Echinacoside Rb1 Melemahkan Kemerosotan Vaskular Berkaitan Umur Dengan Memodulasi Laluan Gas6
Apr 04, 2023
ABSTRAK
Konteks:EchinacosideRb1 (Rb1) memberikan banyak kesan yang bermanfaat dan melindungi daripada penyakit kardiovaskular.
Objektif: Untuk menyiasat sama ada Rb1 boleh melemahkan kerosakan vaskular yang berkaitan dengan usia dan mengenal pasti mekanismenya. Bahan dan kaedah: Tikus betina C57BL/6J berumur 2 dan 18 bulan, secara rawak diberikan kepada kumpulan Muda, Muda 20 mg/kg Rb1, kenderaan Lama, Tua 10 mg/kg Rb1 dan kumpulan Tua 20 mg/kg Rb1, adalah setiap hari. intraperitoneal disuntik dengan kenderaan atau Rb1 selama 3 bulan. Segmen aorta toraks digunakan untuk memeriksa vasorelaxation yang bergantung kepada endothelium. Tisu aorta toraks kiri dikumpulkan untuk analisis ekspresi histologi atau molekul, termasuk protein yang berkaitan dengan penuaan, penanda yang berkaitan dengan kalsifikasi dan fibrosis, dan ekspresi Gas6/Axl.
Keputusan: Kami mendapati bahawa dalam kumpulan kenderaan Oldþ, ekspresi protein penuaan dan molekul lekatan selular meningkat dengan ketara, dengan kelonggaran aorta toraks yang bergantung kepada endothelium (58.35 peratus ± 2.50 peratus) berbanding kumpulan Muda (88.84 peratus ± 1.20 peratus). ). Walau bagaimanapun, rawatan Rb1 dengan ketara mengurangkan tahap ekspresi protein ini dan mengekalkan kelonggaran yang bergantung kepada endothelium pada tikus tua. Selain itu, rawatan Rb1 juga mengurangkan pemendapan kalsium, pemendapan kolagen, dan tahap ekspresi protein kolagen I dan kolagen III pada tikus tua. Tambahan pula, kami mendapati bahawa penurunan regulasi ekspresi protein Gas6 sebanyak 41.72 peratus dan ekspresi mRNA sebanyak 52.73 peratus pada tikus tua berbanding dengan tikus muda telah dimansuhkan oleh rawatan Rb1. Tetapi tidak terdapat perbezaan yang signifikan pada ekspresi Axl di kalangan kumpulan.
Kesimpulan: Kajian kami mengesahkan bahawa Rb1 boleh memperbaiki kecederaan vaskular, menunjukkan bahawa Rb1 mungkin berpotensiagen kerosakan vaskular berkaitan anti-penuaan.
Beli Cistanche Kaya Dengan Echinacoside
pengenalan
Dalam tempoh 30 tahun akan datang di China, terdapat peningkatan anggaran daripada 12.6 peratus kepada 26 peratus orang dewasa berumur 65 tahun ke atas (Zhou dan Walker 2021). Walaupun jangka hayat manusia semakin meningkat, penyakit berkaitan usia terus menjadi topik yang membimbangkan.Penyakit jantungadalahpenyakit yang paling biasayang menjejaskan individu warga emas.Penuaan vaskulardisertai dengan perubahan struktur dan fungsi vaskular adalah faktor risiko bebas yang penting untukpenyakit jantung(Lakatta dan Levy 2003). Tinjauan epidemiologi telah menunjukkan bahawa 82 peratus pesakit yang meninggal dunia akibat penyakit kardiovaskular berumur 65 tahun atau lebih (Moslehi et al. 2012). Oleh itu, meneroka mekanisme kerosakan vaskular yang berkaitan dengan usia dan mencari agen yang boleh melindungi fungsi vaskular terhadap penurunan berkaitan usia mungkin memainkan peranan penting dalam mengurangkan kejadian dan kelaziman gangguan kardiovaskular yang berkaitan dengan usia dalam individu warga tua.
