Ekspresi Immunoglobulin G dalam Sel Epitelium Tubular Proksimal Manusia

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG et al

Abstrak. proksimaltiubsel epitelium (PTEC) mempunyai ciri imun semula jadi dan menghasilkan faktor proinflamasi, kemokin, dan komponen pelengkap yang mendorong peralihan epitelium-mesenchymal (EMT). Kajian terdahulu kami mendedahkan bahawa sel mesangial manusia dan podosit dapat mensintesis dan merembeskan immunoglobulin (Ig) A dan IgG, masing-masing. Matlamat kajian ini adalah untuk menilai ekspresi Igs dalam PTEC. Pertama, IgG dikesan dalam sitoplasma, membran sel, dan lumenPTECdalam korteks buah pinggang normal olehimunohistokimia. Kedua, transkripsi gen Ig dan penggabungan semula V(D)J dikesan dalam PTEC tunggal oleh penjujukan PCR dan Sanger bersarang. Ketiga, Ig , Igκ, dan Igλ telah dikesan dengan jelas dalam talian PTEC yang diabadikan (HK-2) dengan imunostaining dan western blotting, di mana RP215 (antibodi yang kebanyakannya mengikat kepada IgG bukan sel B) digunakan. Di samping itu, transkrip gen Ig , Igκ, dan Igλ, penggabungan semula V(D)J konservatif di rantau pembolehubah Ig, gen pengaktifan semula penggabungan 1/2 dan deaminase cytidine yang disebabkan oleh pengaktifan semuanya dikesan dalam sel HK‑2. Data ini mencadangkan bahawa PTEC boleh menyatakan IgG dengan cara yang sama dengan sel B. Tambahan pula, ekspresi IgG dikawal oleh TGF‑ 1 dan mungkin terlibat dalam EMT.

Kata kunci:proksimaltiubsel epitelium, sel tunggal, HK‑2, IgG, peralihan epitelium‑mesenchymal

Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

pengenalan

proksimaltiubsel epitelium (PTEC) adalah jenis sel yang paling banyak dalambuah pinggangdan mempunyai peranan penting dalam pembaikan buah pinggang dan/atau perkembangan penyakit buah pinggang kronik. PTEC melaksanakan fungsi imunologi dengan menyatakan berbilang reseptor seperti Tol (TLR), seperti TLR 1, 2, 3, 4, dan 9 (1,2), dan molekul yang dikaitkan dengan fungsi sel pembentang antigen, termasuk MHCII, CD74, CD80 , dan CD86 (3). Ciri-ciri imun semula jadi PTEC ini membolehkan mereka bertindak sebagai tindak balas imun kepada pelbagai rangsangan, dengan penghasilan dan pembebasan mediator bioaktif yang berbangkit, termasuk sitokin proinflamasi, kemokin, dan komponen pelengkap, yang mendorong keradangan interstisial dan fibrosis (4). PTEC juga mengekspresikan reseptor Fc neonatal dan mengekalkan kapasiti pengikatan dan transcytosis bergantung pH spesifik imunoglobulin (Ig)G (5). Walau bagaimanapun, sepanjang pengetahuan kami, masih tidak diketahui sama ada PTEC menyatakan Igs.

Sebelum ini telah dihipotesiskan bahawa Ig dihasilkan semata-mata oleh sel B matang dan sel plasma dan Ig bertindak sebagai antibodi untuk mengenali dan meneutralkan pelbagai patogen. Walau bagaimanapun, teori ini telah dicabar dalam beberapa dekad kebelakangan ini, kerana semakin banyak bukti telah melaporkan bahawa Ig, termasuk IgA, IgG, dan IgM, boleh dihasilkan dan dirembeskan oleh sel bukan B, seperti sel kanser epitelium manusia (6,7) dan sel-sel bukan-B normal (8,9), serta di tapak istimewa imun, seperti mata (10), neuron pusat (11,12), plasenta (13), dan testis dan epididimis (14)

Sama seperti Igs (B‑Igs) sel B, bukan B‑Igs juga merupakan produk transkripsi dan penyusunan semula gen Ig dan memaparkan corak penggabungan semula V(D)J klasik dengan penambahan nukleotida pada persimpangan dan hipermutasi somatik(7, 11,14). Berbeza dengan B‑Igs, bukan‑B‑Igs memaparkan corak penggabungan semula V(D)J terhad dan kurang kepelbagaian (7). Secara fungsional, bukan-B-Ig bukan sahaja menggunakan aktiviti antibodi semula jadi dalam kulit dan mukosa (8) tetapi juga boleh bertindak sebagai faktor pertumbuhan untuk menggalakkan percambahan dan lekatan sel, dan boleh meningkatkan permulaan dan metastasis kanser dengan mengikat integrin ( 15-17). Contohnya, IgG kanser yang diiktiraf RP215 melaksanakan fungsi onkogeniknya dengan berinteraksi dengan kompleks integrin 6 4 dan mengaktifkan laluan FAK dan Src (15).

