkin berlaku melalui regulasi transkrip atau post-transkrip bagi tyrosinase dan protein berkaitan tyrosinase (TRPs). Untuk mengesahkan ini, kami mengukur tahap ekspresi molekul isyarat dalam laluan MC1R, penentu utama untuk kuantiti dan kualiti penghasilan melanin dalam melanosit. Dijangka, kami mendapati bahawa Gomisin N mengurangkan tahap MC1R dan adenylyl cyclase 2 dalam sel Melan-A (Rajah 3A-C). Tambahan pula,Gomisin Nmengecilkan ekspresi MITF dan protein sasarannya termasuk tyrosinase, TRP-1 dan TRP-2 (Rajah 3A,D–G). Keputusan ini menunjukkan bahawa paras kandungan melanin yang berkurangan semasa rawatan Gomisin N terhasil daripada penyahaktifan laluan MC1R.

Sebaliknya, laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK boleh memfosforilasi MITF, dan dengan itu boleh memodulasi aktivitinya secara pasca-transkripsi [45]. Walau bagaimanapun, kesan keseluruhan pengaktifan laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK dalammelanogenesisadalah kontroversi. Kedua-dua laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK secara konstitutif diaktifkan dalam melanoma manusia disebabkan oleh mutasi terkumpul [46]. C2-depigmentasi pengantara seramida dalam sel Mel-Ab diketahui berlaku melalui pengurangan tahap p-Akt [47]. Terdapat beberapa sebatian semula jadi yang mengaktifkan melanogenesis dengan meningkatkan tahap p-ERK dalam sel melanoma B16 [28]. Sebaliknya, terdapat juga bukti bahawa paras p-ERK dan p-Akt yang tinggi menghalang sintesis melanin [28,48]. Inregulasi kerumitan melanogenesis boleh dijelaskan sebahagiannya oleh fakta bahawa fosforilasi meningkatkan aktiviti transkrip MITF, tetapi pada masa yang sama mendorong degradasi bergantung kepada ubiquition-proteosome MITF [26,49-51]. Data kami menunjukkan bahawa kedua-dua tahap p-Akt dan p-ERK telah dikawal selia dalam sel Melan-A yang dirawat Gomisin N (Rajah 3H-J). Ini menunjukkan bahawa laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK boleh menyumbang kepada perencatan pengeluaran melanin.

Kami selanjutnya mengesahkan aktiviti anti-melanogenik Gomisin N dalam ikan zebra dalam model vivo. Embrio ikan zebra yang dirawat Gomisin N menunjukkan pengurangan ketara dalam pigmentasi melanin (Rajah 4). Di samping itu, Gomisin N dengan ketara menurunkan tahaptyrosinase, MITF, TRP-1 dan TRP-2 dalam membangunkan embrio ikan zebra. Penemuan ini secara kolektif mencadangkan bahawaGomisin Nmendorong depigmentasi dengan merendahkan ekspresi MITF dan enzim melanogenik dalam vivo.Aktiviti anti-melanogenik Gomisin N telah disahkan selanjutnya dalam sel MNT-1 melanoma manusia yang dirangsang oleh rapamycin. Walaupun Gomisin N hanya menghasilkan perubahan kecil dalam kandungan melanin dalam sel MNT-1 (Rajah 1D), ia berkesan untuk membalikkan regulasi MITF, TRP-1 dan TRP-2 akibat rapamycin dalam cara yang bergantung kepada kepekatan (Rajah 6A, C–E). Diambil bersama, kesan pengawalseliaanGomisin Npada MITF dan enzim melanogenik didapati semula dalam sel tikus dan manusia serta dalam embrio ikan zebra.

Sebagai rumusan, karya ini menunjukkan bahawa Gomisin N mungkin mempunyai potensi tinggi sebagai novelpemutihan kulitejen. Gomisin N nampaknya menghalangmelanogenesisdengan menindas ekspresi MITF melalui laluan MC1R, dan bukannya secara langsung memodulasi aktiviti pemangkintyrosinasedan TRP. Walaupun mekanisme terperinci masih belum dijelaskan, depigmentasi yang disebabkan oleh Gomisin N mungkin dikaitkan dengan pengaktifan laluan PI3K/Akt dan MAPK/ERK (Rajah 7).