Penuaan arteri telah terlibat dalam patogenesis disfungsi vaskular dan pelbagai penyakit kardiovaskular dan merupakan ciri penuaan (Minamino dan Komuro 2007). Perubahan vaskular akibat penuaan berbeza-beza dan termasuk disfungsi endothelial, hipertrofi sel otot licin vaskular (VSMC), dilatasi arteri, penyusunan semula matriks ekstraselular (ECM), kalsifikasi vaskular, dan peningkatan nisbah kolagen-ke-elastin dengan pemecahan. dan kekejangan vaskular (Tolle et al. 2015). Brandes et al. (2005) melaporkan bahawa disfungsi endothelial yang berkaitan dengan usia biasanya dicirikan oleh ketidakseimbangan dalam faktor kelonggaran dan kontraktil yang berasal dari endothelium. Kajian lanjut oleh Herrera et al. (2010) juga menunjukkan bahawa disfungsi endothelial berkait rapat dengan penurunan progresif dalam vasodilatasi yang bergantung kepada endothelium. Walau bagaimanapun, masih tidak jelas bagaimana penuaan mempengaruhi vasodilatasi atau mencetuskan ketidakseimbangan dalam faktor yang berkaitan dan akhirnya membawa kepada disfungsi vaskular. Acosta et al. (2008) menunjukkan bahawa sel vaskular yang mengalami penuaan boleh menghasilkan molekul lekatan, termasuk plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1), protein lekatan sel vaskular 1 (VCAM-1), dan molekul lekatan sel antara sel{{ 14}} (ICAM-1). Kesemua molekul lekatan ini dianggap memainkan peranan penting dalam pengambilan monosit ke tapak aterosklerotik dan kemudian memulakan pembentukan semula vaskular, akhirnya mengakibatkan pengurangan pematuhan dan peningkatan kekakuan (Acosta et al. 2008; Kovacic et al. 2011). Kekakuan vaskular adalah manifestasi paling penting dari penuaan vaskular. Ia dikaitkan dengan pembentukan semula ECM dan menyumbang kepada penurunan vasodilatasi. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa kekakuan vaskular dan penuaan VSMC dikaitkan dengan kalsifikasi medial dan pemendapan kolagen (Mauriello et al. 1992; McClelland et al. 2006; Nakano-Kurimoto et al. 2009; Wendorff et al. 2015; 20 Kim et al. ). Oleh itu, disfungsi vasodilatasi mungkin disebabkan oleh kalsifikasi dan fibrosis. Mengurangkan pemendapan kalsium atau kolagen boleh melambatkan kerosakan arteri yang berkaitan dengan penuaan.
EchinacosideRb1 (Rb1) adalah salah satu komponen aktif yang terdapat dalam ginseng. Penyelidikan telah melaporkan bahawa Rb1 mempunyai banyak kesan antisenescence dan anti-apoptosis yang bermanfaat, terutamanya dalam melindungi miokardium dan endothelium (Zheng et al. 2017; Zhou et al. 2017; Zheng et al. 2020). Kajian terbaru telah menunjukkan bahawa Rb1 boleh mengurangkan kalsifikasi vaskular yang berkaitan dengan penyakit buah pinggang kronik dan ekspresi kolagen jenis I dalam tikus (Zhou et al. 2019b). Dapatan juga mencadangkan bahawa Rb1 mengurangkan ekspresi kolagen jenis I (Kwok et al. 2012). Walau bagaimanapun, kesan Rb1 pada kerosakan vaskular yang berkaitan dengan usia belum disiasat.