Kajian terdahulu kami menunjukkan bahawa sel mesangial (18) dan podosit (19) boleh mensintesis dan merembeskan IgA dan IgG, dan mengambil bahagian dalam pertumbuhan sel dan lekatan sel secara in vitro. Kajian ini bertujuan untuk menilai tahap ekspresi Igs dalam PTEC dan menyiasat potensi peranannya dalam peralihan epitelium-mesenchymal (EMT).

Kesan cistanche: manfaat buah pinggang

Bahan dan kaedah

Kultur dan rawatan sel.Talian PTEC HK‑2 yang diabadikan telah dibeli daripada American Type Culture Collection. Sel HK‑2 telah dikultur dalam DMEM/F12 ditambah dengan 100 U/ml penisilin, 0.1 mg/ml streptomycin (semua Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), dan 10 peratus serum lembu janin (FBS; Asal Australia; Biological Industries USA, Inc.) pada 37˚C dalam atmosfera yang mengandungi 95 peratus udara dan 5 peratus CO2. Untuk mengelakkan gangguan Ig dalam FBS, medium telah digantikan dengan medium bebas serum 24‑48 jam sebelum penuaian sel. Sel HK‑2 telah dirawat dengan kepekatan yang berbeza (2, 5, dan 10 ng/ml) TGF‑1 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA).

Pengasingan PTEC tunggal dan sintesis cDNA.Sampel buah pinggang manusia tisu kortikal normal secara makroskopik diperoleh daripada pesakit (lelaki, 31 tahun) yang menjalani nefrectomy akibat karsinoma buah pinggang tanpa disfungsi buah pinggang yang jelas. Suspensi sel tunggal telah disediakan dengan mencerna korteks buah pinggang dengan 1 mg/ml kolagenase I (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) pada 37˚C selama 20 min. PTEC diisih menggunakan phycoerythrin (PE)-conjugated anti-CD10 (cat. no. 312203) dan allophycocyanin (APC)-conjugated anti-CD13 (cat. no. 301705; kedua-dua BioLegend, Inc.) melalui pendarfluor sel‑ Sistem Pesanan Khas BD FACSAria II) seperti yang diterangkan sebelum ini (20). Antibodi kawalan isotype yang sepadan (cat. nos. 400111 dan 400119; kedua-dua BioLegend, Inc.) telah digunakan untuk mengecualikan pewarnaan tidak spesifik. Sel hidup berlabel positif berganda telah diasingkan sebagai PTEC. Satu PTEC dipilih secara manual di bawah mikroskop cahaya terbalik menggunakan pipet kapilari dan kemudian dipindahkan ke tiub PCR dinding nipis 0.2ml yang mengandungi penimbal lisis (21). Pengekstrakan RNA PTEC tunggal dan sintesis cDNA telah dijalankan mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini(21). Sebanyak lima PTEC tunggal digunakan untuk mengesan transkripsi dan penyusunan semula gen Ig.

Penguatan PCR.Jumlah RNA diekstrak daripada sel HK‑2, sel mononuklear darah periferi [PBMC, diasingkan daripada penderma sihat wanita berumur 31 tahun menggunakan Ficoll (cat. no. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] dan korteks buah pinggang (daripada pesakit yang sama digunakan dalam pengasingan PTEC tunggal) menggunakan reagen TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), dan kepekatan RNA dinilai menggunakan spektrofotometer NanoDrop (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Selepas itu, 2 µg jumlah RNA telah ditranskripsikan secara terbalik kepada cDNA menggunakan kit Sintesis cDNA RevertAid First Strand (cat. no. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). PCR dilakukan menggunakan primer yang menyasarkan kawasan malar Ig, Igκ, Igλ, dan cytidine deaminase (AID) yang disebabkan oleh pengaktifan. PCR bersarang dilakukan untuk menguatkan kawasan pembolehubah Ig , protein berkaitan reseptor lipoprotein berketumpatan rendah 2 (LRP2), dan gen pengaktifan semula (RAG)1 dan RAG2. Produk PCR diasingkan dengan elektroforesis pada gel agarose 1.0 peratus dan divisualisasikan menggunakan GelRed (cat. no. 41003; Biotium, Inc.). Primer AID, RAG1/2, dan kawasan malar Ig , Igκ, Igλ yang digunakan dalam kajian ini merujuk kepada primer yang digunakan oleh Jing et al (19). Primer bagi kawasan pembolehubah Ig merujuk kepada primer yang digunakan oleh van Dongen et al (22). Primer lain yang digunakan untuk PCR telah disenaraikan dalam Jadual SI. Keadaan kitar termos disenaraikan dalam Jadual SII.

