Kesan Cistanche Phenylethanol Glycoside Penghalang Usus Dan Mikrobiota Usus dalam Penyakit Hati Micealcoholic

Abstrak:

Objektif:Model tetikus daripadapenyakit hati alkohol(ALD) telah ditubuhkan oleh suapan cecair alkohol Lieber-Decarli, dan kesan daripadaGlikosida phenylethanoid cistanche(CPhGs) pada penghalang usus dan komposisi mikrobiota usus tikus ALD telah dibincangkan.

Kaedah: 36 tikus betina C57BL/6N dibahagikan secara rawak kumpulan normal, kumpulan normal CPhG, kumpulan model dan kumpulan dos rendah, sederhana dan tinggi CPhG (175 mg·kg-1, 350 mg·kg{{6 }}dan 700 mg·kg-1), dengan 6 tikus. Penubuhan model tetikus ALD menggunakan suapan cecair alkohol Lieber-Decarli. Kumpulan dos CPhGs dan kumpulan normal CPhGs diberi CPhGsby gavage setiap hari pada dos yang sesuai. Penganalisis biokimia automatik mengesan tahap Serum ALT, AST, TG dan TC. SerumTNF- , IL-1 , LPS, LBP, D-LA, DAO dan LBP hati telah dikesan oleh ELISA. Tahap TG dan TC dalam sampel homogenat hati dikesan oleh kolorimetri. Tisu hati diwarnai dengan pewarnaan O merah minyak dan HE. Tisu usus telah diwarnai dengan pewarnaan HE dan AB-PAS, dan imunohistokimia Muc2. Kandungan usus kumpulan normal, kumpulan normal CPhGs, kumpulan model, dan kumpulan dos tinggi CPhGs telah dikumpulkan, dan mikrobiota usus telah disusun.

Keputusan: Model ALD berjaya ditubuhkan. Berbanding dengan kumpulan normal, paras serum ALT, AST, dan TG, dan paras TG dan TC hati dalam kumpulan model telah meningkat dengan ketara (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01). 

Kesimpulan: CPhG boleh mengurangkan kecederaan halangan usus yang disebabkan oleh ALD, yang mungkinmemainkan peranan pelindung dengan mengawal kelimpahan dan struktur Akkermansia dan Allobaculum, dan menjejaskan homeostasis lapisan mukus penghalang mukosa usus.

Kata kunci:CPhGs; penyakit hati alkohol; penghalang usus; mikrobiota usus

EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 40% ECHINACOSIDE DAN 16% ACTEOSIDE UNTUK

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Alkohol telah menjadi salah satu faktor risiko penting untukpenyakit kronik di seluruh dunia."Laporan Global mengenai Alkohol dan Kesihatan 2018" yang dikeluarkan oleh Pertubuhan Kesihatan Sedunia menunjukkan bahawa kira-kira 3 juta orang mati akibat penggunaan alkohol yang berlebihan di seluruh dunia pada tahun 2016, menyumbang 5.3% daripada jumlah keseluruhan [1]. Di negara kita, penyakit hati yang disebabkan oleh alkohol semakin meningkat dari tahun ke tahun dan merupakan punca kedua terbesar sirosis hati [2], yang telah menjadi masalah kesihatan awam yang serius. Mekanisme permulaan dan perkembangan penyakit hati alkohol (ALD) adalah kompleks dan banyak, terutamanya mekanisme kerosakan hati metabolit asetaldehid etanol dan spesies oksigen reaktif [3]. Antaranya, peranan "paksi usus-hati" dalam perkembangan ALD telah Ia telah menarik perhatian yang banyak [4-5]. Hati adalah tapak utama untuk metabolisme oksidatif alkohol. Minuman berat jangka panjang secara langsung boleh merosakkan hati, yang membawa kepada kejadian ALD [6]. Steatosis hepatik adalah tindak balas awal selepas minum alkohol. Mikrobiota usus manusia (GM) dianggarkan berjumlah 10 trilion [7]. Keseimbangan mikroekologi yang terdiri daripada flora usus, virus, kulat dan metabolit.