Telah dilaporkan bahawa Rb1 menghalang kalsifikasi vaskular melalui transaktivasi gen 6 (Gas6) khusus penangkapan pertumbuhan secara in vitro (Nanao-Hamai et al. 2019). Gas6, ahli keluarga protein yang bergantung kepada vitamin K, terlibat dalam pengawalan pelbagai fungsi selular selepas mengikat reseptornya Axl, reseptor membran tyrosine kinase (Nakano et al. 1997; Fridell et al. 1998; Yanagita et al. . 2001). Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa laluan Gas6/Axl memainkan peranan penting dalam biologi vaskular dan penyakit seperti kalsifikasi vaskular pembentukan semula vaskular ling dan aterosklerosis (Korshunov et al. 2006; Hurtado et al. 2010; Son et al. 2010). Kami membuat hipotesis bahawa Rb1 boleh melemahkan kerosakan vaskular yang berkaitan dengan usia dengan menekan kalsifikasi dan fibrosis, yang berpotensi dikaitkan dengan peraturan laluan Gas6/Axl.
Bahan dan kaedah
Reagen eksperimen
Rb1 (ketulenan lebih daripada 98 peratus ) diperoleh daripada Victory (Sichuan, China). Antibodi terhadap p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) dan GAPDH (ab181603) telah dibeli daripada Abcam (MA, Amerika Syarikat). Antibodi terhadap kolagen I (14695), kolagen III (22734), dan Axl (13196) dibeli daripada Proteintech Group (MA, USA). Antibodi terhadap Gas6 (A8545) dan p16INK4a (A0262) telah dibeli daripada ABclonal Technology (Hubei, China). Penampan Krebs-Henseleit (KH) yang diubah suai, phenylephrine (vasoconstrictor yang kuat) dan asetilkolin (Ach, penderma NO yang bergantung kepada endothelial) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (MO, Amerika Syarikat). Semua reagen lain yang digunakan adalah gred analitik.
Haiwan dan pengurusan
Kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC) Universiti Sun Yat-Sen. Kebanyakan kajian panjang umur telah menunjukkan kesan ke atas wanita (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); Oleh itu, kami melakukan kajian jangka panjang menggunakan tikus betina. Tikus betina C57BL/6J berumur 2 dan 18 bulan diperoleh dari Pusat Haiwan Eksperimen, Universiti Sun Yat-Sen. Tikus diberi makanan biasa dan ditempatkan di bawah keadaan terkawal (24 ± 2 C dan 50 ± 5 peratus kelembapan) dengan 12 jam fotokala cahaya/gelap di bawah keadaan bebas patogen tertentu. 40 ekor tikus C57BL/6J betina muda pada usia 2 bulan telah ditugaskan secara rawak kepada kumpulan Muda dan Muda þ 20 mg/kg Rb1 (Muda þ Rb1-20) (n ¼ 20 setiap satu). Tikus-tikus ini dirawat dengan suntikan intraperitoneal harian kenderaan (larutan garam steril) atau 20 mg/kg Rb1 yang dilarutkan dalam kenderaan selama 3 bulan sebelum euthanasia oleh sesak nafas CO2 pada usia 5 bulan. 60 ekor tikus C57BL/6J betina berumur 18 bulan secara rawak diberikan kepada kenderaan þ Lama, Lama þ 10 mg/kg Rb1 (Lama þ Rb1-10) dan Lama þ 20 mg/kg Rb1 (Lama þ Rb 1-20) kumpulan (n ¼ 20 setiap satu). Tikus yang terselamat sehingga akhir eksperimen ini menerima suntikan intraperitoneal harian kenderaan sahaja atau Rb1 (10 atau 20 mg/kg) selama 3 bulan, selepas itu tikus dieutanasi pada usia 21 bulan. Percubaan telah diulang sekurang-kurangnya tiga kali dengan 4-5 tikus bagi setiap kumpulan.
