Kesan Bahagian Ekstrak Berbeza Cistanche Deserticola Pada Kesan Hipoglisemik Db / Db Black Tikus Ⅱ

2 Kaedah eksperimen

2.1 Penyediaan produk diproses Cistanche deserticola Cistanche deserticola:

Ambil bahan ubatan Cistanche deserticola, basuh kekotoran, kukus dalam periuk pada tekanan biasa selama 2 jam, potong 6 mm, dan keringkan pada 70 darjah . Cistanche deserticola: Ambil kepingan rebusan Cistanche deserticola, tambah jumlah wain beras yang sesuai, gaul rata, lembapkan selama 8 jam (wain beras kuning: air=1:1), kukus di bawah tekanan tinggi selama 4 jam, dan keringkan pada 70 darjah. (Gunakan 30 mL wain beras untuk setiap 100 g Cistanche deserticola).

EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

2.2 Pengayaan bahagian yang diekstrak berbeza dari Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Ambil 30 g serbuk Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola, tambahkan 10 kali ganda jumlah air, haba, dan refluks untuk pengekstrakan dua kali, 2 jam setiap kali, gabungkan ekstrak, pekat, tambah etanol sehingga kandungan alkohol mencapai 60%, mendakan pada suhu rendah selama 12 jam, dan tapis dengan sedutan. , mendakan ialah bahagian polisakarida mentah. Pekatkan supernatan kepada kepekatan yang sesuai, sapukan pada resin penjerapan makroporous D101, dan elusikannya dengan air dan etanol dengan kepekatan yang berbeza mengikut urutan. Kumpulkan eluat air dan pekat di bawah tekanan yang dikurangkan kepada pes tebal, iaitu jumlah pecahan oligosakarida; basuh dengan 40% etanol. Deliquidate, pekat dan keringkan di bawah tekanan yang dikurangkan, iaitu jumlah pecahan glikosida Cistanche deserticola.

2.3 Penentuan kandungan bahagian yang diekstrak berbeza dari Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Penentuan jumlah kandungan polisakarida Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Timbang sampel glukosa 20. 00 mg dalam kelalang volumetrik 50 mL untuk membuat 0. Untuk larutan piawai glukosa 4 mg·mL-1, pipet 3, 4, 5, 6 dan 7mL masing-masing ke dalam kelalang volumetrik 5{31}} mL, cairkan kepada isipadu dengan air dan pipet 2.0 mL setiap larutan glukosa kecerunan kepekatan ke dalam tabung uji. Ambil satu lagi jumlah air suling yang sama banyak sebagai kawalan kosong, tambah 1 mL fenol 5% ke setiap tiub, goncang dengan baik, cepat tambah 5 mL asid sulfurik pekat, biarkan selama 10 minit, masukkan ke dalam tab mandi air 40 darjah selama 15 minit, keluarkan, cepat sejuk ke suhu bilik, dan Ukur nilai penyerapan pada 490 nm, ambil penyerapan (A) sebagai ordinat dan kepekatan glukosa (C) sebagai absis, lukis lengkung piawai, dan dapatkan persamaan regresi Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Timbang dengan tepat 1.0 g daripada jumlah serbuk polisakarida bahan mentah dan produk, masukkan ke dalam kelalang volumetrik 50 mL masing-masing, tambah air untuk melarutkan dan laraskan isipadu pada tanda, lukis 2.0 mL dengan tepat ke dalam tabung uji, dan ukur dalam yang sama. cara sebagai kaedah penyediaan lengkung piawai. , itu sahaja.

2.3.2 Penentuan kandungan betaine dalam Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Penyediaan penyelesaian rujukan:

Timbang dengan tepat 1.17 mg larutan rujukan betaine, masukkan ke dalam kelalang volumetrik 5 mL, tambahkan 50% metanol untuk melarutkan dan mencairkan kepada isipadu, dan ia sedia.

2.3. 2． 2 Keadaan kromatografi

Lajur kromatografi ialah Ecosil {{0}}lajur kromatografi AMINO (4.6 mm×250 mm, 5 μm), fasa mudah alih: air asetonitril (99.5 ∶ 0.5) , suhu lajur: 30 darjah, panjang gelombang pengesanan: 194 nm, kadar alir: 0.6 mL·min-1, isipadu suntikan 10 μL, kromatogram ditunjukkan dalam Rajah 1. 2.3.2.3 Penyediaan larutan ujian Dengan Tepat timbang serbuk jumlah pecahan oligosakarida produk mentah dan produk siap 1.0 g, masing-masing dimasukkan ke dalam 5 mL kelalang volumetrik, tambah air suling untuk melarut dan cair kepada isipadu, goncang dengan baik, melalui membran penapis mikroporous 0.45 μL, dan ia sedia.

