Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Menyelamatkan Defisit AD Dengan Memodulasi Pengaktifan Mikroglia Tetapi Bukan Tekanan Oksidatif

Abstrak: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) telah diasingkan daripada kulat perubatan khusus Taiwan Antrodia camphorate, yang terkenal dengan promosi kesihatan dan anti- kesan penuaan dalam perubatan rakyat. Penyakit Alzheimer (AD) adalah penyakit utama yang berkaitan dengan penuaan. Kami menyiasat keberkesanan dan mekanisme potensi ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol untuk simptom AD. Drosophila dengan overexpression pan-neuronal amiloid manusia- (A ) digunakan sebagai model AD. Kami membandingkan jangka hayat, fungsi motor, pembelajaran, ingatan, tekanan oksidatif dan biomarker pengaktifan mikroglia dan keradangan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol- kumpulan yang dirawat kepada kumpulan kawalan yang tidak dirawat. Ergosta-7,9(11), rawatan 22-trien-3 -ol berkesan meningkatkan jangka hayat, fungsi motor, pembelajaran dan ingatan model AD berbanding kawalan yang tidak dirawat. Penanda bio pengaktifan dan keradangan mikroglia telah dikurangkan, manakala peroksidasi lipid di mana-mana, aktiviti katalase, dan aktiviti superoksida dismutase kekal tidak berubah. Kesimpulannya, ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol menyelamatkan defisit AD dengan memodulasi pengaktifan mikroglia tetapi bukan tekanan oksidatif.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan mempunyai keupayaan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik Pada Faedah Tablet Cistanche

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kata kunci: Penyakit Alzheimer; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-mencuba-3 -ol

1. Pengenalan

Antrodia camphorata ialah kulat perubatan yang unik di Taiwan dan merupakan tanaman ekonomi penting untuk perdagangan luar Taiwan pada abad ke-19 [1]. Buku sejarah pertama Taiwan, Tâi-uân Thong-sú (secara literal Sejarah Am Taiwan), merekodkan penggunaan perubatan asli Antrodia camphorate, termasuk menghapuskan patogen, "meningkatkan kesihatan", "mencergaskan darah", "detoksifikasi alkohol", " melindungi hati", dan "anti-penuaan" [2–4]. Memandangkan kita menghadapi cabaran kesihatan penduduk global akibat penuaan [5], kajian saintifik tentang perubatan orang asli untuk memanfaatkan pengetahuan anti-penuaan adalah penting.

Antara penyakit utama yang berkaitan dengan penuaan, seperti degenerasi makula, aterosklerosis, kanser, dan strok, penyakit Alzheimer (AD) adalah penyakit yang sukar untuk dipecahkan kerana mekanisme patologi yang sukar difahami. Rawatan pengubahsuaian penyakit yang berkesan untuk AD masih tidak tersedia [6]. Hipotesis patologi semasa AD termasuk tetapi tidak terhad kepada, pengurangan dalam choline acetyltransferase, excitotoxicity glutamat, pengagregatan beta amiloid (A), tau fosforilasi, rintangan insulin otak [7], dan pengubahan mikrobiom usus [8]. Walau bagaimanapun, tidak kira jenis punca permulaan AD yang terlibat, tekanan oksidatif dan pengaktifan mikroglia keradangan adalah tanda-tanda biasa yang mengiringi neurodegenerasi AD [9,10]. Menariknya, neuroinflammation dan tekanan oksidatif adalah peristiwa yang saling berkaitan yang kedua-duanya diperhatikan dalam AD dan hipotesis dalam patologi AD. Di satu pihak, plak nyanyuk pemendapan A mencetuskan tindak balas keradangan, pengaktifan mikroglia, pembebasan sitokin dan astrositosis, yang membawa kepada akibat yang tidak diingini seperti kecederaan neuron progresif dan, akhirnya, disfungsi kognitif. Pengaktifan tindak balas imun pada mulanya boleh memerangi patogen yang menyerang dengan A atau menghapuskan deposit A ​​yang berlebihan; bagaimanapun, proses itu pasti menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS), yang boleh menyebabkan kerosakan neuron dalam persekitaran mikro. Sebaliknya, A boleh menyebabkan ROS dalam cara yang bebas keradangan. Sebagai contoh, A ditemui dalam membran mitokondria postmortem AD dan boleh memasuki mitokondria, menyebabkan gangguan rantai pengangkutan elektron (ETC) dan mengakibatkan penjanaan ROS. ROS yang tinggi boleh, seterusnya, mencetuskan pembebasan sitokin dan memulakan keradangan [7,9,10]. Oleh itu, molekul anti-oksidatif dan ant-radang mungkin terapeutik yang berpotensi untuk AD.