Bahan dan kaedah Reagen eksperimen
Rb1 (ketulenan lebih daripada 98 peratus ) diperoleh daripada Victory (Sichuan, China). Antibodi terhadap p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) dan GAPDH (ab181603) telah dibeli daripada Abcam (MA, Amerika Syarikat). Antibodi terhadap kolagen I (14695), kolagen III (22734) dan Axl (13196) dibeli daripada Proteintech Group (MA, USA). Antibodi terhadap Gas6 (A8545) dan p16INK4a (A0262) telah dibeli daripada ABclonal Technology (Hubei, China). Penampan Krebs-Henseleit (KH) yang diubah suai, phenylephrine (vasoconstrictor yang kuat) dan asetilkolin (Ach, penderma NO yang bergantung kepada endothelial) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (MO, Amerika Syarikat). Semua reagen lain yang digunakan adalah gred analitik.
Haiwan dan pengurusan
Kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC) Universiti Sun Yat-Sen. Kebanyakan kajian panjang umur telah menunjukkan kesan ke atas wanita (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); Oleh itu, kami melakukan kajian jangka panjang menggunakan tikus betina. Tikus betina C57BL/6J berumur 2 dan 18 bulan diperoleh dari Pusat Haiwan Eksperimen, Universiti Sun Yat-Sen. Tikus diberi makanan biasa dan ditempatkan di bawah keadaan terkawal (24 ± 2 C dan 50 ± 5 peratus kelembapan) dengan 12 jam fotokala cahaya/gelap di bawah keadaan bebas patogen tertentu. 40 ekor tikus C57BL/6J betina muda pada usia 2 bulan telah ditugaskan secara rawak kepada kumpulan Muda dan Muda þ 20 mg/kg Rb1 (Muda þ Rb1-20) (n ¼ 20 setiap satu). Tikus-tikus ini dirawat dengan suntikan intraperitoneal harian kenderaan (larutan garam steril) atau 20 mg/kg Rb1 yang dilarutkan dalam kenderaan selama 3 bulan sebelum euthanasia oleh sesak nafas CO2 pada usia 5 bulan. 60 ekor tikus C57BL/6J betina berumur 18 bulan secara rawak diberikan kepada kenderaan þ Lama, Lama þ 10 mg/kg Rb1 (Lama þ Rb1-10) dan Lama þ 20 mg/kg Rb1 (Lama þ Rb 1-20) kumpulan (n ¼ 20 setiap satu). Tikus yang terselamat sehingga akhir eksperimen ini menerima suntikan intraperitoneal harian kenderaan sahaja atau Rb1 (10 atau 20 mg/kg) selama 3 bulan, selepas itu tikus dieutanasi pada usia 21 bulan. Percubaan telah diulang sekurang-kurangnya tiga kali dengan 4-5 tikus bagi setiap kumpulan.
Penentuan vasorelaxation dalam cincin aorta toraks
Selepas haiwan itu dieuthanasikan, cincin aorta toraks dikeluarkan dengan cepat dan diletakkan dalam larutan penimbal KH sejuk (118 mmol/L NaCl, 4.75 mmol/L KCl, 25 mmol/L NaHCO3, 1.18, mmol/L MgSO4 1. 18 mmol/L KH2PO4, 2.54 mmol/L CaCl2, dan 11.1 mmol/L glukosa), dan lemak dan tisu di sekelilingnya telah didebrid dengan teliti. Panjang cincin aorta adalah kira-kira 3 mm. Segmen aorta digantung pada cangkuk keluli tahan karat, diudara dalam penimbal KH dan terus dioksigenkan dengan 95 peratus O2 pada 37 C. Gelang aorta kemudiannya disambungkan kepada transduser daya FORT{22}} untuk pemerolehan data MacLab. Ketegangan pasif awal dalam cincin aorta ditetapkan sebagai 3 mN selama 30 minit untuk mencapai kestabilan cincin kapal sebelum percubaan selanjutnya. Penampan KH diganti setiap 10 minit. Phenylephrine telah ditambah ke dalam mandian tisu pada kepekatan 10 5 mol/L untuk menyebabkan vasoconstriction. Selepas mencapai kestabilan gelang kapal, Ach vasorelaxant (10 9 –10 5 mol/L) telah ditambah ke dalam mandian tisu secara berturut-turut untuk mendapatkan keluk tindak balas dos. Kelonggaran pada setiap kepekatan diukur dan dinyatakan sebagai peratusan daya yang dijana sebagai tindak balas kepada phenylephrine.
