Kesan Glyeosides Of Cistanche Pada Pembelajaran Kognisi dan Keplastikan Sinaptik dalam Model Kurang Tidur Tikus

ABSTRAK

Objektif:Untuk meneroka sama ada glikosida cistanche boleh meningkatkan pembelajaran dan fungsi kognitif tikus model kekurangan tidur dengan mengawal keplastikan sinaptik.

Kaedah: Lima puluh ekor tikus Wistar jantan dibahagikan secara rawak kepada kumpulan kawalan kosong ( Kawalan), kumpulan kawalan platform ( PC ), kumpulan model ( Model ),glikosida kumpulan cistanche (GCs), dan kumpulan estazolam ( Est ). Model kekurangan tidur tikus telah disediakan oleh kaedah persekitaran air berbilang platform yang diubah suai. Maze air Morris dan ujian medan terbuka digunakan untuk mengesan fungsi kognitif spatial dan perubahan emosi tikus. Pewarnaan Nissl digunakan untuk melihat perubahan dalam morfologi dan kuantiti sel saraf dalamkawasan CAl hippocampal tikus. Western blot dan R'T - PCR digunakan untuk mengesan tahap ekspresi synaptophysin(SY'N), bahan padat membran pascasinaptik 95 ( PSD -95 ), danfaktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF). 

Keputusan;Keputusan maze air Morris menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan Kawalan, yangpembelajaran dan keupayaan kognitif tikusdalam kumpulan Model telah menurun dengan ketara (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasrawatan GC yang lebih baik ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the tahap ekspresi protein dan gen BDNF, SYN dan JPA -95dalam kumpulan Mlodel telah menurun dengan ketara ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

TAMBAHAN FORMULASI HERBA CISTANCHE UNTUKMENINGKATKAN PEMBELAJARAN DAN FUNGSI KOGNITIF

KATA KUNCIGlikosida cistanche; Hippocampus; Kurang tidur; Pembelajaran dan ingatan; Kebimbangan; Keplastikan sinaptik

Gangguan tidur (SD)ialah agangguan fungsi tidur yang tidak normaldisebabkan oleh beberapa siri faktor kompleks sepertiinsomnia, termenung, danmudah terjaga. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini,kejadian SDtelah meningkat secara beransur-ansur. Kajian berkaitan telah melaporkan bahawa SD boleh menyebabkanpenyakit kardiovaskular,disfungsi metabolik,penyakit imun, dansistem saraf pusatpenyakit degeneratif seperti penyakit Alzheimer [1]. SD boleh menyebabkan kerosakan oksidatif pada neuron hippocampal, menyebabkan disfungsi kognitif, dan menghasilkan perubahan mood seperti kebimbangan dan kemurungan [2]. Cistanche deserticola adalah bahan perubatan berharga yang boleh digunakan sebagai ubat dan makanan di China. Ia mempunyai kesan mengencangkan buah pinggang dan menambah qi, melembapkan usus yang menggalakkan pergerakan usus, dan menguatkan yang. Ekstrak utama Cistanche deserticola, glikosida cistanche (GCs), mempunyai kesan antioksidan, anti-apoptosis, melindungi hati, dan neuroprotektif [3]. Kajian terdahulu kami mendapati bahawa GC boleh meningkatkan pembelajaran dan fungsi kognitif tikus SAMP8 dengan memainkan peranan antioksidan dan anti-apoptosis [4].

Kajian berkaitan telah menunjukkan bahawa disfungsi kognitif yang disebabkan oleh SD berkait rapat dengan keplastikan sinaptik [5]. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa laporan mengenai mekanisme yang mana GC mengawal keplastikan sinaptik dan meningkatkan pembelajaran dan kemerosotan ingatan dan penurunan kognitif pada tikus yang disebabkan oleh kekurangan tidur. Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk meneroka sama ada GC mempengaruhi keplastikan sinaptik dengan mengawal selia ekspresi penanda berkaitan sinaptik, dengan itu meningkatkan pembelajaran dan fungsi kognitif tikus dengan model kurang tidur, dan menyediakan idea dan rancangan rawatan baharu untuk GC untuk merawat pembelajaran dan kognitif. kemerosotan yang disebabkan oleh gangguan tidur.