Antrodia camphorate, terutamanya salah satu daripada sebatian terpencil keseluruhan kuahnya yang terendam ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (juga dikenali sebagai EK100), mempamerkan antioksida dan anti yang mendalam -aktiviti keradangan [11–13]. Tambahan pula, Chang et al. [14] telah menunjukkan bahawa antroquinonol, sebatian lain yang diasingkan daripada miselium yang ditapai Antrodia camphorate, meningkatkan pembelajaran dan ingatan dalam model tetikus AD dengan penurunan astrogliosis dan tekanan oksidatif. Walau bagaimanapun, hubungan sebab akibat antara pengurangan astrogliosis dan tekanan oksidatif semasa rawatan antroquinonol tidak dapat disahkan, dan penurunan tekanan oksidatif telah didalilkan sebagai faktor pengantara [14]. Keselamatan EK100 telah diuji sebelum ini berikutan Garis Panduan Organisasi untuk Kerjasama dan Pembangunan Ekonomi (OECD) 407 dalam model tikus 10 dan 20 mg/kg-hari [15]. Oleh itu, kami menggunakan kira-kira kepekatan yang setara dengan pemberian makanan percuma untuk lalat buah dalam kajian ini.

Model lalat buah (Drosophila melanogaster) bagi ekspresi berlebihan A 42 ialah model haiwan AD yang mantap [16], dengan gejala AD ciri termasuk jangka hayat yang berkurangan, pembelajaran dan defisit motor [17], tekanan oksidatif [18], dan pengaktifan mikroglial. [19]. Memodelkan cabaran AD dalam Drosophila melanogaster tidak termasuk aktiviti BACE dalam Drosophila dan perbezaan jantina, yang menunjukkan gejala yang lebih teruk dalam fail lelaki. Ini tidak diperhatikan pada manusia AD [20]. Oleh itu, kami menggunakan peptida A 42 manusia yang mengekspresikan lalat untuk memodelkan AD, di mana pengeluaran A 42 tidak memerlukan aktiviti BACE. Dalam kajian ini, kami menguji sama ada EK100 meningkatkan gejala AD, dan yang lebih penting, sama ada kedua-dua modulasi tekanan oksidatif dan astrogliosis adalah penting untuk memperbaiki AD.

2. Keputusan

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Penyelamatan Hidup dan Pendakian AD Drosophila

Diagnosis AD dikaitkan dengan pengurangan jangka hayat median [21], dan hampir separuh daripada pesakit AD mengalami gangguan aktiviti [22]. Oleh itu, kami menguji sama ada ekstrak Antrodia camphorata ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) meningkatkan kemandirian dan keupayaan pendakian Model AD Drosophila. Kami mendapati bahawa rawatan dengan 125 atau 250 µg/mL ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol meningkatkan kemandirian AD Drosophila dengan ketara (p < 0.01) (Rajah 1A dan Jadual Tambahan S1), tetapi hanya dos yang tinggi (250 μg / mL) meningkatkan pendakian AD Drosophila (Rajah 1B). Memandangkan defisit kelangsungan hidup dan mobiliti adalah simptom klinikal AD, kepekatan 250 µg/mL, yang memperbaiki kedua-dua gejala, telah digunakan dalam penyiasatan berikut.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Pembelajaran yang Diselamatkan dan Memori Satu Jam AD Drosophila

Seterusnya, kami menguji sama ada rawatan ergosta{{0}},9(11),22-trien-3 -ol meningkatkan pembelajaran dan kecacatan ingatan, satu gejala khas AD. Lalat AD telah dirawat dengan ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ol pada 250 ug/mL selama 14 hari dan tertakluk kepada ujian pembelajaran dan ingatan dengan T-maze. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, berbanding kawalan jenis liar (AD(-)/EK(-)), keupayaan pembelajaran kawalan AD (AD(tambah)/EK(-)) menurun dengan ketara (p <0.01), manakala rawatan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol dengan ketara meningkatkan keupayaan pembelajaran AD (p < 0.05). Selain itu, ergosta-7,9(11), rawatan 22-trien-3 -ol turut memperbaik memori AD yang merosot selama satu jam (Rajah 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-mencuba-3 -Pengaktifan Mikroglial Termodulat dalam AD Drosophila

Seterusnya, kami menguji sama ada rawatan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol mengurangkan pengaktifan mikroglial dalam AD. Dalam AD, mikroglia yang diaktifkan disertai oleh fagositosis dan neurodegenerasi [23]. Dalam Drosophila, penanda penelan sel mikroglia, dan oleh itu penanda pengaktifan mikroglial, adalah ungkapan draper (Drpr) dan CED hiliran [24]. Selepas rawatan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol, lalat AD telah dimusnahkan dan RNA telah diekstrak daripada kepala lalat untuk RT-qPCR. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3A, kedua-dua Drpr telah dikawal dengan ketara dalam ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol-treated AD Drosophila berbanding AD yang tidak dirawat. Ini menunjukkan bahawa ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol telah mengurangkan pengaktifan mikroglial dalam AD Drosophila. Selain itu, ergosta-7,9(11), rawatan 22-trien-3 -ol juga merendahkan keradangan CNS, seperti yang didedahkan dalam pengawalan rendah gen yang berkaitan dengan keradangan (Rajah 3B) .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-cuba-3 -ol Tidak Memodulasi Tekanan Oksidatif Di mana-mana dalam AD Drosophila

