Abstrak

Objektif: Untuk menyiasat kesan formula yang mengandungi Cistanche (menggantikan herba asli yang menyuburkan darah dan mengetonkan buah pinggang) pada ekspresi faktor pertumbuhan mengubah- 2 (TGF- 2), pembentukan semula scleral dan pengangkutan air dalam tikus miopia kekurangan bentuk (FDM) dengan mengawal selia caveolin1 (APQ1)/1a. laluan.

Kaedah: Empat puluh tikus SD lelaki gred SPF telah dipilih, antaranya 30 telah digunakan untuk mewujudkan model FDM. Selepas pemodelan berjaya, tikus dibahagikan kepada kumpulan FDM, kumpulan pirenzepine (PIR), dan kumpulan formula Cistanche, dengan 10 tikus dalam setiap kumpulan. Baki 10 tikus bukan model berfungsi sebagai kumpulan biasa. Kumpulan normal dan kumpulan FDM tidak menerima campur tangan. Kumpulan PIR dirawat dengan titisan mata PIR dua kali sehari (pagi dan petang), manakala kumpulan formula Cistanche diberi pentadbiran intragastrik formula yang mengandungi Cistanche. Ralat biasan dan panjang paksi tikus dikesan menggunakan retinoskop dan instrumen diagnostik. Pewarnaan HE digunakan untuk melihat perubahan morfologi tisu skleral. Pewarnaan imunohistokimia digunakan untuk mengesan ekspresi TGF- 2 dalam tisu skleral. Western blot digunakan untuk menentukan tahap ekspresi relatif protein AQP1 dan CAV1 dalam tisu skleral. RT-PCR dilakukan untuk mengukur tahap ekspresi relatif pengangkut glutamat-aspartat (GLAST) dan pengangkut glutamat 1 (GLT-1) mRNA dalam tisu skleral. Keputusan: Berbanding dengan kumpulan normal, ralat biasan, tahap ekspresi TGF- 2 dan tahap ekspresi relatif protein AQP1 dan CAV1 dalam kumpulan FDM, kumpulan formula Cistanche dan kumpulan PIR telah berkurangan dengan ketara, manakala panjang paksi dan tahap ekspresi relatif mRNA GLAST dan GLT-1 mRNA meningkat dengan ketara (semua P < ). Berbanding dengan kumpulan FDM, ralat biasan, tahap ekspresi TGF- 2 dan tahap ekspresi relatif protein AQP1 dan CAV1 dalam kumpulan formula Cistanche dan kumpulan PIR meningkat dengan ketara, manakala panjang paksi dan tahap ekspresi relatif mRNA GLAST dan GLT-1 mRNA menurun dengan ketara (semua P <0.05). Berbanding dengan kumpulan formula Cistanche, ralat biasan, tahap ekspresi TGF- 2 dan tahap ekspresi relatif protein AQP1 dan CAV1 dalam kumpulan PIR telah menurun dengan ketara, manakala panjang paksi dan tahap ekspresi relatif mRNA GLAST dan GLT-1 mRNA meningkat dengan ketara (semua P < 0.05). Keputusan pewarnaan HE menunjukkan bahawa tiada perubahan abnormal dalam struktur setiap lapisan retina dalam kumpulan normal; retina kumpulan FDM telah menipis dan perubahan vakuolar yang teruk muncul dalam lapisan sel ganglion; ketebalan retina kumpulan formula Cistanche dan kumpulan PIR telah meningkat, susunan sel pada asasnya tetap, bilangan sel ganglion meningkat, dan sel-sel dalam setiap lapisan disusun padat, dengan prestasi paling ketara dalam kumpulan formula Cistanche. Kesimpulan: Formula yang mengandungi Cistanche mempunyai kesan positif tertentu terhadap rawatan FDM dan mekanismenya mungkin berkaitan dengan mengawal selia ekspresi CAV1, AQP1 dan TGF- 2, serta mengimbangi dan menambah baik fungsi pembentukan semula skleral dan pengangkutan air.