1 Bahan dan kaedah

1.1 Haiwan eksperimen

Tikus Wistar jantan berumur 6 hingga 8 minggu, seberat 280 hingga 300 g, telah dibeli dari Beijing Sibeifu, dengan lesen pengeluaran haiwan [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Semua haiwan disimpan di Pusat Eksperimen Haiwan Kolej Perubatan Baotou di bawah keadaan berikut: suhu (24 ± 1) darjah , kelembapan 50% hingga 55%, 12 jam terang dan 12 jam gelap, dan tiada sekatan ke atas makanan dan air. Eksperimen ini telah diluluskan oleh jawatankuasa etika sekolah [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1. 2 Reagen dan instrumen utama

Jumlah glikosida Cistanche deserticola telah dibeli daripada Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (nombor kelompok: KSM20220609011); Tablet Estazolam telah dibeli daripada CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (nombor kelompok: 044220343); penimbal pemuatan protein (P1015), penimbal lisis RIPA (R0010), larutan chemiluminescent (PE0010), dll. semuanya dibeli dari Beijing Solebao; bahan ketumpatan postsynaptic dalam antibodi 95 (PSD-95) (AB192757) dan antibodi synaptophysin (SYN) (ab32127) telah dibeli daripada Syarikat Abcam, USA; faktor neurotropik terbitan otak (BDNF) (48503-2) dan -actin (52901) telah dibeli daripada Syarikat SAB, Amerika Syarikat; antibodi sekunder IgG anti-arnab kambing (SA00001-20) telah dibeli daripada Syarikat Proteintech, Amerika Syarikat; melatonin tikus (MT) dan Kit Penyelidikan Saintifik ELISA (MM-0657R1) telah dibeli daripada Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Alat penghiris parafin (Leica, Jerman); mikroskop optik (Leica, Jerman);

Maze air Morris, kotak ujian medan terbuka (Shanghai Xinruan); radas elektroforesis menegak (Beijing Liuyi Company); penggoncang penyahwarnaan (Syarikat Beijing Liuyi); sistem analisis pengimejan protein (Shanghai Tanon Technology); instrumen PCR kuantitatif pendarfluor (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Kaedah eksperimen

1.3.1 Pengelompokan haiwan dan pentadbiran dadah

50 tikus Wistar jantan dibahagikan secara rawak kepada kumpulan kawalan kosong (Kumpulan kawalan), kumpulan kawalan platform (kawalan bentuk plat, kumpulan PC), kumpulan model (Kumpulan model), jumlah glikosida kumpulan Cistanche deserticola (kumpulan GCs , 50 mg/kg), dan kumpulan estazolin (kumpulan Est, 0.54 mg/kg), dengan 10 tikus dalam setiap kumpulan. Kumpulan Kawalan dan kumpulan PC diberi 0.9% garam secara gavage. Semua kumpulan telah digavage pada pukul 7 pagi setiap hari selepas pemodelan bermula, dan gavage berlangsung selama 21 hari.

1.3. 2. Penyediaan model haiwan kurang tidur

Model kekurangan tidur telah ditubuhkan menggunakan kaedah persekitaran air berbilang platform yang diubah suai [6]. Peralatan eksperimen ialah tangki air resin polietilena segi empat tepat 130 cm × 50 cm × 45 cm. Sebuah pelantar kecil berdiameter 5 cm dan ketinggian 20 cm diletakkan di dalam tangki air. Platform kumpulan PC mempunyai diameter 10 cm dan ketinggian 20 cm. Tangki air diisi dengan air hingga kedalaman kira-kira 18 cm dan suhu air dikekalkan pada (20 ± 1) darjah . Seminggu sebelum permulaan eksperimen, tikus diletakkan di dalam kotak kekurangan tidur setiap hari selama 60 minit untuk membiasakan diri dengan persekitaran. Selepas model itu diwujudkan, kecuali kumpulan Kawalan, tikus setiap kumpulan diletakkan di atas pelantar kecil pada masa dari 8 pagi hingga 8 malam setiap hari untuk kurang tidur selama 21 hari berturut-turut.

Semua tikus mempunyai akses percuma kepada makanan dan air dan bergerak bebas di atas platform. Kitaran terang dan gelap adalah 12 jam setiap hari.

1. 3. 3 Eksperimen maze air Morris

Maze air Morris dibahagikan kepada 4 kawasan, diisi dengan air, dan platform diletakkan di kuadran ke-4. Permukaan air adalah kira-kira 2 cm di atas pelantar. Melanin boleh dimakan gred makanan telah ditambah ke dalam air, dan suhu air dikekalkan pada (25 ± 1) darjah . (1) Eksperimen navigasi penentududukan: Pusat setiap kawasan telah dipilih dan tikus diletakkan perlahan-lahan di dalam air. Mereka dibenarkan meneroka dengan bebas. Masa yang diambil untuk tikus mencari platform sasaran dalam masa 60 saat telah direkodkan. Tikus yang tidak menemui platform telah dibimbing ke platform dan tinggal selama 20 saat. Latihan diteruskan selama 5 hari. (2) Ujian penerokaan ruang: Pada hari ke-6, pelantar telah dikeluarkan dan tikus diletakkan di dalam air dari tengah kuadran ke-2 menentang dinding. Bilangan kali tikus melepasi pelantar dalam masa 120s dan masa mereka tinggal di kuadran ke-4 direkodkan.