Penjujukan Sanger dan analisis data penjujukan.Produk PCR bagi rantau pembolehubah Ig yang diperoleh daripada PTEC tunggal, sel HK‑2 dan PBMC masing-masing telah diklon menjadi Sistem Vektor Mudah pGEM‑T I (cat. no. A1360; Promega Corporation), yang telah diubah ke dalam sel Kompeten TOP10 (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Secara ringkas, 5 µl produk pengikatan telah ditambah kepada 30 µl TOP10 sel kompeten, diinkubasi di atas ais selama 30 minit, dikejutkan haba pada 42˚C selama 90 saat, dan diinkubasi pada ais selama 5 minit. Kemudian, 500 µl LB ditambah dan dibiarkan pada suhu 37˚C selama 40 minit sebelum menyuntik sebahagian cecair bakteria pada cawan Petri yang disalut dengan 0.1 mmol/l IPTG dan 20 µg/ml X‑Gal. Hidangan diterbalikkan pada suhu 37˚C semalaman. Secara keseluruhannya, 5‑16 koloni putih bagi setiap sampel telah dipilih secara rawak dan disusun menggunakan Penganalisis Genetik ABI 3730XL (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Urutan V(D)J yang disusun semula telah dibandingkan dengan yang terdapat dalam alat carian penjajaran tempatan asas (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) untuk mengenal pasti segmen dan persimpangan gen germline yang paling sesuai selepas pemangkasan primer .

Analisis Western blot.Sel HK‑2 telah dilisiskan dalam penimbal lisis TSD [1 peratus SDS, 50 mM Tris‑HCl (pH 7.5), 50 mM DTT] yang mengandungi koktel perencat protease (Applygen Technologies Inc.), disonikasi pada air ais selama 1 minit ( bekerja 5 saat dan berehat 15 saat; 3 kali) dan dilisiskan selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas sentrifugasi pada 12,000 xg selama 10 minit pada 4˚C, kepekatan protein lisat sel ditentukan menggunakan kit BCA (Applygen Technologies Inc.). Selepas itu, penimbal pemuatan pengurangan 5X telah ditambah kepada lysate, direbus pada 100˚C selama 10 minit, dan sampel segera digunakan untuk analisis western blot. Serum, digunakan sebagai kawalan positif untuk Ig, telah diasingkan daripada penderma yang sihat (penderma yang sama seperti yang digunakan dalam PBMC) dengan sentrifugasi pada 2,103 xg selama 10 minit pada suhu bilik.

Kesan cistanche: manfaat buah pinggang

Western blotting telah dijalankan mengikut prosedur standard. Secara ringkas, 3{{4{0}} µg protein diasingkan oleh SDS‑PAGE pada 10 peratus gel dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Selepas itu, membran telah disekat dalam susu skim 5 peratus pada suhu bilik selama 1 jam dan diinkubasi dengan antibodi primer pada suhu 4˚C semalaman, termasuk Ig anti-manusia arnab (cat. no. ab109489; 1:1,{{8} }), arnab anti-manusia Ig 4 (kucing no. ab109493; 1:1,000), anti-Igκ (kucing no. ab124727; 1:10,000), anti‑ Igλ (cat. no. ab124719; 1:20,000), arnab anti-manusia ‑aktin (cat. no. ab8227; 1:2,000) (semua daripada Abcam) dan RP215 antibodi monoklonal (mAb) (didermakan oleh Profesor Xiaoyan Qiu, Universiti Peking, Beijing, China; 1:1,000), yang secara khusus mengenal pasti epitop yang berkaitan dengan karbohidrat pada bukan B‑Ig . Membran kemudian diinkubasi dengan anti-arnab kambing (kucing no. 926‑32211) atau anti-tikus (kucing no. 926-32210) antibodi sekunder IgG‑IRDyeTM680CW (kedua-duanya 1:10,000; kedua-duanya LI‑COR Biosains) pada suhu bilik selama 1 jam. Isyarat itu dikesan menggunakan sistem Pengimejan Odyssey dan perisian Odyssey V3.0 (kedua-dua LI‑COR Biosciences). Perisian ImageJ (versi 1.8.0; Institut Kesihatan Nasional) telah digunakan untuk separuh kuantifikasi.

Pembersihan IgG dan spektrometri jisim.Selepas sel HK‑2 telah dibiakkan dalam DMEM/F12 tanpa FBS selama 48 jam, supernatan kultur dikumpul selepas sentrifugasi pada 2,103 xg selama 10 minit pada 4˚C. Supernatan sel telah disucikan dengan kromatografi pertalian menggunakan protein G Sepharose, mengikut arahan pengilang (cat. no. 17‑0618‑02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eluen telah ditapis ultra untuk menggantikan penimbal elusi (0.1 M Glycine; pH 2.4) dengan PBS. Protein yang telah dimurnikan telah dipisahkan oleh SDS‑PAGE pada 10 peratus gel, dikesan oleh western blotting, dan selanjutnya dianalisis oleh spektrometri jisim, yang dilakukan oleh Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Imunofluoresensi.Sel HK-2 telah dibiakkan pada slip penutup, yang difiksasi dalam aseton tidak cair sejuk selama 5 minit pada suhu bilik. Selepas itu, slaid telah dibasuh dua kali dalam PBS dan disekat dengan 5 peratus FBS / PBS pada suhu bilik selama 20 minit, selepas itu ia diinkubasi dengan antibodi utama pada 4˚C semalaman. Antibodi adalah sama seperti yang digunakan dalam western blotting: Arnab anti-manusia Ig (1:150), anti-manusia Igκ (1:250), anti-manusia Igλ (1:250), dan RP215 mAb (1:200). ); PBS digunakan sebagai kawalan negatif. Selepas mencuci dalam PBS, slaid diinkubasi dengan anti-arnab kambing berlabel fluorescein isothiocyanate (kucing no. A11008) atau anti-tikus kambing (kucing no. A11001) antibodi IgG (1:1,000; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) pada suhu bilik selama 1 jam. Nukleus telah dicemari dengan DAPI. Imej telah ditangkap di bawah mikroskop pendarfluor Leica DFC300 FX (Leica Microsystems GmbH).