Seterusnya, kami menguji sama ada modulasi tekanan oksidatif di mana-mana—iaitu, seluruh badan—diperlukan untuk ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol untuk menyelamatkan AD. Rawatan Ergosta-7,9(11),22-cuba- 3 -ol tidak mengubah peroksidasi lipid (Rajah 4A), aktiviti katalase (Rajah 4B), aktiviti superoksida dismutase (Rajah 4C) , atau ekspresi gen berkaitan tekanan oksidatif (Rajah

3. Perbincangan

Kajian ini melaporkan keberkesanan dan kemungkinan mekanisme asas ergosta-7,9(11),22- try-3 -ol, ekstrak daripada Antrodia camphorate, untuk pengubahsuaian simptom AD menggunakan Drosophila model dengan ekspresi berlebihan manusia-A. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol secara berkesan meningkatkan pembelajaran dan ingatan serta memanjangkan jangka hayat pesakit dengan AD. Di samping itu, biomarker pengaktifan dan keradangan mikroglia telah dikurangkan, manakala tekanan oksidatif di mana-mana tidak berubah.

Terdapat banyak sumber tekanan oksidatif dalam AD, termasuk tetapi tidak terhad kepada pengaktifan imuniti semula jadi—contohnya, pengumpulan A, gangguan mitokondria oleh A, tau hiperfosforilasi, dan malmetabolisme logam juga merupakan sumber [25]. Walaupun keradangan dan tekanan oksidatif mungkin saling mendorong antara satu sama lain, kita mungkin menganggap bahawa perubahan segeraknya hanya berlaku dalam keadaan di mana sumber tekanan oksidatif lain kekal malar. Walau bagaimanapun, ini tidak berlaku dalam kajian ini. Pengurangan dalam imuniti semula jadi, terutamanya pengaktifan mikroglia, pada masa yang sama, melemahkan sumbangannya kepada pelepasan A , yang mungkin mengakibatkan pengumpulan A. Menariknya, Pengumpulan itu sendiri mencetuskan pengeluaran tekanan oksidatif dalam pelbagai cara. Oleh itu, pengurangan pengaktifan mikroglial dan tindak balas keradangan EK1000 mungkin sebahagiannya melindungi neuron daripada serangan imun di luar sasaran tetapi akan membayar harga pengecilan pelepasan A. Oleh itu, hasil kajian ini mungkin mencerminkan batasan strategi penyasaran mikroglia, sekurang-kurangnya dalam model AD Drosophila.

Sistem imun semula jadi yang dimediasi mikroglia digambarkan sebagai pedang bermata dua dalam penyakit neurodegeneratif, terutamanya AD [26,27]. Mikroglia yang diaktifkan cuba membuang patogen toksik seperti A, tetapi tidak dapat tidak menyebabkan kerosakan neuron dalam persekitaran mikro. Keunggulan 250 µg/mL EK100 dalam masa 35 hari mungkin membayangkan bahawa strategi menurunkan pengaktifan mikroglia adalah terhad pada peringkat patologi, sekurang-kurangnya dalam kes model AD lalat buah. Selain itu, penurunan ketara biomarker untuk pengaktifan mikroglial dan tindak balas keradangan telah gagal diterjemahkan ke dalam peningkatan yang sama ketara dalam kelangsungan hidup, dan fungsi CNS sebahagiannya boleh dijelaskan oleh ciri pedang bermata dua mikroglia. Ini menunjukkan bahawa pengaktifan mikroglia bukanlah satu-satunya atau faktor yang mendominasi kemajuan AD. Pengaktifan mikroglial yang lebih rendah juga membayangkan bahawa degradasi A yang terlalu tertekan telah dimatikan sebahagiannya dalam model lalat buah, yang mungkin juga menjelaskan kematian yang lebih tinggi untuk kepekatan EK100 yang lebih tinggi antara umur 35 dan 52 hari.

Antroquinonol, ekstrak lain dari Antrodia camphorate, telah dilaporkan untuk keberkesanannya dalam rawatan tikus AD, yang mana penurunan tekanan oksidatif telah didalilkan sebagai faktor pengantara [14]. Oleh itu, ini mungkin membayangkan bahawa antroquinonol dan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol meningkatkan gejala AD melalui laluan bebas, masing-masing menjadi pengantara tekanan oksidatif atau tidak. Oleh itu, adalah menarik untuk menguji sama ada rawatan bersama dengan antroquinonol dan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol akan mempunyai kesan sinergitik pada peningkatan AD.