 

 

SUPPLEMEN HERBA CISTANCHE UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG

 

 

Kata kunci

Miopia kekurangan bentuk; Formula yang mengandungi cistanche; Mengubah faktor pertumbuhan- 2; Aquaporin 1; Caveolin-1; Pengubahsuaian scleral; Pengangkutan air

 

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, dengan perubahan dalam gaya hidup manusia dan perkembangan berterusan peranti elektronik, kejadian rabun semakin meningkat. Sebagai penyakit biasa, ia telah menjadi masalah kesihatan global. Miopia kekurangan bentuk (FDM) adalah jenis miopia khas, yang biasanya disebabkan oleh kekurangan atau pengurangan rangsangan penglihatan pada mata. FDM bukan sahaja mengganggu proses pembentukan semula skleral tetapi juga membawa kepada perubahan yang tidak normal dalam bentuk bola mata dan gangguan fungsi pengangkutan air, yang boleh memburukkan lagi kerosakan dan ubah bentuk tisu skleral. Aquaporin 1 (AQP1) ialah protein sedia ada secara meluas yang fungsi utamanya adalah untuk menggalakkan pengangkutan pantas molekul air merentasi membran sel. Di mata, pengedaran dan fungsi AQP1 berkaitan dengan keseimbangan dinamik cecair intraokular. Caveolin-1 (CAV1) ialah protein yang terlibat dalam pembentukan mikrostruktur membran sel dan transduksi isyarat. Di mata, CAV1 terutamanya terdapat dalam sel epitelium pigmen retina dan sel fotoreseptor, dan berkaitan dengan penghantaran isyarat visual dan kestabilan persekitaran intraokular. Faktor pertumbuhan mengubah- 2 (TGF- 2) ialah sitokin pleiotropik dengan pelbagai kesan biologi seperti menggalakkan percambahan sel, pembezaan dan penghijrahan. Dalam persekitaran intraokular, TGF- 2 memainkan peranan penting dalam pembangunan dan penyelenggaraan kornea dan sklera. Pada masa ini, rawatan utama untuk FDM ialah terapi dadah.

Dalam perubatan tradisional Cina (TCM), pembentukan rabun dipercayai berkaitan dengan faktor seperti kekurangan qi dan darah, dan kekurangan pati buah pinggang. Buah pinggang dianggap sebagai "asas kongenital" dan berkait rapat dengan fungsi mata. TCM berpendapat bahawa "buah pinggang mengawal intipati, dan intipati menyuburkan mata; hati terbuka ke dalam mata, dan darah hati yang mencukupi memastikan penglihatan yang jelas". Oleh itu, tonifikasi buah pinggang dan darah berkhasiat sentiasa menjadi prinsip terapeutik yang penting untuk penyakit mata yang disebabkan oleh sindrom kekurangan dalam TCM.

Cistanche, yang dikenali sebagai "ginseng padang pasir" dan salah satu daripada "sembilan ubat abadi" dalam TCM, mempunyai sejarah lebih daripada 2,000 tahun sebagai ramuan perubatan. Dicatat sebagai bahan perubatan berkhasiat gred tinggi dalam klasik TCM purba, Cistanche sangat dihargai kerana kesannya untuk menguatkan buah pinggang, menambah pati, menyuburkan darah dan melembapkan kekeringan. Tidak seperti kebanyakan herba TCM lain, Cistanche tumbuh secara eksklusif di padang pasir, terutamanya parasit pada akar Tamarix ramosissima di kawasan seperti Xinjiang, Mongolia Dalam dan Gansu di China. Persekitaran padang pasir yang unik memberikannya dengan bahan aktif yang kaya, termasuk echinacoside, verbascoside, dan flavonoid, yang telah terbukti secara saintifik mempunyai sifat antioksidan yang kuat, mengurangkan apoptosis sel dan menggalakkan percambahan sel.