Keseimbangan, iaitu mikroekologi usus, berkait rapat dengan perkembangan ALD melalui "paksi usus-hati", tetapi mekanisme yang berkaitan masih tidak jelas [8-9]. Penghalang usus dan flora mendominasi "paksi usus-hati", dan disregulasi GM dan ekspresi berlebihan faktor keradangan memainkan peranan penting dalam kejadian dan perkembangan ALD [10-11].

Kajian telah mendapati bahawa disregulasi GM yang teruk dan overexpression faktor keradangan berlaku semasa kejadian dan perkembangan ALD [12]. Pengambilan kronik jangka panjang atau pengambilan alkohol dalam jumlah yang banyak dalam jangka pendek akan mengubah kebolehtelapan usus, menyebabkan LPS usus memasuki peredaran portal, mendorong tindak balas keradangan dan memburukkan lagi kerosakan hati [12-13].

Cistanche , sebagai bahan perubatan Cina yang khas di Xinjiang, telah direkodkan dalam Materia Medica Wu Pu dari Dinasti Wei dan Jin, "Kompendium Materia Medica" dari Dinasti Song, dan "Kompendium Materia Medica" dari Dinasti Ming [14]. ]. Penyelidikan farmakologi moden mendapati bahawa Cistanche phenylethanoid glycosides (CPhGs) memainkan peranan penting dalam anti-radang dan fibrosis anti-hepatik [15-16]. Walau bagaimanapun, pada masa ini terdapat kekurangan penyelidikan sama ada CPhG boleh mengawal fungsi penghalang usus atau flora usus dalam ALD dan memberikan kesan hepatoprotektif.

Kajian ini menggunakan suapan cecair alkohol Lieber-Decarli untuk menubuhkan Institut Kebangsaan Penyalahgunaan Alkohol dan Alkoholisme (NIAAA) [17] model tikus kecederaan hati alkohol jangka pendek untuk meneroka kesan CPhG pada mikroekologi usus ALD. Pengaruh. Perhatian khusus diberikan kepada kesan CPhG pada fungsi penghalang usus dan homeostasis mikrobiota usus dalam tikus model ALD. Ini membantu untuk mendedahkan mekanisme hepatoprotektif CPhG dari perspektif mikroekologi usus dan menyediakan rujukan eksperimen untuk pembangunan ubat.

1. Bahan

1.1 Haiwan

Tikus betina gred SPF C57BL/6N, 17~20 g, dibeli daripada Beijing Vitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., nombor sijil SCXK (Beijing) 2021-0006. Haiwan dibesarkan dan eksperimen dijalankan dalam persekitaran SPF Pusat Eksperimen Haiwan Universiti Perubatan Xinjiang (SYXK (baru) 2022-0003). tegas

Mematuhi kebajikan haiwan dan keperluan etika Jawatankuasa Etika Haiwan Eksperimen Universiti Perubatan Xinjiang (IACUC-20220127-4).

1.2 Reagen

Etanol mutlak, isopropil alkohol (Kilang Reagen Kimia Tianjin Damao, nombor kelompok 20230201 dan 20190103 masing-masing); Suapan cecair kawalan Lieber-Decarli, suapan cecair alkohol Lieber-Decarli (Daitz Biotechnology (Wuxi) Co., Ltd., nombor kelompok masing-masing untuk 710027 dan 710260);

Fiksatif paraformaldehid, fiksatif Carnoy dan fiksatif mikroskop elektron (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., nombor kelompok CR2208028, CR2305094 dan CR2210001 masing-masing); Kit ujian imunosorben berkaitan enzim LBP (ELISA), kit TNF- ELISA, IL-1

Kit ELISA, kit D-LA ELISA, kit DAO ELISA, kit ujian kolorimetrik TG dan kit ujian kolorimetrik TC (Wuhan Yilerite Biotechnology Co., Ltd., nombor kelompok ialah CV072V649815, CV112VX05028, CV106T8F34{303}} 9GY7

GY010XN08244, GY03P04Z5104 dan GY02DHB82603); Kit LPS ELISA (Wuhan Fein Biotechnology Co., Ltd., nombor kelompok U3126I069T); Kit ujian ALT, kit ujian AST, kit ujian TG dan kit ujian TC (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. Co., Ltd., nombor kelompok ialah 140122014, 140223002, 141722001 dan 141622017); Larutan pewarnaan HE, larutan pewarnaan Minyak Merah O tepu, larutan pewarnaan AB-PAS; Antibodi primer Muc2, antibodi sekunder anti-tikus kambing (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd. , nombor kelompok masing-masing ialah G1005, G1015, G1049, GB11344 dan GB23301).