Pewarnaan imunohistokimia.Korteks renal paracancerous dikumpul daripada empat pesakit lelaki (umur, 38-49 tahun) dengan karsinoma buah pinggang. Korteks renal paracancerous normal selepas nefrektomi telah dibetulkan dengan 10 peratus formalin selama 48 jam pada suhu bilik dan kemudian dibenamkan dalam parafin. Sampel buah pinggang manusia yang dibenamkan parafin dipotong kepada bahagian 3‑µm dan dinyahparafinkan serta dihidratkan semula melalui satu siri kepekatan etanol berperingkat. Pengambilan semula antigen dilakukan dengan mendidih dalam 0.05 M Tris‑EDTA (pH 9.0) dalam periuk tekanan selama 3 minit. Bahagian tersebut kemudiannya diinkubasi dengan larutan H2O2 3 peratus selama 10 minit pada suhu bilik untuk menghapuskan peroksidase endogen dan diinkubasi dengan serum kambing biasa (cat. no. ZLI‑9022, ZSGB‑BIO, China) selama 30 minit pada suhu bilik untuk menyekat tidak spesifik tapak pengikat antibodi pada suhu bilik. Selepas itu, pewarnaan imunohistokimia tidak langsung dilakukan dengan antibodi primer pada suhu 4˚C semalaman, termasuk RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), Ig anti-manusia arnab (1:2,000), anti-manusia Igκ (1:1,000), anti-manusia Igλ (1:1,000) (antibodi yang sama seperti yang digunakan dalam western blotting). Bahagian tanpa antibodi utama digunakan sebagai kawalan negatif. Slaid kemudiannya diinkubasi dengan antibodi sekunder berlabel peroksidase lobak pedas yang tidak dicairkan (cat. nos. PV‑6001 dan PV‑6002; kedua-dua OriGene Technologies, Inc.) pada suhu bilik selama 30 minit. Antibodi terikat dikesan menggunakan diaminobenzidine. Akhirnya, slaid telah diwarnakan dengan hematoxylin. Imej ditangkap menggunakan mikroskop cahaya (pembesaran x200). Analisis statistik. Data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai dan dianalisis menggunakan SPSS 20.0 for Windows (IBM Corp.). Semua eksperimen diulang 3 kali. Perbezaan antara berbilang kumpulan dianalisis menggunakan ANOVA sehala dan ujian posthoc Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Kesan cistanche: manfaat buah pinggang

Keputusan

Ekspresi IgG dalam sel epitelium tubular renal korteks buah pinggang.Korteks buah pinggang normal, yang dikumpul daripada penderma yang menjalani nefrektomi akibat karsinoma sel renal, digunakan untuk menentukan ekspresi IgG dalam sel epitelium tubular renal oleh imunohistokimia menggunakan antibodi terhadap Ig manusia, Igκ, Igλ, dan RP215 (antibodi yang kebanyakannya mengikat kepada bukan-B‑IgG). Pewarnaan positif bagi rantai berat dan ringan IgG bukan sahaja dikesan dalam PTEC tetapi juga dalam sel epitelium tubul berbelit distal, sama ada dalam sitoplasma, membran sel atau lumen tiub (Rajah 1).

Transkripsi dan penggabungan semula V(D)J IgG dalam PTEC tunggal. Untuk mengelakkan gangguan sisa darah, pengikatan, dan transcytosis IgG oleh PTEC dalam korteks buah pinggang, dan untuk mendapatkan bukti langsung ekspresi IgG dalam PTEC, PTEC tunggal disusun daripada korteks buah pinggang manusia menggunakan pelabelan bersama CD10 dan CD13 mengikut aliran. sitometri (20). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, PTEC berganda CD10/CD13 menyumbang 4.1 peratus sel berdaya maju dalam sampel. PTEC yang terpencil telah disahkan selanjutnya menggunakan gen penanda khusus LRP2, dan pencemaran sel B telah dihapuskan oleh CD19. Transkrip rantau pembolehubah Ig telah dikuatkan dalam lima PTEC tunggal oleh PCR bersarang (Rajah 2B dan C). Keputusan penjujukan Sanger mendedahkan bahawa PTEC mempamerkan penggabungan semula VDJ yang berfungsi dan konservatif bagi rantai berat IgG (Jadual I), menunjukkan bahawa ekspresi IgG mungkin berlaku dalam PTEC.