Penyelidikan moden telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai kesan pemakanan buah pinggang yang ketara. Ia boleh mengurangkan apoptosis sel buah pinggang, menggalakkan percambahan sel buah pinggang, membaiki sel-sel buah pinggang yang rosak, dan melebarkan saluran darah buah pinggang, dengan itu meningkatkan fungsi buah pinggang. Di samping itu, Cistanche boleh meningkatkan imuniti dengan menggalakkan pembiakan limfosit, menahan keletihan dengan meningkatkan pengeluaran glikogen hati, dan memberikan kesan anti-penuaan melalui penghapusan radikal bebas. Aktiviti biologi ini sangat konsisten dengan teori TCM "mengencangkan buah pinggang dan intipati berkhasiat", dan juga menyediakan asas saintifik untuk aplikasinya dalam rawatan penyakit mata. Berdasarkan prinsip terapeutik TCM iaitu tonifikasi buah pinggang dan darah berkhasiat, dan menggabungkan ciri-ciri farmakologi moden Cistanche, kajian ini menggantikan herba asli yang berkhasiat darah dan menguatkan buah pinggang dengan Cistanche untuk membentuk formula baharu yang mengandungi Cistanche, dan meneroka keberkesanan dan mekanismenya dalam rawatan FDM, yang bertujuan untuk menyediakan idea baharu berasaskan herba untuk myopia.

1 Bahan dan Kaedah

1.1 Haiwan Eksperimen

Empat puluh ekor tikus SD jantan gred SPF, seberat 180-200 g dan berumur 6-8 minggu, telah dibeli daripada Pusat Pembiakan Haiwan Beijing Keyu [No. Lesen: SCXK (Jing) 2022-0004] dan diternak secara rutin di Makmal Haiwan Hospital Mata Akademi Sains Perubatan Cina China. Percubaan ini mematuhi peruntukan berkaitan "Peraturan mengenai Pentadbiran Haiwan Eksperimen" dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Perubatan Hospital Mata Akademi Sains Perubatan Cina China (No. Kumpulan: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Reagen dan Instrumen Utama

Cistanche tubulosa (dibeli daripada Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., dengan bahan aktif termasuk echinacoside Lebih daripada atau sama dengan 30.0%, verbascoside Lebih besar daripada atau sama dengan 12.0%, dan jumlah glikosida alkohol phenethyl Lebih besar daripada atau sama dengan 75.0%) digunakan sebagai bahan teras perubatan. Pirenzepine (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Titik Mata Kompaun Tropicamide (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., spesifikasi 5 mL); 4 g·L⁻¹ Titik Mata Oxybuprocaine Hydrochloride (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); Antibodi AQP1 (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); Antibodi CAV1 (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -antibodi aktin (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); IgG anti-arnab kambing (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); Kit Pewarna HE (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Kaedah Permodelan dan Pengelompokan

Tiga puluh ekor tikus telah digunakan untuk mewujudkan model FDM. Tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal natrium pentobarbital (30 mg·kg⁻¹). Selepas membersihkan dan membasmi kuman mata kanan dengan povidone-iodin, topeng mata legap dilekatkan pada mata kanan. Topeng mata diperiksa setiap hari untuk mengesan detasmen atau kebocoran cahaya, dan digam semula jika longgar. Mata kiri tidak dirawat. Selepas 4 minggu kekurangan bentuk monokular, retinoskopi binokular dan ukuran panjang paksi dilakukan ke atas tikus. Kriteria kejayaan untuk pemodelan: selepas sikloplegia, ralat biasan diukur dengan retinoskop atau refraktometer automatik, dan mata yang dilucutkan menunjukkan anjakan rabun yang ketara dalam status biasan [iaitu, perbezaan dalam ralat biasan binokular Lebih besar daripada atau sama dengan 2 D dianggap sebagai pemodelan yang berjaya, dan purata anjakan rabun mata yang dilucutkan adalah kira-kira (-1.2). Kesemua 30 ekor tikus berjaya dimodelkan dan dibahagikan kepada kumpulan FDM, kumpulan PIR, dan kumpulan formula Cistanche, dengan 10 ekor tikus dalam setiap kumpulan. Baki 10 tikus bukan model berfungsi sebagai kumpulan biasa.