1.3 Dadah

Ekstrak cistanche dibeli daripadaXinjiang Hotan Dichen Farmaseutikal dan Biologi Co., Ltd. (echinaceaside Lebih besar daripada atau sama dengan 40%, verbascoside Lebih besar daripada atau sama dengan 16%, glikosida phenylethanoid Lebih besar daripada atau sama dengan 85%, nombor kelompok 20230103).

1.4 Instrumen

BS-240VET penganalisis biokimia automatik (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.); Mikroskop elektron penghantaran HT7800 (Hitachi Manufacturing Co., Ltd., Jepun).

2. Kaedah

2.1 Pengelompokan dan penubuhan model haiwan

36 tikus dibahagikan secara rawak kepada kumpulan normal, kumpulan pentadbiran biasa, kumpulan model dan kumpulan CPhGs rendah, sederhana dan tinggi (175 mg·kg-1, 350mg·kg-1 dan 700 mg·kg{{ 6}}), setiap Kumpulan 6. Semua tikus pertama kali diberi suapan cecair kawalan Lieber-Decarli dan disesuaikan dengan makanan selama 3 hari. biasa

Kumpulan kawalan dan kumpulan dos biasa diberi suapan cecair kawalan Lieber-Decarli; kumpulan model dan kumpulan dos rendah, sederhana dan tinggi CPhG telah diberi suapan cecair alkohol LieberDecarli. Bermula dari hari ke-4 percubaan, kumpulan model dan kumpulan dos rendah, sederhana dan tinggi CPhGs secara beransur-ansur meningkatkan kepekatan alkohol suapan alkohol daripada 0% kepada 5% dan mengekalkan suapan alkohol 5% sehingga akhir eksperimen, dan ditekan 9 jam sebelum mengumpul bahan. 0.2 mL·10 g-1 telah ditadbir ke dalam perut dengan 30% etanol.

Semua suapan disediakan dan digunakan sekarang, dan suapan baharu diganti setiap hari dari 17:00 hingga 19:00. Perhatikan pemakanan, aktiviti dan keadaan mental tikus setiap hari. Apabila tikus dalam kumpulan model muncul dalam keadaan mabuk seperti tidak bermaya, mengurangkan aktiviti, dan mengurangkan pengambilan makanan, ia menunjukkan bahawa pemodelan berjaya [17]. Apabila kumpulan dos rendah, sederhana dan tinggi CPhG dan kumpulan pentadbiran biasa mula menyuap suapan beralkohol, larutan CPhG dengan kepekatan yang sepadan telah disuap setiap hari selama 14 hari, dan garam biasa telah digavage untuk selebihnya.

2.2 Pemerhatian am

Makan, aktiviti, keadaan mental dan perkumuhan tikus diperhatikan setiap hari; semasa pemodelan dan pentadbiran dadah, situasi kematian dan berat tikus telah direkodkan. Pekali organ=jisim organ/(jisim badan/100)×100%.

2.3 Pemilihan haiwan eksperimen

Selepas kekurangan makanan dan air selama 12 jam, tikus dibius, bola mata mereka dikeluarkan, dan darah dikumpulkan sebelum mereka dikorbankan. Tisu hati dari lobus terbesar telah ditetapkan dalam larutan paraformaldehid. Tisu jejunal dipisahkan dengan cepat di atas ais dan difikatkan dalam fiksatif mikroskop elektron; 3 cm jejunal dan tisu kolon (tanpa membilas kandungannya) diasingkan dan diperbaiki dalam fiksatif Carnoy. Satu lagi 3 cm jejunum dan tisu kolon (kandungan dibilas dengan garam fisiologi) telah ditetapkan dalam larutan paraformaldehid. Kandungan semua segmen usus dikumpulkan ke dalam kriovial bebas enzim steril, dibekukan dengan cepat dalam nitrogen cecair, dan kemudian dipindahkan ke peti sejuk -80 darjah untuk penyimpanan.

