Zarah Halus 2.5 Mengatur Melanogenesis dalam Sel Melanoma Manusia A375

Kepada Editor: Kajian epidemiologi telah menunjukkan bahawa pendedahan bahan zarahan halus 2.5 (PM2.5) meningkatkan risiko hiperpigmentasi kulit.[1] Satu kajian baru-baru ini membuktikan bahawa PM2.5 boleh mendorong melanogenesis dengan mengawal selia tyrosinase (TYR), dan ekspresi protein 1 (TYRP1) dan 2 (TYRP2) yang berkaitan dengan tyrosinase melalui reseptor aril hidrokarbon (AhR)/ pengaktifan isyarat protein kinase yang diaktifkan mitogen.[ 2] AhR tersebar luas dalam sel kulit dan pengikatannya mengawal pengoksidaan/anti-pengoksidaan, fungsi penghalang epidermis, tindak balas yang disebabkan oleh foto, imuniti semula jadi dan melanogenesis. Ia boleh diaktifkan oleh hidrokarbon aromatik dioksin dan polisiklik (konstituen PM2.5) dan pengaktifannya mendorong transkripsi gen pengekodan kedua-dua fasa I dan fasa II enzim metabolisme xenobiotik (cytochromes P450 [CYP] 1A1, CYP1A2, dan CYP1B1). [3,4] BaP dan dioksin berbahaya mengaktifkan AhR dengan penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS) yang teguh, yang sekurang-kurangnya sebahagiannya dimediasi oleh CYP1A1. Selain itu, tekanan oksidatif pengantara CYP1A1-bertanggungjawab untuk penghasilan sitokin pro-radang, seperti interleukin (IL)-1, IL-6 dan IL-8 dalam persekitaran keratinosit manusia yang dirawat dengan bahan cemar.[3,5] Walau bagaimanapun, terdapat sangat sedikit kajian tentang kesan toksik PM2.5 pada sel melanogenetik. Di sini, kami merawat sel melanoma manusia A375 dengan pelbagai kepekatan PM2.5 untuk menyiasat sama ada PM2.5 boleh menggalakkan melanogenesis, dan hubungannya dengan isyarat AhR, tekanan oksidatif dan tindak balas keradangan.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan mempunyai keupayaan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik pada Suplemen Cistanche Tubulosa

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

PM2.5 telah dikumpul semasa musim sejuk (dari Disember hingga Januari) di Beijing. HY-1000 pensampel jumlah zarah terampai (TSP) aliran besar pintar (pemotong PM2.5 pilihan, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, China) telah digunakan untuk pensampelan penapis kuarza. Membran kuarza direndam dalam 75 peratus etanol diikuti dengan goncangan ultrasonik. Air steril digunakan untuk menyediakan larutan stok berkepekatan tinggi. Sel melanoma manusia A375 dibiakkan dalam 5 peratus CO2 pada 37 darjah dalam Medium Helang Modified Dulbecco biasa (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) yang mengandungi serum lembu janin (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat). Sel A375 dirawat dengan kepekatan PM2.5 yang berbeza (0, 100, 200, dan 400 ug/mL) selama 24 jam dan sel tersebut digunakan untuk kajian berikut. Ujian-t Pelajar tidak berpasangan dan analisis varians sehala digunakan untuk analisis statistik, dan P <0.05 dianggap signifikan secara statistik.

Untuk menyiasat pengaruh PM2.5 pada sel A375, percambahan sel telah dikesan menggunakan kit CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan apoptosis sel telah dikesan menggunakan Annexin V fluorescein isothiocyanate/ kit apoptosis propidium iodide (FITC/PI) (Multisciences, USA), berdasarkan arahan pengilang. Keputusan menunjukkan bahawa PM2.5 mempamerkan sitotoksisiti yang bergantung kepada kepekatan kepada sel A375, tetapi tidak menjejaskan apoptosis [Tambahan Rajah 1, http://links.lww.com/ CM9/A917].