1.4 Kaedah Intervensi

Kumpulan normal dan kumpulan FDM tidak menerima campur tangan. Kumpulan PIR diberi 5 titis titisan mata PIR di mata kanan dua kali sehari (pagi dan petang) dengan selang 2 minit selama 15 hari. Kumpulan formula Cistanche telah campur tangan dengan formula yang mengandungi Cistanche. Cistanche tubulosa (50 g, bahan teras) telah direbus dengan air dan pekat kepada larutan ubat dengan kepekatan 1000 g·L⁻¹. Tikus diberi pentadbiran intragastrik pada dos 12.70 g·kg⁻¹ sekali sehari selama 15 hari. Dos Cistanche ditentukan berdasarkan pengalaman penggunaan klinikalnya dan penyelidikan farmakologi moden, memastikan kepekatan bahan aktif yang berkesan seperti echinacoside dan verbascoside.

1.5 Kaedah Pengesanan

1.5.1 Penilaian Ralat Biasan dan Perubahan Panjang Paksi

Pengesanan ralat morfologi dan biasan: Dua puluh empat jam selepas tamat kekurangan bentuk, 3 tikus dipilih secara rawak daripada setiap kumpulan untuk pengesanan. Sebelum eksperimen, tikus diletakkan dalam persekitaran yang disesuaikan gelap selama 30 minit, kemudian dibius dengan penyedutan isoflurane dan dipasang pada kurungan haiwan khas. Sistem pengimejan OCT resolusi tinggi digunakan untuk pengimbasan panorama bola mata. Semasa pengimbasan, probe dilaraskan supaya berserenjang dengan kornea untuk mendapatkan imej keratan rentas retina dan kanta yang jelas. Setiap mata diimbas 3 kali berturut-turut, dan jarak paksi dari permukaan kornea anterior ke lapisan epitelium pigmen retina (iaitu, panjang paksi) diukur secara automatik oleh perisian terbina dalam sistem untuk mengira ralat biasan setara sfera. Untuk memastikan ketepatan data, dua penyelidik terlatih profesional secara bebas menganalisis imej secara buta. Jika perbezaan antara kedua-dua keputusan pengukuran lebih besar daripada 0.50 D, data dibuang dan diukur semula. Pengesanan pengesahan panjang paksi: Untuk mengesahkan keputusan pengukuran OCT, instrumen diagnostik ultrasound imbasan A juga digunakan. Mula-mula, titisan mata oxybuprocaine hydrochloride telah diselitkan ke dalam kedua-dua mata tikus untuk anestesia topikal, dan kemudian siasatan A-scan diletakkan perlahan-lahan dengan kornea. Instrumen telah dilaraskan kepada mod manual, dan kelajuan perambatan ultrasonik yang tepat ditetapkan mengikut media intraokular: 1540 m·s⁻¹ untuk ruang anterior dan vitreous. Semasa operasi, setiap antara muka terletak dengan penandaan manual, dan setiap mata diukur 3 kali berulang kali untuk mengambil nilai purata. Percubaan ini dilakukan secara buta, dan semua pengendali menerima latihan bersatu untuk memastikan teknik pengukuran yang konsisten. Instrumen telah ditentukur sebelum pengukuran, dan beberapa sampel dipilih secara rawak untuk ujian kebolehulangan untuk menilai pekali korelasi intrakelas dan antara kelas (ICC). Prosedur pengendalian piawai yang ketat telah diikuti semasa eksperimen untuk memastikan saintifik dan kebolehpercayaan data.