2.4 ELISA dan pengesanan kolorimetrik penunjuk homogenat serum dan tisu hati

Instrumen biokimia automatik digunakan untuk mengesan tahap ALT, AST, TG dan TC serum; kaedah ELISA digunakan untuk mengesan tahap TNF- , IL-1 , LPS, LBP, DAO dan D-LA serum dan tahap LBP hati. Beroperasi mengikut arahan. Untuk menghomogenkan tisu hati, ambil 0.05~1.00 g tisu hati segar, tambah isopropil alkohol pada 2~8 darjah mengikut nisbah berat (g): isipadu (mL) { {9}}:9, kisar hingga homogen, dan sentrifuge pada 20000g·min-1 15 min, ambil supernatan dan letakkan di atas ais untuk ujian dan kendalikan mengikut arahan. Pengesanan kolorimetrik tahap TG dan TC dalam sampel homogenat tisu hati.

2.5 Pewarnaan HE dan Oil Red O untuk mengesan patologi tisu hati

Untuk pewarnaan hematoxylin-eosin (HE), tisu hati tetap dibuang, dibelah parafin, diwarnakan HE, dan dehidrasi serta dipasang. Tisu hati tetap dikeluarkan, dibekukan, dicuci dengan isopropil alkohol, diwarnai dengan Minyak Merah O, ditutup, dan diperhatikan di bawah mikroskop cahaya.

2.6 Pewarnaan HE dan AB-PSA untuk mengesan pemerhatian patologi tisu usus

Tisu jejunal dibuang dan difikatkan dalam larutan paraformaldehid untuk pewarnaan HE; tisu kolon telah dikeluarkan dan diperbaiki dalam fiksatif Carnoy untuk pewarnaan AB-PAS. Langkah-langkah imunohistokimia: Dehidrasi bahagian parafin, pengambilan antigen, sekat peroksidase endogen, penyekat serum, tambah antibodi primer, tambah antibodi sekunder, nukleus sel counterstain selepas perkembangan warna, dehidrasi dan lekapkan, dan amati di bawah mikroskop cahaya. Tisu jejunal telah dikeluarkan, dipotong menjadi kepingan kecil 1 mm × 1 mm × 1 mm, dibetulkan sebelum haid, selepas ditetapkan, dehidrasi, tertanam, dipolimerkan, dan dibelah ultranipis. Perubahan mikrovili sel epitelium jejunal dalam setiap kumpulan diperhatikan di bawah mikroskop elektron penghantaran.

2.7 Urutan dan analisis flora usus menggunakan kaedah 16S

Kandungan usus kumpulan normal, kumpulan dos biasa, kumpulan model dan kumpulan dos tinggi CPhG, berdasarkan V3-rantau V4 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') dan 806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT -3'), menggunakan teknologi penjujukan pemprosesan tinggi 16S rDNA untuk penjujukan komuniti bakteria. Eksperimen penjujukan dalam kajian ini telah disiapkan oleh Shenzhen Microtech Technology Group Co., Ltd. Data penjujukan mikrobiota usus dalam kajian ini telah dimuat naik ke Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan di bawah nombor projek PRJNA1006676.

Berdasarkan keputusan analisis varian jujukan amplikon (ASV), kepelbagaian Alpha, analisis kepelbagaian Beta, anotasi klasifikasi spesies dan analisis perbezaan dilakukan. Antaranya, indeks kepelbagaian Alpha terutamanya termasuk indeks Shannon dan indeks Chao1, dan ujian statistik menggunakan ujian Wilcoxon; PCoA

Analisis koordinat utama (PCoA) dilakukan menggunakan Anosim untuk menganalisis perbezaan antara kumpulan; LEfSe digunakan untuk menganalisis LEfSe) untuk mendapatkan spesies dengan perbezaan yang ketara antara kumpulan. Analisis bioinformatik dilakukan menggunakan alat Platform Bioincloud (https://www.bioincloud.tech) Microtech Alliance.

2.8 Analisis statistik

Semua data ukuran diterangkan sebagai igh̅± 𝑠. Bagi data yang mematuhi taburan normal dan memenuhi kehomogenan ujian varians, analisis varians satu faktor digunakan. Jika tidak, ujian bukan parametrik digunakan. Data dianalisis secara statistik menggunakan SPSS 24.0. P<0.05 means the difference is statistically significant.