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan

RPMI1640 telah dibeli daripada Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). MediumEagle's modifiedEagle (DMEM), serum lembu janin (FBS), dan penicillin-streptomycin (PS) telah dibeli daripada Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Medium pertumbuhan melanosit telah dibeli daripada PromoCell(Heidelberg, Jerman). Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA), asid Kojic, 1-phenyl-2-thiourea (PTU), cendawan tyrosinase, 3,{{ 9}}dihydroxy-l-phenylalanine(L-DOPA), -MSH, dimethyl sulfoxide (DMSO), dan paraformaldehyde telah dibeli daripada SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA).Gomisin Nkompaun disediakan oleh Chul Young Kim (Universiti Hanyang, Ansan, Korea). Rapamycin dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat).

4.2. Kultur sel

Talian sel melanoma tetikus B16F10 telah disediakan dari Bank Talian Sel Korea (Seoul, Korea). Sel Melan-A Murine melanocyte [52] adalah hadiah yang murah hati daripada Dr. Byeong Gon Lee (Institut Penyelidikan Kulit, Amore Pacific Co., Yongin -si, Korea). Sel melanoma MNT{5}} manusia telah disediakan dengan murah hati oleh Aeyeong Lee (Kolaj Perubatan di Universiti Dongguk, Goyang-si, Korea). Melanosit epidermis manusia biasa primer (NHEM) telah dibeli daripada PromoCell (Heidelberg, Jerman). Sel Melan-A telah ditanam dalam medium RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) ditambah dengan 10 peratus FBS, 1 peratus PS, dan 200 nM TPA. DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS dan 1 peratus PS digunakan untuk mengekalkan sel Melan-A dan sel NHEM. Semua sel telah diinkubasi pada suhu 37 ◦C dalam inkubator CO2 5 peratus.

4.3. Pengukuran Kandungan Melanin

Sel Melan-A telah disemai dalam 24-plat perigi (1 × 105sel/telaga), dirawat denganGomisin N, dan kemudian diinkubasi selama 72 jam. Selepas 72 jam, kandungan melanin diukur seperti yang diterangkan sebelum ini [53]. Secara ringkas, selepas mengeluarkan media kultur, sel-sel telah dibasuh tiga kali dengan PBS. Selepas itu, larutan natrium hidroksida (1 mL, 1 N) ditambah ke dalam setiap perigi untuk melarutkan melanin. Penyerapan pada 405 nm diukur menggunakan pembaca plat mikro. Ujian ini diulang dengan sel B16F10(2 × 104sel/telaga) dan sel MNT{10}} mengikut kaedah yang sama.

4.4. Analisis Western Blot

Sel Melan-A telah disemai dalam hidangan 100 mm (1 × 106sel/hidangan) dan dirawat dengan 1, 5, atau 10 µMGomisin Nselama tiga hari pada suhu 37 ◦C. Sel telah dibasuh dengan PBS dan kemudian dituai menggunakan pengikis. Sel yang ditanggalkan dimasukkan ke dalam 1 ml PBS dan disentrifugasi pada 7500 rpm selama 5 minit. Selepas mengalih keluar penyelesaian atas, pelet sel telah dilisiskan dengan penimbal lisis (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 peratus SDS, 150 mM NaCl,1 peratus NP-40, 0.02 peratus natrium azida, 0.5 peratus natrium deoksikolat, 100 µg/mL PMSF, 1 g/mL aprotinin) selama 24 jam pada suhu 4 ◦C. Jumlah protein telah diekstrak menggunakan ultracentrifuge pada 12,000 rpm selama 30 minit pada 4◦C. Kandungan protein diukur menggunakan ujian Bradford. Protein (30 µg) diasingkan menggunakan gel elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) 10 peratus dan dipindahkan ke membran anitroselulosa. Membran telah disekat selama 1 jam dengan susu skim 5 peratus dalam garam Tris-buffered dengan Tween-20 (TBST), dan kemudian diinkubasi selama 12 jam pada suhu 4 ◦C dengan antibodi primer yang menyasarkan -tubulin(Santa Cruz, CA, USA ), MITF (Isyarat Sel, Danvers, MA, Amerika Syarikat), tyrosinase (Isyarat Sel), ERK(Isyarat Sel), phospho-ERK (Isyarat Sel), AKT (Isyarat Sel), phospho-AKT (Isyarat Sel), MC1R ( Santa Cruz), adenylyl cyclase 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) dan TRP-2 (Santa Cruz). Selepas mengeluarkan antibodi primer, membran dibasuh tiga kali dengan TBST dan diinkubasi dengan sekunder antibodi (IgG-HRP anti-kambing arnab; HRP anti-arnab tikus, Santa Cruz) selama 1 jam. Membran telah dirawat dengan reagen chemiluminescence yang dipertingkatkan menggunakan sistem pengimejan ChemiDoc XRS plus (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Analisis densitometri jalur telah dilakukan menggunakan perisian Image MasterTM 2D Elite (versi 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, Amerika Syarikat).