Ekspresi rantai berat dan ringan IgG dalam sel HK‑2. Oleh kerana sukar untuk mengesan ekspresi protein IgG dalam satu PTEC dan untuk mendapatkan PTEC yang mencukupi untuk penghapusan barat, garisan sel HK-2, yang terdiri daripada PTEC yang diabadikan, telah dipilih untuk mengesahkan lagi ekspresi protein IgG. Analisis imunofluoresensi menunjukkan pewarnaan positif Ig, Igκ, dan Igλ dalam sitoplasma, dan pewarnaan positif RP215 yang lebih kuat terutamanya dalam sitoplasma dan membran sel (Rajah 3A).

Selepas itu, ekspresi rantai berat dan ringan IgG dalam sel HK-2 telah dikesan oleh penghapusan barat di bawah keadaan yang mengurangkan. Untuk menghapuskan gangguan FBS dalam medium kultur, medium yang mengandungi FBS telah dipadamkan dengan antibodi yang sepadan dan diwarnakan negatif. Antibodi IgG komersial dapat mengesan IgG yang diperolehi serum tetapi tidak IgG yang diperolehi HK-2. Sebaliknya, RP215 boleh mengesan IgG terbitan HK‑2, tetapi bukan IgG serum. Kedua-dua antibodi IgG komersial dan RP215 dapat mengesan Ig pada 55 kDa. Jalur Ig 4 (36 kDa) dikesan dalam sel HK‑2, selaras dengan berat molekul yang diramalkan. Tambahan pula, ungkapan Igκ (25 kDa) dan Igλ (50 kDa, dimer) diperhatikan dalam lisat sel (Rajah 3B). Selepas itu, IgG dalam supernatan sel telah disucikan oleh protein G, disahkan oleh penghapusan barat dan disusun oleh spektrometri jisim, yang menunjukkan bahawa jalur 55-kDa mengandungi serpihan rantai Igκ dan rantau pembolehubah rantai berat Ig, menurut Pusat Kebangsaan untuk Pangkalan data Maklumat Bioteknologi (NCBI) (Rajah 3C‑E). Data ini mencadangkan bahawa sel HK‑2 menghasilkan dan merembeskan protein IgG.

Transkripsi dan penggabungan semula V(D)J bagi rantai berat dan ringan IgG dalam sel HK‑2. Transkripsi gen Ig dan penggabungan semula V(D)J berfungsi adalah prasyarat untuk ekspresi Ig. Untuk mengesahkan ungkapan IgG dalam sel HK‑2, transkrip Ig, Igκ, dan Igλ dinilai dengan menguatkan kawasan malar dan berubah-ubah dalam sel HK‑2 (Rajah 4A dan B). Penjujukan produk PCR yang berterusan menunjukkan homologi yang tinggi dengan urutan yang diterbitkan dalam pangkalan data NCBI. Pengklonan T‑A dan penjujukan Sanger menunjukkan bahawa Ig dalam sel HK‑2 memaparkan penggabungan semula V(D)J konservatif dengan VH4‑4/D2‑8/JH5. Sebaliknya, kepelbagaian penggabungan semula V (D) J diperhatikan dalam PBMC, yang menghapuskan bias primer (Jadual II). Sama seperti sel B, IgG terbitan HK‑2‑mempamerkan penggabungan semula V(D)J produktif tipikal dengan simpang V‑D dan D‑J (Rajah 4C). Selain itu, hipermutasi somatik telah dikesan dalam Ig terbitan HK‑2 (julat, 6.8‑8.4 peratus ) dengan 7 daripada 15 motif titik liputan (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) menunjukkan mutasi.

Di samping itu, transkrip AID (elemen penting untuk hipermutasi somatik dan penggabungan semula suis kelas dalam sel B), dan RAG1 dan RAG2 [diperlukan untuk penggabungan semula V(D) J] telah dikesan dalam sel HK‑2 (Rajah 4B), menunjukkan bahawa mekanisme yang mendasari sintesis Ig dalam sel HK‑2 mungkin serupa dengan sel B.

TGF‑ 1 mengimbangi ekspresi IgG dalam sel HK‑2. Sel HK‑2 telah dirangsang dengan pelbagai kepekatan TGF‑1 selama 48 jam. Pewarnaan imunofluoresensi mendedahkan bahawa IgG sitoplasma menunjukkan pewarnaan positif yang dipertingkatkan berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 5A). Western blotting mengesahkan bahawa IgG dikawal dengan ketara oleh TGF‑ 1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Kesan cistanche: manfaat buah pinggang

Perbincangan

Kajian ini menunjukkan bahawa PTEC menyatakan IgG dengan transkripsi gen dan penggabungan semula V(D)J konservatif berfungsi, yang serupa dengan bukan-B-IgG. Ekspresi IgG terkawal TGF-1 dalam sel HK2.