Untuk peringkat awal AD, fokus utama reka bentuk ubat adalah menghapuskan pemendapan A, (seperti dalam aducanumab antibodi monoklonal yang diluluskan baru-baru ini, walaupun terdapat kontroversi mengenai faedah klinikal yang minimum dan ketidakberkesanan dalam salah satu daripada dua ujian klinikal fasa III. [29]), atau percubaan untuk meningkatkan pengambilan mikroglial A [30-32]. Walau bagaimanapun, untuk peringkat sederhana atau lanjutan AD, pengaktifan berlebihan mikroglia sebaliknya memburukkan neurodegenerasi [33], dan oleh itu strategi terapeutik alternatif diperlukan.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Penyelenggaraan Stok Lalat dan Pengukuran Jangka Hayat

Strain Drosophila transgenik A H29.3/CyO diperoleh daripada [16] dan telah dikalahkan dengan w(CS10) selama enam generasi. Garisan elav-GAL4c155 pemacu pan-neural telah diatasi dengan w(CS10) selama enam generasi. Garisan mata putih w1118 (Pusat Saham Bloomington Drosophila #3605) yang bersilang dengan garisan Canton S (Pusat Saham Bloomington Drosophila # 64349) 10 kali (w (CS10)) digunakan sebagai stok standard. Barisan elav-GAL4c155 pemacu pan-neural diperoleh daripada Pusat Saham Bloomington Drosophila (#458). Genotip lalat eksperimen—iaitu, model AD—ialah [elav; H29.3/ tambah ], yang dipilih daripada keturunan F1 tanpa penanda CyO. Lalat dikekalkan dalam media standard tepung jagung pada suhu 25 ◦C di bawah kitaran terang-gelap 12 jam. Untuk T-maze, [elav; H29.3/ plus ] lalat dikumpul (kedua-dua jantina bercampur dan bukan dara) dan dibiakkan dengan atau tanpa rawatan EK100 sehingga d14 selepas kemunculan. Untuk kelangsungan hidup, pendakian, dan RT-qPCR, hanya lalat jantan digunakan. Sampel RNA dikumpul pada d30 selepas kemunculan apabila kedua-dua jangka hayat dan lengkung pendakian menunjukkan pemisahan yang ketara berbanding model AD yang tidak dirawat.

Dalam analisis jangka hayat, dua puluh hingga tiga puluh lalat diternak dalam botol makanan dengan atau tanpa CS; sekurang-kurangnya empat botol disediakan untuk setiap rawatan. Botol makanan diganti setiap 2 hingga 3 hari, dan lalat mati dikira pada masa itu. Sekurang-kurangnya tiga ulangan telah dijalankan setiap percubaan. Peratusan kelangsungan hidup ditakrifkan sebagai bilangan lalat hidup dibahagikan dengan jumlah bilangan lalat pada permulaan ujian.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol telah diekstrak daripada hadiah baik daripada Antrodia camphorata, seperti yang diterangkan sebelum ini [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol membentuk serbuk warna kuning muda pada suhu bilik. Larutan stok telah disediakan pada kepekatan 6.25 mg/mL dalam EtOH sejurus sebelum digunakan. Untuk ujian jangka hayat dan anti-geotaxis, kepekatan akhir ialah 125 dan 250 µg/mL. Untuk pembelajaran memori dan ujian ekspresi gen, kepekatan akhir ialah 250 µg/mL. Berat molekul EK100 ialah 396.65. Jadi kepekatan molar yang sepadan ialah 315 atau 630 µM, masing-masing. Lalat dirawat dengan dua dos EK100 dengan kepekatan akhir 125 dan 250 µg/mL yang dicampurkan dalam makanan dengan pemberian makanan secara Ad libitum. Makanan kawalan mengandungi jumlah pelarut EtOH yang sama seperti kumpulan eksperimen dengan kepekatan EtOH akhir 3 peratus v/v. Rawatan bermula dari kemunculan sehingga titik masa pengumpulan data setiap ujian. Untuk ujian kelangsungan hidup dan memanjat, rawatan diberikan sepanjang hayat. Bilangan lalat untuk setiap replikasi diterangkan dalam bahagian kaedah setiap ujian. Kami juga menguji ujian jangka hayat dengan lalat jenis liar yang dirawat/tidak dirawat untuk memastikan keselamatan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol dalam model lalat (Tambahan Rajah S1 ).