4.5. Ujian Aktiviti Tirosinase

Untuk menganggarkan kesan perencatan Gomisin N pada cendawantyrosinaseaktiviti, tyrosinase diinkubasi dengan 1, 5, atau 10 µMGomisin Natau kawalan positif asid Kojic. Setiap sampel dilarutkan dalam metanol. L-DOPA (8.3 mM) dan cendawan tyrosinase (125 U) telah dicairkan dalam 80 mM phosphatebuffer (pH 6.8). 40 µL setiap sampel dan 120 µL L-DOPA dicampur dalam 96-plat perigi, diikuti dengan penambahan 40 µL cendawan tirosinase cair. Plat kemudian diinkubasi selama 15 minit, dan penyerapan diukur pada 490 nm menggunakan pembaca plat mikro.

Tirosinaseaktiviti dalam lisat sel melanoma B16 diukur dengan atau tanpa rawatan -MSH, seperti yang diterangkan sebelum ini oleh Ohguchi et al. [54], dengan sedikit pengubahsuaian. Lisat sel telah disediakan seperti yang dinyatakan di atas dalam bahagian analisis Western Blot. Jumlah protein dalam supernatan diukur oleh ujian Bradford menggunakan Bovine Serum Albumin sebagai standard [55]. Jumlah protein yang sama telah dicairkan dan digunakan untuk ujian aktiviti tyrosinase.

menghalang aktiviti tyrosinase

4.6. Pewarnaan L-DOPA dalam Sel NHEM

Sel NHEM telah disemai dalam plat perigi {{0}} dan diinkubasi selama 72 jam dengan Gomisin N. Sel telah difiksasi dengan 4 peratus paraformaldehid selama 40 min, diikuti dengan rawatan dengan 0.1 peratus Triton X{ {6}} selama 2 min.L-DOPA (0.1 peratus ) ditambahkan pada setiap telaga, diikuti dengan pengeraman selama 2 jam. Selepas mengeluarkan larutan, sel-sel telah dibasuh dua kali dengan PBS. Imej diambil dengan mikroskop.

4.7. Eksperimen Ikan Zebra

Embrio ikan zebra diperoleh daripada Bank Sumber Zebrafish (Daegu, Korea). Embrio dirawat dengan Gomisin N selama 72 jam. Kesan depigmentasi daripadaGomisin Npada embrio ikan zebra diperhatikan di bawah stereomikroskop. Untuk analisis Western blot, embrio yang dirawat Gomisin N telah dilisiskan menggunakan penimbal lisis, dari mana jumlah protein disediakan seperti yang dinyatakan di atas.