2.3.2.4 Penentuan Kandungan Contoh

Serap dengan tepat jumlah larutan ujian oligosakarida dalam Cistanche deserticola mentah dan disediakan, ukur mengikut syarat di bawah "2.3.2.2", dan hitung kandungan betaine dalam sampel.

2.3.3 Penentuan kandungan echinacoside, verbascoside, dan heterocymicifugarin dalam Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Penyediaan penyelesaian rujukan

Timbang dengan tepat 4.50 mg echinacoside, 4.80 mg verbascoside, dan 5.05 mg heterologous comimicin ke dalam 5 mL kelalang volumetrik, tambahkan 50% metanol untuk melarutkan dan mencairkan kepada tanda, dan ambil setiap kawalan Masukkan 200 μL larutan sampel ke dalam suntikan vial, tambah 400 μL metanol 50%, dan gaul rata untuk membuat larutan rujukan bercampur, goncang dengan baik, dan ia sedia.

2.3.3.2 Keadaan kromatografi

Lajur kromatografi ialah Ecosil C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm), metanol ialah fasa mudah alih A, 0.1% asid formik ialah fasa mudah alih B, elusi kecerunan, {{ 12}}~45 min, 30% A→ 70% A, kadar aliran ialah 1.0mL·min-1, suhu lajur ialah 30 darjah, panjang gelombang pengesanan ialah 330 nm, isipadu suntikan ialah 10μL, dan kromatogram ditunjukkan dalam Rajah 2.

2.3.3.3 Penyediaan larutan ujian

Timbang tepat 1.0 g daripada jumlah serbuk glikosida bahan mentah dan produk, letakkannya dalam 100 mL kelalang volumetrik, tambah 50% metanol untuk larut melaraskan isipadu pada tanda dan goncang baiklah. Lukiskan 5 mL setiap sampel dengan tepat ke dalam kelalang volumetrik 10 mL, tambahkan 50% metanol untuk membentuk isipadu, goncang dengan baik, dan melalui membran penapis mikroporous 0.45 μm untuk mendapatkannya.

2.3.3.4 Penentuan Kandungan Contoh

Lukis sampel jumlah glikosida Cistanche deserticola dengan tepat dan ukur mengikut syarat di bawah "2.3.3.2". Kira kandungan echinacoside, verbascoside, dan heterologous complicit dalam sampel.

2.4 Pengumpulan haiwan, pemodelan, dan pentadbiran dadah

Bilik haiwan mempunyai 12 jam cahaya dan 12 jam kegelapan, kelembapan relatif 50% hingga 70%, dan suhu bilik 18 hingga 22 darjah . Tikus hitam db/db dan tikus hitam db/m (kumpulan kawalan normal) diberi makan secara normal dengan makanan biasa, dan eksperimen bermula pada umur 9 minggu. Kecuali kumpulan kawalan biasa, tikus hitam db/db yang tinggal dipilih secara rawak mengikut tahap gula dalam darah dan berat badan. Dibahagikan kepada 8 kumpulan iaitu kumpulan model, kumpulan kawalan positif, kumpulan polisakarida jumlah Cistanche deserticola, kumpulan jumlah oligosakarida Cistanche deserticola, kumpulan jumlah glukosida Cistanche deserticola, kumpulan jumlah polisakarida Tartschistanche deserticola, kumpulan jumlah oligosakarida Tarthouse deserticola, kumpulan jumlah oligosakarida Tarthouse, Kumpulan jumlah glukosida Tartschistanche. Kecuali kawalan biasa

Kecuali untuk kumpulan model dan kumpulan model, tikus dalam kumpulan lain diberikan pentadbiran intragastrik pada dos 2 mL/100 g selama 4 minggu berturut-turut. Kepekatan cecair ialah 4.1 g·kg-1. Kumpulan kawalan biasa dan kumpulan model telah dirawat dengan cara yang sama. Berikan sejumlah garam biasa ke perut.

2.5 Kesan bahagian berbeza Cistanche deserticola yang diekstrak pada tahap glukosa darah tikus hitam db/db

2.5.1 Ujian toleransi glukosa oral (OGTT).

Selepas 26 hari pemberian, mereka berpuasa selama 12 jam dan 60 minit selepas pentadbiran pada hari berikutnya, tikus hitam dalam setiap kumpulan diberi 2.0 g·kg-1 glukosa pada 0, {{10}}.5, 1.0 dan 2 masing-masing. .0 h darah vena ekor diambil untuk mengukur nilai glukosa darah. Dengan nilai glukosa darah sebagai ordinat dan masa sebagai absis, carta perubahan glukosa darah telah dibuat, dan kawasan di bawah garis lengkung glukosa darah setiap kumpulan eksperimen dikira mengikut formula (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + D. Dalam formula: A, B, C dan D ialah nilai glukosa darah masing-masing pada 0, 0.5, 1.0 dan 2.0 h.