Imunohistokimia
Tisu aorta toraks telah ditetapkan dalam formalin, dehidrasi, tertanam dalam parafin, dan dipotong menjadi keratan rentas 4 lm. Bahagian ini diinkubasi dalam penimbal sitrat (pH 6.0) dan dipanaskan selama 10 minit dua kali selepas menjalani penyahparafinan dan penghidratan semula. Serum kambing (10 peratus ) (Gibco, BRL, NY, USA) digunakan untuk menyekat pengikatan tidak spesifik selama 1 jam pada suhu 37 C, diikuti dengan inkubasi semalaman dengan antibodi primer terhadap p21Cip1 (1:1000) dan p16INK4a (1:200). ) pada 4 C dalam kotak lembap. Selepas tiga kali cucian dalam PBS, antibodi sekunder konjugasi (Abcam) lobak pedas peroksidase (HRP) telah ditambah dan diinkubasi selama 60 minit pada suhu 37 C, diikuti dengan pewarnaan diaminobenzidine (1:100, Abcam). Haematoxylin digunakan untuk mengimbangi nukleus sel. Bahagian itu ditutup dengan gusi neutral dan difoto di bawah mikroskop Zeiss.
Pewarnaan Haematoxylin-eosin (HE).
Bahagian aorta toraks tertanam parafin telah diwarnai oleh hematoxylin selama 2 minit. Selepas mencuci dan merawat dengan alkohol berasid 1 peratus, bahagian tersebut dirawat dengan pewarnaan eosin selama 3 minit. Selepas itu, bahagian itu dibasuh, didehidrasi, dan dirawat dengan xilena sebelum pemerhatian mikroskopik. Bahagian aorta toraks diambil gambar di bawah mikroskop Zeiss.
Pewarnaan trichrome Masson
Bahagian aorta toraks tertanam parafin telah diwarnakan dalam hematoksilin besi Weigert selama 10 minit selepas menjalani deparafinisasi dan rehidrasi dan kemudian dibasuh dengan PBS selama 5 minit. Tisu kemudian diwarnakan dalam larutan fuchsin asid merah Biebrich selama 5 minit dan dibasuh dalam air suling. Bahagian tersebut kemudiannya mengalami pembezaan dan dehidrasi dalam 75 peratus dan 90 peratus alkohol beberapa kali, diikuti dengan dibilas dalam air paip. Akhirnya, bahagian telah dibersihkan dalam xilena dan dipasang dengan medium pelekap. Bahagian telah divisualisasikan dengan mikroskop. Pemendapan kolagen interstisial ditunjukkan oleh pewarnaan biru-hijau.
Pewarnaan Alizarin merah S
Untuk pewarnaan kalsifikasi aorta, bahagian aorta toraks diwarnakan dengan larutan S merah alizarin 2 peratus selama 10 minit dan dibasuh dengan PBS. Kemudian, bahagian tersebut direndam dalam aseton kontang selama 30 saat, larutan campuran aseton kontang dan xilena (nisbah isipadu ¼ 1:1) selama 15 saat, dan xilena kontang selama 1 minit. Garam kalsium fosfat interstisial ditunjukkan dengan pewarnaan merah.