4.3. Ujian Antigeotaxis

Protokol sekarang adalah berdasarkan kaedah yang diterbitkan sebelum ini [35], dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, vial plastik silinder lutsinar dengan diameter 2.5 cm dan ketinggian 9.5 cm (lebih panjang akan baik, tetapi akan lebih sukar untuk dikendalikan) digunakan sebagai radas geotaksis. Bahagian bawah vial disalut dengan satu lapisan makanan lalat sebagai kusyen. Tanda 5 cm di atas kusyen telah dilekatkan pada permukaan luar vial. Hujung botol yang satu lagi terbuka, dan lalat dimuatkan dari sana. Memandangkan ujian dijalankan serentak dengan ujian survival, bilangan lalat yang dimuatkan adalah sama dengan lalat yang masih hidup pada masa itu. Lalat telah dimuatkan ke dalam botol; bahagian atas ditutup dengan penutup dan bahagian bawah vial berulang kali (selama dua saat) diketuk pada permukaan keras di mana ia berdiri (bangku makmal dalam kes ini). Ketukan itu cukup kuat untuk mengejutkan lalat dan membuat mereka memanjat di sepanjang dinding botol, tetapi tidak begitu kuat untuk mencederakan mereka secara fizikal. Seluruh proses telah dirakam video selama 18 saat, dengan bilangan lalat yang memanjat melebihi tanda 5 cm dicatatkan dan dinyatakan sebagai peratusan bagi setiap kumpulan. Bilangan lalat yang memanjat melebihi tanda 5 cm dikira. Empat ulangan telah dijalankan untuk setiap kumpulan. Peratusan kebolehan memanjat ditakrifkan sebagai bilangan lalat yang memanjat dibahagikan dengan jumlah bilangan lalat pada permulaan ujian. Keupayaan mendaki juga diuji dalam lalat jenis liar yang dirawat/tidak dirawat untuk memastikan keselamatan ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol dalam model lalat (Tambahan Rajah S2) .

4.4. Platform Pembelajaran dan Memori Drosophila (T-Maze)

Untuk memerhatikan pembelajaran dan ingatan Drosophila, kira-kira 100 lalat pertama kali diletakkan di ruang cupper atas, yang boleh dibekalkan dengan voltan elektrik dan menghantar kejutan elektrik kepada lalat. Lalat pertama kali dihantar dalam bau 1 (MCH) bersama-sama dengan gelombang kejutan elektrik. Kemudian lalat dihantar bau 2 (OCT) tanpa gelombang kejutan elektrik. Selepas latihan, lalat telah dialihkan ke ruang di bawah, di mana dua bahagian terbuka dibekalkan dengan bau 1 atau bau 2, masing-masing. Dengan memerhatikan arah pergerakan lalat, berat sebelah bau 2 terhadap bau 1 boleh dianggarkan dengan Indeks Prestasi (PI), ditakrifkan sebagai perbezaan bilangan lalat antara dua bau dibahagikan dengan jumlah bilangan lalat. Indeks Prestasi mewakili keupayaan pembelajaran dan ingatan Drosophila [36]. Satu lagi kumpulan lalat telah dikondisikan dengan pasangan bau terbalik supaya setiap bau berfungsi satu kali sebagai kejutan elektrik ditambah dan satu kali sebagai kejutan elektrik −. PI bagi kedua-dua ujian ini dipuratakan sebagai PI akhir bagi satu replika. "1 h-memori" diuji selepas jarak 1 jam untuk latihan, manakala "pembelajaran", sebaliknya, diuji selepas jarak 1.5 minit untuk latihan. Kami juga menguji pengelakan MCH dan OCT lalat AD dengan atau tanpa rawatan EK100 untuk memastikan bahawa rawatan itu menyebabkan berat sebelah terhadap bau aversive (Tambahan Rajah S3).

4.5. PCR kuantitatif

Kepala dan badan dipisahkan sebelum pengekstrakan RNA. Untuk satu replika, lalat telah dibius dengan CO2; dikumpul, 100 pada satu masa, dalam tiub Eppendorf; dan kemudian direndam dalam nitrogen cecair selama 1 minit untuk membuat badan rapuh. Mayat beku yang terhasil kemudiannya dimuatkan ke dalam timbunan penggoncang ayak (Bunsekifurui, No. 40 dan No. 25) dan digoncangkan. Mayat pecah dan disusun mengikut saiz jerat ayak kepada dua pecahan berasingan: "kepala" dan "badan". Jumlah RNA telah diekstrak dengan kit Mini RNeasy (Qiagen, Düsseldorf, Jerman), dan kemudian digunakan untuk mensintesis cDNA dengan Kit Sintesis cDNA VersoTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Tahap ekspresi RNA gen yang disiasat dikira oleh PCR masa nyata (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dengan Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Keputusan telah dinormalisasi kepada jumlah relatif Gapdh atau Rpl32. Primer yang digunakan disenaraikan di bawah. Gapdh: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 dan 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 dan 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 dan 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Kucing: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 dan 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 dan 50 -CGGTCTGCTTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 dan 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 dan 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 dan 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 dan 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 dan 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 dan 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 dan 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 dan 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; keseronokan: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 dan 50 -TCTCCCTTCTCCCG gatACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 dan 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Ujian Tekanan Oksidatif