2.5.2 Pengiraan indeks rintangan insulin dan indeks arteriosklerosis

Indeks rintangan insulin dikira mengikut kaedah literatur [20]: HOMA-IR=Glukosa × Insulin / 22. 5. HOMA - =20 × Insulin / (Glukosa - 3.5) × 100%. IR ialah rintangan insulin dan (%) ialah fungsi sel. Unit molar glukosa ialah mmoL·L-1

. Insulin diberikan dalam mU·L-1. Nombor glukosa dan insulin diukur semasa berpuasa. Indeks arteriosklerosis (Indeks aterogenik) dikira mengikut kaedah yang diterangkan oleh Zheng et al. [21]. Kaedah pengiraan: Atherogenik i indeks=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Kesan bahagian yang diekstrak berbeza dari Cistanche deserticola/Cistanche deserticola pada serum INS dan HbA1c bagi tikus hitam db/db

Ambil sampel serum beku dan bawanya ke suhu bilik sebelum menggunakannya untuk ujian dengan kit immunoassay berkaitan enzim INS dan HbA1c. Ikuti dengan ketat kaedah dan langkah dalam arahan kit.

2.6 Kesan bahagian yang diekstrak berbeza dari Cistanche deserticola/Cistanche deserticola pada tahap tekanan oksidatif hati db/db tikus hitam

Ambil sampel serum beku dan bawanya ke suhu bilik sebelum menggunakannya untuk ujian dengan kit immunoassay berkaitan enzim MDA dan SOD. Ikuti dengan ketat kaedah dan langkah dalam arahan kit.

2.7 Kesan bahagian yang diekstrak berbeza dari Cistanche deserticola/Cistanche deserticola pada metabolisme lemak hepatik bagi tikus hitam db/db

Tahap TG, TC, HDL-C, dan LDL-C serum tikus diukur menggunakan kit yang berkaitan. Untuk langkah pengukuran khusus, rujuk kepada arahan kit.

2.8 Kesan bahagian yang diekstrak berbeza dari Cistanche deserticola/Ratiana camphor pada UA, Cr dan mALB dalam plasma dan air kencing tikus hitam db/db

Ambil plasma beku dan sampel air kencing dan bawanya ke suhu bilik sebelum menggunakannya untuk menguji kit immunoassay berkaitan enzim UA, Cr dan mALB. Ikuti dengan ketat kaedah dan langkah dalam arahan kit.

2.9 Pemerhatian bahagian patologi pankreas dan buah pinggang dengan pewarnaan HE

Tisu pankreas dan buah pinggang yang direndam dalam fiksatif 10% paraformaldehid selama 24 jam dikeluarkan, dibasuh dengan air suling, dan disimpan dalam etanol 70%. Sampel tisu dikeluarkan, didehidrasi dengan etanol berperingkat, dibersihkan, dibenamkan dalam parafin, dipotong, dan kemudian diwarnakan dengan hematoksilin dan eosin (pewarnaan H&E). Selepas gam bahagian telah kering, gunakan sistem pengimejan digital resolusi tinggi untuk memerhati dan mengambil gambar bahagian tersebut.

2.10 Penentuan kolagen jenis-IV tisu buah pinggang oleh imunohistokimia

Untuk ekspresi, bahagian buah pinggang didewax ke dalam air dan kemudian tertakluk kepada pengambilan antigen. Mereka telah disekat dengan 10% serum kambing dan diinkubasi dengan antibodi utama pada 4 darjah semalaman. Selepas mencuci, antibodi sekunder diinkubasi. Penyelesaian semasa ialah DAB untuk pembangunan warna. Pencucian, dehidrasi, dan pengedap dilakukan di bawah mikroskop optik. Perhatikan ekspresi protein kolagen jenis IV dalam tisu buah pinggang.

2.11 Kaedah statistik

Menggunakan perisian GraphPad Prism Versi 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) untuk menganalisis data dan keputusan

Hasilnya ialah min±SEM Menunjukkan bahawa perbezaan antara dua kumpulan adalah Sehala

ＡＮＯＶＡ( ｏｌｌｏｅｄｅＢｏｎｅｒｒｎｎ′ kaedah satu pasang ujian lajur), P<0.05 is a significant difference and has statistical significance.