Untuk menyiasat sama ada PTEC menyatakan IgG, IgG pertama kali dikesan dalam sitoplasma, membran sel, dan lumen PTEC dalam korteks buah pinggang manusia biasa oleh imunohistokimia; keputusan menunjukkan bahawa PTEC menghasilkan dan merembeskan IgG. Ini berbeza dengan pemeriksaan patologi rutin kami, di mana tiada IgG yang jelas dikesan dalam PTEC. Ini mungkin disebabkan oleh pewarnaan PTEC yang sangat lemah, yang terlalu rendah untuk dikesan, terutamanya dalam penyakit glomerular yang berkaitan dengan imun di mana Igs sangat positif dalam glomeruli dan pewarnaan PTEC mungkin hilang secara tidak sengaja tetapi secara buatan. Transcytosis IgG daripada peredaran oleh PTEC melalui reseptor Fc sebahagiannya diketepikan, kerana pewarnaan IgG yang jelas oleh RP215 diperhatikan dalam membran sel dan sitoplasma. Penemuan ini mencadangkan bahawa IgG yang diperolehi PTEC adalah serupa dengan bukan-B-IgG lain dan mungkin mempunyai epitop glikosilasi yang unik, yang boleh dikenali secara khusus oleh RP215 dan bukannya antibodi anti-IgG komersial (15). Penemuan bahawa hanya sebahagian daripada sel epitelium tiub mengekspresikan IgG boleh dijelaskan oleh ungkapan dinamik pada kitaran sel yang berbeza, yang serupa dengan corak ekspresi IgA yang diperolehi oleh sel mesangial (18). Co-staining IgG dengan penanda tiub (seperti aquaporin 1 dan aquaporin 3) akan berguna untuk kajian lanjut untuk meningkatkan penemuan kajian ini.

Penjujukan RNA sel tunggal boleh memaparkan dengan jelas transkripsi gen tertentu dalam sel tertentu. Transkrip rantai Ig dan penggabungan semula V(D)J dikesan dalam PTEC tunggal. Walaupun hanya lima PTEC tunggal digunakan, prosesnya adalah ketat kerana korteks buah pinggang dikumpulkan jauh dari tumor, dan setiap sel tunggal diisih mengikut sitometri aliran dengan dua gen penanda khusus PTEC, disahkan semula menggunakan gen penanda khusus ketiga (LRP2) dan pencemaran sel B telah dihapuskan. Hasilnya menunjukkan bahawa PTEC bukan sahaja hadir dengan transkrip gen IgG tetapi juga penggabungan semula V(D)J klasik di rantau pembolehubah sebagai sel B, seperti penggabungan semula V(D)J yang produktif dengan V‑D dan D‑J. simpang (Rajah 4), menunjukkan bahawa PTEC mempunyai potensi untuk menghasilkan IgG. Di samping itu, penggabungan semula V(D)J yang lebih konservatif menggambarkan bahawa PTEC hadir dengan transkrip gen IgG dan penggabungan semula V(D)J yang serupa dengan sel bukan-B yang lain.

HK‑2, talian PTEC yang diabadikan, mudah dikultur dalam kuantiti yang banyak. Kajian ini mengesahkan ekspresi protein IgG dalam sel HK‑2 yang dikultur; IgG dikesan dalam sel HK‑2 oleh kedua-dua immunofluorescence dan western blotting. Ig 4, subkelas Ig, juga dikesan pada saiz jalur yang konsisten dengan berat molekul yang diramalkan. Spektrometri jisim mendedahkan bahawa protein yang disucikan daripada supernatan sel menggunakan protein G mengandungi serpihan rantau pembolehubah rantai berat Ig dan rantai Igκ, memberikan bukti untuk rembesan IgG oleh PTEC. Transkripsi IgG dalam sel HK‑2 seterusnya menyokong ekspresi IgG dalam PTEC, dan penggabungan semula V(D)J konservatif dengan IGHV4‑4/IGHD2‑8/IGHJ5 dalam sel HK‑2 menyokong lagi kehadiran IgG dalam sel HK‑2 yang serupa kepada sel bukan B yang lain.