1.5.2 Pewarnaan HE

Selepas mengesan ralat biasan dan panjang paksi, tikus telah dikorbankan oleh anestesia yang berlebihan. Kelopak mata dan tisu sekeliling kedua-dua mata telah dibasmi kuman, dan limbus hidung dan temporal berserenjang dengan titik tengah kornea ditandakan. Konjunktiva telah dihiris mengikut tanda, dan bola mata dienukleasi. Limbus dihiris untuk mengeluarkan tisu segmen anterior dan vitreous, dan tisu skleral dikekalkan. Tisu skleral telah difiksasi dengan 40 g·L⁻¹ paraformaldehid selama 24 jam, dehidrasi dengan etanol kecerunan, secara rutin dibenamkan dalam parafin, dibersihkan dengan xilena, dipasang dengan balsam neutral, dipotong pada 5 μm, diwarnai dengan HE, dan diperhatikan untuk perubahan morfologi tisu mikroskopik skleral.

1.5.3 Pewarnaan Imunohistokimia untuk Ekspresi TGF- 2 dalam Tisu Skleral

Dua ekor tikus dipilih daripada setiap kumpulan. Bahagian tisu skleral tertakluk kepada pengambilan dan penyekatan antigen, diinkubasi dengan anti-TGF tetikus- 2 (1:3000) selama 24 jam, dibasuh, diinkubasi dengan antibodi sekunder (1:2000) selama 1 jam, dibangunkan secara rutin dan diwarnakan balas, dipasang dengan balsam neutral, dan 2-3 imej perubahan tisu telah diambil di bawah mikroskop optikal. Nilai kelabu bahagian positif telah dikesan oleh sistem analisis imej.

1.5.4 Pengesanan Western Blot Tahap Ekspresi Protein AQP1 dan CAV1 dalam Tisu Skleral

Dua ekor tikus dipilih daripada setiap kumpulan. Tisu skleral dikeluarkan, dihomogenkan, dan jumlah protein diekstrak dengan menambah penimbal lisis RIPA. Denaturasi protein, kuantifikasi, elektroforesis, pemindahan membran, dan penyekatan telah dilakukan. Antibodi utama AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000), dan antibodi -aktin (1:2000) telah ditambah dan diinkubasi semalaman pada 4 darjah . Antibodi sekunder (1:2000) telah ditambah dan diinkubasi pada suhu bilik selama 1 jam. Reagen ECL telah ditambah, dan nilai kelabu protein dianalisis dengan perisian Image Lab. Nisbah nilai kelabu jalur sasaran kepada -aktin ialah tahap ekspresi relatifnya.

1.5.5 Pengesanan RT-PCR bagi GLAST dan GLT-1 Ungkapan mRNA dalam Tisu Skleral

Baki tisu skleral tikus telah diambil, dan jumlah RNA telah diekstrak mengikut kaedah Trizol. Jumlah RNA diukur dengan spektrofotometer, dan cDNA ditranskripsi terbalik mengikut arahan kit. Sistem tindak balas RT-PCR disediakan dengan keadaan tindak balas berikut: 75 darjah selama 30 saat, 85 darjah selama 60 saat, 80 darjah untuk penyepuhlindapan selama 30 saat, 65 darjah untuk lanjutan selama 30 saat, sejumlah 40 kitaran. Dengan -actin sebagai rujukan dalaman, tahap ekspresi relatif pengangkut glutamat-aspartat (GLAST) dan pengangkut glutamat 1 (GLT-1) telah dikira dengan kaedah 2⁻ΔΔCt. Urutan primer ditunjukkan dalam Jadual 1. Analisis varians sehala digunakan untuk perbandingan antara kumpulan, dan ujian LSD-t digunakan untuk perbandingan berpasangan antara kumpulan. Tahap ujian:=0.05.