5. Kesimpulan

Keputusan kami menyokong pandangan bahawa Gomisin N mempunyai potensi tinggi untuk digunakan sebagai makanan berfungsi danpemutihan kulitejen.Gomisin Nadalah salah satu sebatian lignan utama dalam S. Chinensis. Malah, S. Chinensis adalah ubat herba yang digunakan untuk menyembuhkan banyak penyakit manusia. Walau bagaimanapun, kajian epidemiologi lanjut diperlukan untuk membuktikan keselamatan Gomisin N pada kulit. Oleh itu, kajian in vivo dan ujian klinikal akan dapat menunjukkan dengan lebih jelas keberkesanan GomisinN. Kesimpulannya, kajian ini mencadangkan bahawaGomisin Nmungkin agen hipopigmen yang berpotensi dan semula jadipemutihan kulitcalon industri kosmetik.

cistanche meningkatkan pemutihan

Rujukan

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Kesan ukuran melanin epidermis pada warna kulit manusia. Sel Pigmen Sel. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Laluan Isyarat dalam Melanogenesis. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melanin pigmentasi dalam kulit mamalia dan peraturan hormonnya. Fisiol. Wahyu 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Peranan melanin sebagai pelindung terhadap radikal bebas dalam kulit dan peranannya sebagai penunjuk radikal bebas dalam rambut. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipinak, J.; Slominski, AT Kandungan melanin dalam melanomametastases menjejaskan hasil radioterapi. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentasi folikel rambut.J. Menyiasat. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirosin, dan L-dihydroxyphenylalanine sebagai pengatur seperti hormon bagi fungsi melanosit. Sel Pigmen Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Kemajuan terkini dalam patogenesis melasma. Sel Pigmen Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. Biologi sindrom hiperpigmentasi. Sel Pigmen Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT Peranan pigmen melanin dalam melanoma. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Sistem serotoninergik/melatonergik kulit: Mengamankan tempat di bawah matahari. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals untuk Hiperpigmentasi: Apakah yang Tersedia? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.;Passeron, T.; Choi, W.; et al. Peraturan pigmentasi kulit manusia dan tindak balas kepada sinaran ultraungu.Pigmen Sel Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Postinflammatory hyperpigmentation: Kajian semula epidemiologi, ciri klinikal, dan pilihan rawatan dalam kulit berwarna. J. Clin. Estet. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR Gambaran keseluruhan kesan modulasi asid oleik dalam kesihatan dan penyakit. Mini. Rev. Med. Kimia. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Tinjauan dan mekanisme depigmentasi kulit dan agen pencerah. Phytother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. genotoksisiti akibat hidrokuinon dan kerosakan DNA oksidatif dalam sel HepG2. Kimia. biol. Berinteraksi. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hydroquinone: Pencemaran alam sekitar, ketoksikan dan jawapan mikrob.BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Persediaan pencerahan kulit dan kontroversi hidrokuinon. Dermatol. Di sana. 2007, 20,308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Minyak evening primrose yang disabun mengurangkan melanogenesis dalam sel melanoma B16 dan mengurangkan pigmentasi kulit akibat UV pada manusia. Lipid 2010,45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Produk semulajadi dan perubatan tradisional: Menghidupkan paradigma. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Farmakologi Schisandra Chinensis Bail: Gambaran keseluruhan penyelidikan dan kegunaan Rusia dalam bidang perubatan. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Kesan bermanfaat Schisandrin B pada fungsi jantung dalam model tikus infarksi miokardium. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Kesan SchisandraChinensis Turcz. buah pada dermatitis kontak yang disebabkan oleh dinitrofluorobenzene pada tikus. Mol. Med. Laporan 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Jadi saya.; Jeon, JH Kesan perlindungan ekstrak buah Schisandra Chinensis dan lignannya terhadap penyakit kardiovaskular: Kajian semula mekanisme molekul. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Taman, PS; Cho, SH; Lee, GH; Jadi, HY; Choo, YK;Kweon, OH; et al. Kesan ekstrak air Schisandra Fructus pada pembebasan sitokin daripada garisan sel tiang manusia. J. Med. Makanan 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Perencatan pengeluaran mikronukleus yang disebabkan oleh L-tirosin oleh phenylthiourea dalam sel melanoma manusia. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Melanogenesis-pengaruh kesan cirsimaritin melalui peningkatan dalam faktor transkripsi dan tyrosinaseexpression yang berkaitan dengan mikroftalmia. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmediates pengaktifan bergantung kepada kem kinase dikawal isyarat ekstraselular (ERK) dalam melanosit.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Cyclic AMP pembawa pesan utama dalam pengawalan pigmentasi kulit. Sel Pigmen Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Induksi melanogenesis oleh rapamycin dalam sel melanoma MNT{1}} manusia. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Rantaian protein 3 yang berkaitan dengan Microtubule terlibat dalam melanogenesis melalui pengawalan ekspresi MITF dalam melanosit. Sci. Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Pendengaran, VJ, Jr. Gangguan genetik pigmentasi. Adv. Hum. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Sapu, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -hormon perangsang melanosit menyekat tekanan oksidatif melalui ap53-laluan isyarat pengantara dalam melanosit manusia. Mol. Kanser Re. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomes sekilas pandang. J. Sel Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogenesis menjejaskan keseluruhan dan kelangsungan hidup tanpa penyakit pada pesakit dengan melanoma peringkat III dan IV. Hum. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.;Seagroves, TN Peranan melanogenesis dalam pengawalan tingkah laku melanoma: Melanogenesis membawa kepada rangsangan ekspresi HIF-1 dan laluan atendan yang bergantung kepada HIF. Gerbang. Biokim. Biophys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Kesan perencatan Gastrodia elata extracton melanogenesis dalam sel melanoma HM3KO. J. Kosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Harga, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kinase menghubungkan faktor transkripsiMicrophthalmia kepada isyarat c-Kit dalam melanosit. Alam 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Harga, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, Isyarat khusus DELlineage dalam melanosit. Rangsangan C-kit merekrut p300/CBP kepada microphthalmia.J. biol. Kimia. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, produk R. Microphthalmiagene sebagai transduser isyarat dalam pembezaan melanosit yang disebabkan oleh cAMP. J. Biol Sel. 1998, 142,827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.;Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Dimerisasi zip leucine terhad dan kekhususan pengiktirafan DNA terhadap pengawal selia induk melanosit MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Daripada gen kepada ubat: Strategi yang disasarkan untuk melanoma. Nat. Rev. Kanser2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Kesan perencatan resveratrol pada sintesis melanin dalam pigmentasi yang disebabkan oleh ultravioletB dalam kulit babi Guinea. Biomol. Di sana. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Perencatan melanogenesis oleh asid gallik: Kemungkinan penglibatan laluan isyarat PI3K/Akt, MEK/ERK dan Wnt/ -catenin dalam sel B16F10. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.;Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. Isyarat RAS/RAF/MEK/ERK dan PI3K/PTEN/AKT dalam Perkembangan dan Terapi Melanoma Malignant. Dermatol. Res. Berlatih. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Bulan, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramide menghalang pembiakan sel melalui penyahaktifan AKT/PKB dan mengurangkan sintesis melanin dalam sel Mel-Ab. Pigmen Sel Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, ENCIK; Kwon, HJ; Lee, CHMengurangkan regulasi sintesis melanin dengan mempunyai A dan aplikasinya pada model kilat in vivo. J.Menyiasat. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF dalam melanoma: Mekanisme di sebalik ekspresi dan aktivitinya. Sel Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC Sphingosine-1-fosfat mengurangkan sintesis melanin melalui pengaktifan ERK yang berterusan dan degradasi MITF yang seterusnya. J. Sel Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Yeh, ET; Medrano, EE Peraturan faktor transkripsi yang berkaitan dengan mikroftalmia tahap protein MITF dengan persatuan dengan enzim pengkonjugasi theubiquitin hUBC9. Exp. Sel Re. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Barisan melanosit tikus bukan tumorigenik, syngeneik dengan melanoma B16 dan memerlukan penganjur tumor untuk pertumbuhan. Int. J. Kanser 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogenesis menghalang pernafasan dalam sel B16-F10melanoma manakala meningkatkan kandungan sel mitokondria. Exp. Sel Re. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol sebagai perencat potenttyrosinase daripada genus Gnetum. Biosci. Bioteknol. Biokim. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Perencatan aktiviti tyrosinase dan pigmentasi melanine oleh2-hydroxytyrosol. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]