Kajian ini juga menyiasat mekanisme asas pengeluaran IgG dalam PTEC dengan memeriksa transkripsi RAG1, RAG2, dan AID dalam sel HK‑2. Telah didedahkan bahawa RAG1, RAG2, dan AID telah ditranskripsikan dalam sel HK‑2. Selain itu, transkrip RAG1, RAG2 atau AID sebelum ini telah dikesan dalam banyak sel bukan B lain, seperti podosit (19) dan beberapa garisan sel kanser (23). Keputusan ini mencadangkan bahawa sel bukan B, termasuk PTEC, mungkin mempunyai mekanisme sintesis Ig yang serupa dengan sel B. Walau bagaimanapun, sama ada AID dan/atau RAG1/2 adalah gen yang diperlukan untuk IgG yang diperolehi PTEC memerlukan penyiasatan lanjut. Di samping itu, sel T CD4 pembantu folikel adalah penting untuk mengawal pembezaan sel B pusat germinal ke dalam sel plasma dan menyokong pengeluaran Igs (24). Data kami yang tidak diterbitkan mendedahkan bahawa bukan-B-Ig masih dikesan dalam tikus NOD-SCID yang kekurangan sel T dan B, menunjukkan bahawa bukan-B-Ig tidak bergantung sepenuhnya pada sel pembantu T. Sama ada sel pembantu T diperlukan untuk PTEC untuk mengekspresikan IgG memerlukan penyelidikan lanjut.

TGF-1 mempunyai peranan imunomodulator utama dalam pengeluaran Ig. Sebagai contoh, TGF‑ 1 menyebabkan penukaran dan rembesan kelas IgA dalam sel B yang dirangsang dalam limpa tikus (25) dan sel B tonsil manusia (26). McIntyre et al (27) menunjukkan bahawa TGF‑ 1 merangsang rembesan IgG2b secara selektif oleh sel B yang diaktifkan lipopolysaccharide berkemungkinan besar dengan mendorong suis kelas IgM kepada IgG2b. Duan et al (28) menunjukkan bahawa TGF-1 meningkatkan ekspresi IgA dengan mengawal selia faktor transkripsi Ets-1 dalam sel-sel kanser epitelium. Kajian ini menunjukkan bahawa TGF‑ 1 mengimbangi ekspresi IgG dalam sel HK‑2. Memandangkan hanya IgG yang dikesan dalam sel HK‑2, telah dihipotesiskan bahawa TGF‑ 1 menyebabkan ekspresi IgG bebas daripada penukaran kelas Ig. Mekanisme pengawalseliaan pengeluaran IgG oleh TGF‑ 1 memerlukan siasatan lanjut.

PTEC memainkan peranan penting dalam fibrosis interstisial tiub melalui EMT dan TGF‑ 1 bertindak sebagai pengantara profibrotik induk. Dalam kajian ini, penambahan TGF‑1 kepada sel HK‑2 yang dikultur meningkatkan ekspresi IgG, menunjukkan bahawa IgG yang diperolehi HK‑2 mungkin dikaitkan secara positif dengan EMT. Kajian terdahulu telah melaporkan bahawa kanser-IgG dikaitkan dengan metastasis dan mempromosikan EMT dengan mengurangkan E-cadherin dalam karsinoma kistik adenoid saliva (29) dan kanser paru-paru (30). Perlu disiasat sama ada IgG yang berasal dari PTEC boleh memainkan peranan dalam EMT tubular renal dan fibrosis interstisial di bawah keadaan penyakit, seperti kecederaan iskemia/reperfusi ataupenyakit buah pinggang yang kronik.

Kesimpulannya, sepanjang pengetahuan kami, kajian ini adalah yang pertama menunjukkan bahawa PTEC boleh mengekspresikan dan merembeskan IgG, dan TGF-1 boleh mengimbangi ekspresi IgG dalam sel HK-2. Walau bagaimanapun, potensi peranan IgG yang diperolehi oleh PTEC dalam fibrosis tubulointerstitial memerlukan penyiasatan lanjut.

Kesan cistanche: manfaat buah pinggang

Pembiayaan

Kajian ini disokong oleh geran daripada Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (nombor geran 82070736, 91642109, dan 81870488), Yayasan Sains Semula Jadi Hainan (nombor geran 819QN355), Yayasan Penanaman Penyelidikan Saintifik Universiti Perubatan Hainan (geran no. HYPY201926), dan Projek Sokongan Utama Program Penyelidikan Utama Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan (nombor geran 91642206).

Ketersediaan data dan bahan

Set data yang digunakan dan/atau dianalisis semasa kajian semasa tersedia daripada pengarang yang sepadan atas permintaan yang munasabah.

Sumbangan penulis

Sebagai pengarang yang sepadan, YW dan XQ menyusun dan mereka bentuk kajian itu. ZD mengambil bahagian dalam reka bentuk penyelidikan, melakukan eksperimen histologi dan sel tunggal, menyediakan sampel untuk spektrometri jisim, menganalisis data dan menulis manuskrip. ZJ mengambil bahagian dalam reka bentuk penyelidikan, kebanyakan eksperimen berkenaan ekspresi IgG dalam sel HK‑2, dan analisis data yang berkaitan. YG, JM, HD dan YL melakukan eksperimen barisan sel separa. ZC dan YP memilih kes yang sesuai untuk eksperimen sel tunggal mengikut ciri klinikal. HY dan ZS mengambil bahagian dalam eksperimen sel tunggal. SW mengambil bahagian dalam pewarnaan imunohistokimia, menganalisis data pewarnaan tisu, dan merangka dan menyemak semula manuskrip. YW, ZD dan ZJ mengesahkan ketulenan semua data mentah. Semua pengarang menyemak manuskrip dan menyemak data. Semua pengarang membaca dan meluluskan manuskrip akhir.