Western blotting
Aorta toraks diletakkan dalam penampan lisis RIPA (HaiGene, Haerbin, China) ditambah dengan perencat protease (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, Amerika Syarikat) dan kemudian dihomogenkan dengan ultrasonik pada ais. Tisu lisat telah disentrifugasi pada 12,000 g pada 4 C selama 15 minit, dan supernatan dikumpulkan dalam tiub baharu. Selepas itu, kepekatan protein dalam supernatan ditentukan menggunakan kit ujian protein BCA (Institut Bioteknologi Beyotime, Jiangsu, China). SDS PAGE dilakukan dengan jumlah protein yang sama daripada setiap sampel seperti yang diterangkan sebelum ini (Zheng et al. 2020), dan protein kemudiannya dipindahkan ke membran PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Membran diinkubasi pada suhu 4 C semalaman dengan salah satu daripada antibodi utama berikut selepas disekat dengan 5 peratus albumin serum lembu (Gibco) selama 1 jam pada suhu bilik: p21Cip1 (1:1000), p16INK4a (1:1000), ICAM{ {16}} (1:1000), VCAM-1 (1:5000), PAI-1 (1:1000), kolagen I (1:1000), kolagen III (1:300), Gas6 (1:1000), Axl (1:500) dan GAPDH (1:1000). Selepas dibasuh, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi HRP (Boster, Wuhan, China) selama 1 jam pada suhu bilik. Pengikatan antibodi sekunder telah diuji menggunakan kit ECL (EMD Millipore), dan keamatan jalur dianalisis menggunakan perisian ImageJ (versi 1.41; Institut Kesihatan Nasional, MD, Amerika Syarikat). Ekspresi GAPDH digunakan sebagai kawalan dalaman.
RT-PCR kuantitatif masa nyata (qPCR)
Pertama, jumlah RNA telah diasingkan daripada aorta toraks menggunakan Kit Pengekstrakan RNA Universal MiniBEST TaKaRa (9767, TaKaRa) mengikut protokol pengeluar. Kepekatan RNA kemudiannya diukur dengan DS-11 FX Spectrophotometer (DeNovix). Seterusnya, RNA yang diekstrak (10}00 ng setiap satu untuk sistem tindak balas 20 mL) ditranskripsi terbalik ke dalam cDNA menggunakan PrimeScriptTM RT Master Mix (RR360A, TaKaRa) mengikut arahan pengilang dalam Sistem PCR ProFlex (Thermo Scientific ). Akhirnya, produk transkripsi terbalik digunakan sebagai templat untuk penguatan PCR selanjutnya dengan SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa). Urutan primer berikut telah digunakan: Gapdh: ke hadapan 50 -CAGCAACTCCCA CTCTTCCAC-30 dan ke belakang 50 - TGGTCCAGGGTTTCTTAC TC-30; dan Axl: ke hadapan 50 -GGAACCCAGGGAATATCACAGG- 30 dan ke belakang 50 -AGTTCTAGGATCTGTCCATCTCG-30; dan Gas6 ke hadapan 50 -TGCTGGCTTCCGAGTCTTC-30 dan ke belakang 50 -CGGGGTCGTTCTCGAACAC-30. Setiap telaga tindak balas dalam 96-plat jernih telaga (Thermo Scientific) yang mengandungi primer hadapan dan belakang 0.4 pmol/l, 1 SYBR Premix Ex Taq II (RR820A, TaKaRa) dan 10 ng cDNA. Isipadu tindak balas akhir ialah 20 mL, dan semua sampel dianalisis dalam tiga kali ganda. Penguatan cDNA dilakukan seperti berikut: pra-denaturasi pada 95 C selama 30 s, diikuti oleh 40 kitaran denaturasi pada 95 C selama 5 s, dan penyepuhlindapan pada 60 C selama 35 s dalam QuantStudio5 (Thermo Scientific). Kaedah 2-DDCT digunakan untuk analisis kuantitatif relatif bagi data yang dikumpul. Tahap ekspresi mRNA relatif gen sasaran diperoleh dengan membandingkan data daripada kumpulan eksperimen dengan kumpulan kawalan dengan merujuk kepada Gapdh.
E-mel:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp tambah 86 15292862950