1. 3. 4 Eksperimen lapangan terbuka

Sebuah kotak eksperimen berukuran 100 cm × 100 cm × 50 cm telah digunakan, dan bahagian bawah kotak itu dibahagikan kepada 9 grid. Setiap kumpulan tikus diletakkan di dalam bilik eksperimen padang terbuka terlebih dahulu untuk menyesuaikan diri dengan persekitaran dalaman selama 60 minit. Pada permulaan eksperimen, tikus ujian diletakkan di sudut tetap kotak eksperimen medan terbuka secara bergilir-gilir, dan bilangan masa berdiri, jarak pergerakan, dan masa statik tikus dalam masa 5 minit telah direkodkan menggunakan perisian analisis tingkah laku. Persekitaran dikehendaki senyap semasa eksperimen, dan peranti eksperimen masing-masing disapu dengan air dan alkohol antara dua eksperimen untuk mengelakkan bau tikus pertama daripada menjejaskan pertimbangan tingkah laku tikus seterusnya.

1. 3. 5 Ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA)

Pengesanan tahap MT serum dalam tikus Tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal, dan 5 mL darah dikumpulkan dari aorta abdomen. Selepas menunggu selama 30 minit pada suhu bilik, darah disentrifugasi untuk mendapatkan serum. 40 μL pelarut sampel telah ditambah kepada setiap telaga, dan kemudian 10 μL sampel yang akan diuji ditambah. Selepas pengedap dengan filem pengedap, plat diinkubasi pada 37 darjah selama 30 minit. Dibasuh 5 kali, 50 μL larutan pelabelan enzim ditambah, dan plat dimeterai dengan filem pengedap dan diinkubasi pada 37 darjah selama 30 minit. Dicuci 5 kali, dan kemudian larutan pembentuk warna dan larutan penamat tindak balas ditambah secara bergilir-gilir. Nilai OD setiap telaga diukur oleh pelabel enzim pada panjang gelombang 450 nm.

1. 3. 6 pewarnaan Nissl

Tiga ekor tikus telah dipilih daripada setiap kumpulan, dan tisu otak dikeluarkan dengan memenggal kepala dan diperbaiki dengan larutan polioksietilena 4%. Tisu telah dehidrasi, direndam dalam larutan lilin, tertanam, dan dihiris dengan kaedah konvensional. Kepingan disimpan dengan ketebalan 5 μm, dibilas dengan PBS, diwarnai dengan 0.1% toluidin biru selama 0.5 jam, dibezakan dengan 95% alkohol, dehidrasi dengan 100% alkohol, telus. dengan xilena, dan dimeterai dengan getah neutral. Perubahan dalam morfologi dan bilangan neuron di kawasan CA1 hippocampus tikus diperhatikan di bawah mikroskop dan imej dikumpulkan.

1. 3. 7 Eksperimen Western blot

Empat tikus dipilih daripada setiap kumpulan, dan hippocampus diasingkan dengan memenggal kepala. Tisu hippocampus dicampur dengan penimbal lisis RIP A dalam persekitaran mandi ais dan tisu itu diempar untuk mendapatkan supernatan. Kepekatan protein dikesan dengan kaedah BCA. 20 ug protein telah ditambah dengan penimbal pemuatan protein untuk elektroforesis. Selepas elektroforesis protein selesai, membran dipindahkan pada aliran malar 300 mA, disekat dengan serbuk susu skim 5%, antibodi primer diinkubasi pada 4 darjah semalaman, dan antibodi sekunder diinkubasi pada suhu bilik selama 2 jam. Selepas penyelesaian pembangunan warna digunakan, jalur protein dianalisis secara statistik menggunakan sistem analisis pengimejan chemiluminescence.

1. 3. 8 eksperimen RT-PCR

Tiga ekor tikus dipilih daripada setiap kumpulan untuk menyediakan homogenat tisu hippocampal. Jumlah RNA dalam cecair tisu diekstrak dengan kaedah Trizol dan kepekatannya diukur. Kit sintesis cDNA fastking digunakan untuk transkripsi terbalik, dan tindak balas penguatan kuantitatif pendarfluor dilakukan menggunakan kit kuantitatif pendarfluor untuk mengesan tahap ekspresi relatif mRNA protein berkaitan sinaptik. Keputusan dianalisis menggunakan 2-ΔΔCt. Urutan primer ditunjukkan dalam Jadual 1.

Jadual 1 Urutan primer RT-PCR

1.4 Kaedah statistik

Keputusan data yang menepati taburan normal dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (x ± s), dan analisis statistik dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism 9.5. Analisis varians sehala digunakan untuk perbandingan antara berbilang sampel, dan P < 0.05 menunjukkan bahawa perbezaan itu adalah signifikan secara statistik.