Kelulusan etika dan persetujuan untuk mengambil bahagian

Kajian ini mematuhi prinsip Deklarasi Helsinki, dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Perubatan Hospital Ketiga Universiti Peking (no. kelulusan S2020121) dan dijalankan mengikut protokol. Semua penderma secara sukarela menderma korteks buah pinggang dan memberikan persetujuan bertulis secara bertulis sebelum menderma korteks buah pinggang kepada kajian. Semua kaedah telah dijalankan mengikut garis panduan dan peraturan yang berkaitan. Sampel ini dirahasiakan dengan ketat. Serum manusia dan PBMC, digunakan sebagai kawalan positif dalam western blotting atau transkripsi terbalik-PCR dalam kajian ini, diperoleh daripada darah sukarelawan yang sihat, yang memberikan persetujuan bertulis secara bertulis untuk pensampelan.

Kesan cistanche: manfaat buah pinggang

Rujukan

1. Schlondorff DO: Gambaran keseluruhan faktor yang menyumbang kepada patofisiologi penyakit buah pinggang progresif. Int 74 Buah Pinggang: 860‑866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Reseptor seperti tol, immunoproteasome dan sel T kawal selia pada kanak-kanak dengan purpura Henoch‑Schonlein dan nefropati IgA primer. Pediatr Nephrol 29: 1545‑1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer‑Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G, dan Neumann K: Sel epitelium tiub proksimal renal menjalankan fungsi imunomodulator dengan memacu tindak balas sel T CD4 dan sel T yang meradang. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77‑F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL, dan Lan HY: Kecederaan tubul renal: Daya penggerak ke arah penyakit buah pinggang kronik. Int Buah Pinggang 93: 568‑579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C, dan Tomino Y: FcRn-mediated transcytosis immunoglobulin G dalam sel epitelium tiub proksimal buah pinggang manusia. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358‑F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: Kanser epitelium manusia merembeskan immunoglobulin g dengan kekhususan yang tidak dikenal pasti untuk menggalakkan pertumbuhan dan kemandirian sel tumor. Kanser Res 63: 6488‑6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Transkrip gen imunoglobulin mempunyai ciri penggabungan semula VHDJH yang berbeza dalam sel kanser epitelium manusia. J Biol Chem 284: 13610‑13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: IgG dan IgA dengan aktiviti pengikatan mikrob yang berpotensi dinyatakan oleh sel epidermis kulit manusia normal. Int J Mol Sci 16: 2574‑2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X dan Wang B: Immunoglobulin M, molekul baru sel miokardium tikus. Int J Biochem Cell Biol 88: 172‑180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W, dan Gu J: Ungkapan dan pengedaran immunoglobulin G dan reseptornya dalam tapak yang mempunyai keistimewaan imun: Mata. Sel Mol Life Sci 68: 2481‑2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J, dan Qiu XY: Ungkapan gen immunoglobulin dengan susunan semula V‑(D)‑J klasik dalam neuron otak tetikus. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604‑1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C, dan Gu J: Ungkapan dan pengedaran imunoglobulin G dan reseptornya dalam sistem saraf manusia. Int J Biochem Cell Biol 43: 556‑563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W, dan Gu J: Dua corak pengedaran ultrastruktur imunoglobulin G dalam plasenta manusia dan implikasi berfungsi. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P, dan Qiu X: Ekspresi gen imunoglobulin dengan penyusunan semula V‑(D)‑J klasik dalam testis dan epididimis tikus. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Sel karsinoma sel skuamosa paru-paru mengekspresikan IgG tidak glikosilasi secara kanonik yang mengaktifkan isyarat integrin-FAK. Kanser Lett 430: 148‑159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q, dan Zhao Y: Ekspresi tinggi imunoglobulin glikosilasi yang berasal dari kanser meramalkan prognosis yang buruk dalam adenokarsinoma duktus pankreas. J Kanser 11: 2213‑2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q dan Zhao YP: Imunoglobulin G yang berasal dari kanser: Penanda baru untuk diagnosis pembezaan dan ramalan kambuh dalam karsinoma paratiroid. Clin Endokrinol (Oxf) 92: 461‑467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X, dan Wang Y: Ekspresi imunoglobulin A dalam sel mesangial manusia dan kesannya terhadap apoptosis dan lekatan sel. Mol Med Rep 17: 5272‑5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X, dan Wang Y: Ekspresi imunoglobulin G dalam podosit manusia, dan peranannya dalam daya maju dan lekatan sel. Int J Mol Med 41: 3296‑3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Pengasingan dan pencirian model sel epitelium tiub proksimal utama daripada buah pinggang manusia dengan pelabelan berganda CD10/CD13. PLoS One 8: e66750, 2013.