Tiga replika peroksidasi lipid, aktiviti katalase dan aktiviti dismutase superoksida telah diukur oleh BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, Amerika Syarikat), Kit Ujian Catalase (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI , USA), dan Kit Ujian Superoxide Dismutase (Cayman), mengikut arahan pengilang. Secara ringkas, aktiviti SOD dinilai dengan mengukur dismutasi radikal superoksida yang dihasilkan oleh xanthine oxidase yang dibekalkan kit dan dikesan dengan mengubah garam tetrazolium menjadi pewarna formazan, kemudian dikira dengan penyerapan pada 440-460 nm. Aktiviti CAT dinilai dengan mengukur pembentukan formaldehid daripada metanol dengan kehadiran H2O2 yang dimangkin oleh CAT, dikesan oleh 4-amino-3- hydrazino-1 kromogenik yang dibekalkan kit-5-mercapto-1 ,2,4-triazole, kemudian dikira dengan penyerapan pada 540 nm. Aktiviti peroksidasi lipid dinilai dengan mengukur penguraian asid lemak tak tepu peroksida kepada malonaldehid (MDA) dan 4-hidroksialkenal, yang dikesan oleh N-metil{17}}fenilindole kromogenik yang dibekalkan kit, kemudian dikira dengan penyerapan pada 586 nm. Untuk ujian SOD, Cat dan LPO, bilangan keseluruhan lalat homogen bagi setiap replika ialah 50, 50 dan 100, masing-masing.

4.7. Analisis Statistik

Kepentingan perbezaan antara lengkung kelangsungan hidup dan lengkung pendakian bagi kumpulan ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol yang dirawat dan kawalan dinilai mengikut peringkat log (Mantel– Cox) dan ujian Gehan-Breslow-Wilcoxon. Kepentingan perbezaan antara indeks prestasi memori pembelajaran ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol treated dan kumpulan kawalan dinilai oleh ujian-t Pelajar.

5. Kesimpulan

Kami mengesahkan bahawa ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) daripada Antrodia camphorate meningkatkan kemandirian, pembelajaran dan ingatan dalam model Drosophila AD, dengan penanda bio yang dikurangkan pengaktifan mikroglia dan keradangan. Selain itu, pengubahsuaian gejala tidak berlaku melalui pengurangan tegasan oksidatif di mana-mana, yang bermaksud bahawa ergosta-7,9(11), dan 22-trien-3 -ol memperbaiki simptom AD melalui laluan yang berbeza kepada yang lain. Ekstrak Antrodia camphorate, antroquinonol. EK100 berkesan mengurangkan pengaktifan dan keradangan mikroglial, yang boleh membantu membalikkan defisit kognitif yang berkaitan AD biasa, seperti pembelajaran dan defisit ingatan.

Bahan Tambahan:Yang berikut boleh didapati dalam talian. Rajah S1: Kemandirian lalat jenis liar yang dirawat dengan EK100; Rajah S2: Memanjat lalat jenis liar yang dirawat dengan EK100; Rajah S3: Pengelakan bau busuk lalat AD yang dirawat dengan EK100; Jadual S1: Statistik lengkung kemandirian.

Sumbangan Pengarang:H.-PL, Y.-HK dan W.-YL mereka bentuk eksperimen. Y.-HK menyumbang kepada penyediaan EK100. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS dan T.-NC melakukan eksperimen. Semua penulis mengambil bahagian dalam penyediaan manuskrip. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Kerja ini disokong oleh geran daripada Kementerian Sains dan Teknologi di Taiwan (PALING 108-2320-B-039-031-MY3, PALING 109-2314-B-039-030, PALING 110-2314- B-039-009), Universiti & Hospital Perubatan China (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, ANUGERAH109- CMU-02 dan DMR-109-150), dan daripada Program Pusat Penyelidikan Kawasan Pilihan dalam rangka Projek Tunas Pendidikan Tinggi oleh Kementerian Pendidikan (KPM) di Taiwan (CMRC-CHM-2-1).

Penyata Lembaga Semakan Institusi:Tidak berkaitan.

Kenyataan Persetujuan Termaklum:Tidak berkaitan.

Penyata Ketersediaan Data:Data yang digunakan untuk menyokong dapatan kajian ini disertakan dalam artikel.