Kaedah NaOH digunakan untuk menentukan kandungan melanin. Sel A375 yang dirawat PM2.5-dibasuh dengan garam penimbal fosfat (PBS) dan dilisekan dengan air. Lisat telah disentrifugasi pada 12, 000 r/min selama 5 minit, dibasuh dengan 10 peratus asid trichloroacetic (500 mL) (Sigma, St. Louis , MO, USA) dan 75 peratus etanol (500 mL), dan kemudian dijelaskan lagi. Selepas itu, 50 mL 1 mol/L NaOH yang mengandungi 10 peratus dimetil sulfoksida telah ditambah kepada pelet selama 1 jam pada 80 darjah. Penyerapan pada 490 nm (OD 490) diukur menggunakan pembaca plat mikro. Oleh kerana TYR ialah enzim melanogenik yang paling penting, kami seterusnya mengesan aktiviti TYR menggunakan ujian levodopa (L-DOPA). Plat Sixwell (Corning, Amerika Syarikat) telah disemai dengan sel A375 pada ketumpatan 3 105 sel/telaga. Sel-sel itu kemudiannya dibasuh dengan PBS dan dilisiskan dengan 0.5 peratus natrium deoksikolat (Sigma). Lysate dibahagikan kepada tiga kumpulan, dan 0.1 peratus L-DOPA (Sigma) telah ditambah kepada setiap sampel. Selepas 5 minit, OD 490 diukur dan 0.1 peratus L-DOPA digunakan sebagai piawai. Kami juga mengukur tahap ekspresi mRNA dan protein TYR. Jumlah RNA diekstrak menggunakan kit mini RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, Amerika Syarikat). Transkripsi terbalik dilakukan menggunakan kit ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Jepun). Selepas itu, tindak balas rantai polimerase masa nyata kuantitatif (qRT- PCR) dilakukan pada Campuran Master PCR Masa Nyata Bio-Rad CFX96 TouchTM (TOYOBO, Jepun). Primer daripada Invitrogen dibentangkan dalam Jadual Tambahan 1, http://links. lww.com/CM9/A917, dan tahap ekspresi setiap mRNA dikira menggunakan kaedah 2*DDCT. Tahap ekspresi protein dianalisis oleh Western blotting. Sel-sel telah dibasuh dengan PBS dan dilisekan dalam penampan RIPA (Beyotime, China) yang mengandungi fenilmetilsulfonil fluorida (campuran perencat protease, 20:1, Sigma-Aldrich). Kepekatan protein diukur menggunakan kit ujian protein BCA (Beyotime, China). Jumlah protein direbus pada suhu 70 darjah selama 10 minit, diasingkan dalam gel 4 peratus –12 peratus pada 200 V selama 40 minit, dipindahkan ke membran pada 4 darjah menggunakan 120 mA selama 75-100 minit, dan kemudian diinkubasi dengan 5 peratus susu tanpa lemak selama 1 jam. Membran kemudiannya disiasat dengan antibodi anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 dan anti-CYP1B1 (Abcam) semalaman pada 4 darjah . Antibodi IgG anti-tikus terkonjugasi lobak pedas peroksidase (Proteintech, USA) digunakan sebagai antibodi sekunder. Keputusan menunjukkan bahawa PM2.5 meningkatkan kandungan melanin dan aktiviti TYR dalam cara yang bergantung kepada dos. Kedua-dua tahap ekspresi mRNA dan protein TYR telah dikawal selia [Tambahan Rajah 2 A-D, http://links.lww.com/CM9/A917].

PM2.5 boleh mengawal selia aktiviti TYR dengan mengaktifkan laluan AhR. Untuk menentukan sama ada PM2.5 menjejaskan isyarat AhR, kami mengesan tahap transkripsi AhR dan gen hiliran klasiknya CYP1A1 dan CYP1B1 oleh qRT-PCR dan western blotting. Keputusan menunjukkan bahawa PM2.5 mengimbangi tahap ekspresi mRNA AhR dan CYP1A1, serta ekspresi protein CYP1A1 [Tambahan Rajah 2 E-G, http://links.lww.com/ CM9/A917].

Pengaktifan AhR menyebabkan penjanaan ROS, yang juga boleh meningkatkan aktiviti TYR.[5] Oleh itu, kami menilai pengeluaran ROS menggunakan 20,70 -dichlorofluorescein diacetate (DCFHDA) dan sitometri aliran. Selepas 24 jam rawatan dengan PM2.5, sel A375 diinkubasi dengan DCFH-DA (5mmol/L) selama 30 minit pada 37 darjah dalam gelap. Sel telah dibasuh dua kali dalam PBS, dan pendarfluor diukur oleh cytometer aliran. Purata intensiti pendarfluor dikira menggunakan perisian FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, New York, NY, USA). Oleh kerana pengeluaran ROS yang disebabkan oleh CYP1A1-dianggap bertanggungjawab terhadap tindak balas keradangan,[5] tahap ekspresi mRNA sitokin pro-radang (IL-1a, IL-6, IL{ {19}}, dan faktor nekrosis tumor [TNF]-a) diukur. Didapati bahawa PM2.5 meningkatkan pengeluaran ROS, serta paras mRNA IL-1a, IL-6, dan IL-8 dalam sel A375 [Tambahan Rajah 2 H dan I, http ://pautan. lww.com/CM9/A917].

Penemuan kajian ini menunjukkan bahawa PM2.5 menggalakkan melanogenesis, dan meningkatkan kedua-dua aktiviti dan ekspresi TYR dalam sel A375. Selain itu, PM2.5 boleh mengaktifkan isyarat AhR, dan mendorong tekanan oksidatif dan tindak balas keradangan, yang mungkin merupakan lata isyarat melanogenik yang bertanggungjawab untuk hiperpigmentasi.

Ucapan terima kasih

Kami merakamkan ucapan terima kasih yang tulus kepada yang berikut: Prof. Dr. Masutaka Furue dan Prof. Dr. Tsuji Gaku dari Hospital Universiti Kyushu yang telah menambah baik manuskrip dan membantu dengan maklumat berkaitan AhR. Kami juga berterima kasih atas suntingan bahasa Inggeris yang disediakan oleh Prof. Dr. Robert Schwartz dari Rutgers New Jersey Medical School.

Pembiayaan

Kajian ini disokong oleh geran daripada Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (No. 2101000271).

Konflik kepentingan

tiada.

Rujukan

1. Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Pendedahan kepada bahan zarahan halus yang dikaitkan dengan lentigo nyanyuk dalam wanita Cina: kajian keratan rentas. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.

2. Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. Bahan zarah menggalakkan hiperpigmentasi melalui pengaktifan isyarat AhR/MAPK dan dengan meningkatkan paras paracrine a-MSH dalam keratinosit. Pencemaran Alam Sekitar 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.

3. Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Potensi peranan PM2.5 dalam melanogenesis. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.

4. Napolitano M, Patruno C. Aryl reseptor hidrokarbon (AhR) sasaran yang mungkin untuk rawatan penyakit kulit. Hipotesis Med 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.

5. Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Kesan bahan zarahan bawaan udara pada kulit: kajian sistematik dari epidemiologi kepada kajian in vitro. Bahagian Fiber Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-t.

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】