Konflik Kepentingan:Y.-HK ialah salah seorang pencipta tetapi bukan penerima serah hak paten AS-9757393-B2 bertajuk "Terbitan ergostatrien-3- -ol daripada aniridia camphorate dan anti glisemik, antihiperlipidemik dan penggunaan lemak hepatik yang berkurangan daripadanya". Pengarang lain mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai kepentingan bersaing. Pembiaya tidak mempunyai peranan dalam reka bentuk kajian; dalam pengumpulan, analisis, atau tafsiran data; dalam penulisan manuskrip, atau dalam keputusan untuk menerbitkan hasilnya.

Ketersediaan Sampel:Sampel sebatian boleh didapati daripada pengarang.

Rujukan

1. Davidson, JW The Island of Formosa, Dahulu dan Sekarang: Sejarah, Orang, Sumber, dan Prospek Komersial. Teh, Kapur barus, Gula, Emas, Arang Batu, Sulfur, Tumbuhan Ekonomi dan Pengeluaran Lain; Macmillan & Syarikat: New York, NY, Amerika Syarikat, 1903.

2. Tsai, Z.; Liaw, S. Penggunaan dan Kesan Ganoderma; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Taiwan, 1985; ms 116–117.

3. Chen, C.-J. Kajian tentang penanaman pepejal dan bioaktiviti Antrodia camphorata. Fung. Sci. 2001, 16, 65–72.

4. Geethangili, M.; Tzeng, Y.-M. Kajian semula kesan farmakologi Antrodia camphorate dan sebatian bioaktifnya. Pelengkap Berasaskan Evid. Altern. Med. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ogura, S.; Jakovljevic, MM Penuaan penduduk global-penjagaan kesihatan, akibat sosial dan ekonomi. Depan. Kesihatan Awam 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Cummings, J.; Lee, G.; Ritter, A.; Zhong, K. Paip pembangunan ubat penyakit Alzheimer: 2018. Demen Alzheimer. Terjemahan Res. Clin. Interv. 2018, 4, 195–214. [CrossRef] [PubMed]

7. Sharma, P.; Srivastava, P.; Seth, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Kajian menyeluruh mekanisme patogenesis yang terlibat dalam penyakit Alzheimer dan strategi terapeutik yang berpotensi. Prog. Neurobiol. 2019, 174, 53–89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sochocka, M.; Donskow-Łysoniewska, K.; Diniz, BS; Kurpas, D.; Brzozowska, E.; Leszek, J. Perubahan mikrobiom usus dan patogenesis penyakit Alzheimer yang didorong oleh keradangan—Tinjauan kritikal. Mol. Neurobiol. 2019, 56, 1841–1851. [CrossRef]

9. Agostinho, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Neuroinflammation, tekanan oksidatif dan patogenesis penyakit Alzheimer. Curr. Pharm. Des. 2010, 16, 2766–2778. [CrossRef]

10. Galasko, D.; Montine, TJ Biomarker kerosakan oksidatif dan keradangan dalam penyakit Alzheimer. Biomark. Med. 2010, 4, 27–36. [CrossRef]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Awak, Y.-J.; Wen, K.-C.; Sung, P.-J.; Chiang, H.-M. Kesan antiradang dan antifotomerosakkan ergostatrien-3 -ol, diasingkan daripada Antrodia camphorata, pada kulit tikus tanpa bulu. Molekul 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Chao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Hsu, S.-M.; Wan, C.-H.; Lian, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ol (EK100) daripada Antrodia camphorata Melemahkan Tekanan Oksidatif, Keradangan dan Kecederaan Hati In Vitro dan In Vivo. Sebelum Nutr. Sains Makanan. 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tung, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Liao, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Chen, H.-L.; Chen, C.-M. Kesan Anti-Radang Antrodia camphorata dan Sebatian Aktifnya, Ergostatrien-3 -ol, dalam Model Iskemia Kulit Tikus. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Chang, W.-H.; Chen, MC; Cheng, IH Antroquinonol merendahkan paras amiloid otak dan meningkatkan pembelajaran dan ingatan spatial dalam model tikus transgenik penyakit Alzheimer. Sci. Rep. 2015, 5, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Hsu, Y.-J.; Huang, C.-C.; Liang, H.-L. Kesan Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol daripada Antrodia camphorate pada Profil Biokimia dan Prestasi Senaman Tikus. Molekul 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkar, A.; Lagu, H.-J.; Yang, H.; Konsolaki, M. Model untuk mengkaji ketoksikan akibat Alzheimer A 42-dalam Drosophila melanogaster. Mol. sel. Neurosci. 2004, 26, 365–375. [CrossRef] [PubMed]

17. Ping, Y.; Hahm, E.-T.; Waro, G.; Lagu, Q.; Vo-Ba, D.-A.; Licursi, A.; Bao, H.; Ganoe, L.; Finch, K.; Tsunoda, S. Menghubungkan 42-keterujaan yang disebabkan oleh kemerosotan saraf, pembelajaran dan defisit motor serta jangka hayat yang lebih pendek dalam model Alzheimer. Genet PLoS. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Saingan, T.; Muka surat, RM; Chandraratna, DS; Sendall, TJ; Ryder, E.; Liu, B.; Lewis, H.; Rosahl, T.; Hider, R.; Camargo, L. Fenton kimia dan tekanan oksidatif menengahi ketoksikan peptida -amyloid dalam model Drosophila penyakit Alzheimer. Eur. J. Neurosci. 2009, 29, 1335–1347. [CrossRef]

19. Ray, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial draper menyelamatkan ketoksikan dalam model Drosophila bagi penyakit Alzheimer. J. Neurosci. 2017, 37, 11881–11893. [CrossRef]

20. Jeibmann, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster sebagai organisma model penyakit otak. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 407–440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brookmeyer, R.; Corrada, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Survival berikutan diagnosis penyakit Alzheimer. Gerbang. Neurol. 2002, 59, 1764–1767. [CrossRef]

22. Lam, LC; Tang, W.; Leung, V.; Chiu, HF Profil tingkah laku penyakit Alzheimer dalam warga tua Cina–kajian pengesahan versi Cina bagi skala penilaian patologi tingkah laku penyakit Alzheimer. Int. J. Geriatr. Psik. 2001, 16, 368–373. [CrossRef] [PubMed]

23. Schwab, C.; McGeer, PL Aspek keradangan penyakit Alzheimer dan gangguan neurodegeneratif lain. J. Alzheimer's Dis. 2008, 13, 359–369. [CrossRef] [PubMed]

24. MacDonald, JM; Pantai, MG; Porpiglia, E.; Sheehan, AE; Watt, RJ; Freeman, MR Reseptor penelan mayat sel Drosophila Draper mengantara pelepasan glial bagi akson yang terputus. Neuron 2006, 50, 869–881. [CrossRef]

25. Chen, Z.; Zhong, C. Tekanan oksidatif dalam penyakit Alzheimer. Neurosci. lembu jantan. 2014, 30, 271–281. [CrossRef]

26. Stankovic, ND; Teodorczyk, M.; Ploen, R.; Zipp, F.; Schmidt, MH Interaksi saluran darah Microglia: Pedang bermata dua dalam patologi otak. Acta Neuropathol. 2016, 131, 347–363. [CrossRef]

27. Konishi, H.; Kiyama, H. Microglial TREM2/DAP12 isyarat: Pedang bermata dua dalam penyakit saraf. Depan. sel. Neurosci. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Chiao, P.; Bussière, T.; Weinreb, PH; Williams, L.; Maier, M.; Dunstan, R.; Salloway, S.; Chen, T.; Ling, Y. Antibodi aducanumab mengurangkan plak A dalam penyakit Alzheimer. Alam 2016, 537, 50–56. [CrossRef]

29. Lalli, G.; Schott, JM; Hardy, J.; De Strooper, B. Aducanumab: Fasa baru dalam pembangunan terapeutik untuk penyakit Alzheimer? EMBO Mol. Med. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fujikawa, Y.; Maelicke, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Galantamine-induced amyloid- clearance diantar melalui rangsangan reseptor asetilkolin nikotinik mikroglial. J. Biol. Kimia. 2010, 285, 40180–40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekar-Colucci, S.; Karlo, JC; Landreth, GE Mekanisme yang mendasari reseptor diaktifkan proliferator peroksisom pantas- -pengantara pelepasan amiloid dan pembalikan defisit kognitif dalam model murine penyakit Alzheimer. J. Neurosci. 2012, 32, 10117–10128. [CrossRef]

32. McGeer, PL; McGeer, EG Menyasarkan mikroglia untuk rawatan penyakit Alzheimer. Pendapat Pakar. Di sana. Sasaran 2015, 19, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

33. Lagu, WM; Colonna, M. Identiti dan fungsi mikroglia dalam neurodegeneration. Nat. Immunol. 2018, 19, 1048–1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Shih, C.-C. Ergostatrien-3 -ol daripada Antrodia camphorata menghalang diabetes dan hiperlipidemia dalam tikus yang dirawat dengan diet tinggi lemak melalui pengawalan gen berkaitan hepatik, pengangkut glukosa 4 dan fosforilasi protein kinase yang diaktifkan AMP. J. Agric. Kimia Makanan. 2015, 63, 2479–2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Lints, FA Hipergraviti dan penuaan dalam Drosophila melanogaster. 4. Aktiviti mendaki. Gerontologi 1992, 38, 59–64. [CrossRef]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Flies, gen dan pembelajaran. Ann. Rev. Neurosci. 2001, 24, 1283–1309. [CrossRef] [PubMed]

【Untuk maklumat lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】