BAHAGIAN Ⅰ: Kesan Ekstrak Cistanche Tubulosa Terhadap Fungsi Pembiakan Lelaki dalam Tikus Diabetik Berpunca Streptozotocin-Nicotinamide
Mar 04, 2022
Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He dan Shu-Chun Cheng
Abstrak:Diabetes adalah gangguan kronik yang dicirikan oleh hiperglikemia akibat penurunan tahap insulin atau ketidakcekapan tisu untuk menggunakannya dengan berkesan. Kemandulan dikenali sebagai hasil utama diabetes dan menjejaskan sistem pembiakan lelaki dengan menyebabkan kerosakan sperma dan disfungsi gonad.Cistanche tubulosaadalah tumbuhan parasit yang mempunyai kapasiti untuk meningkatkan daya ingatan, imuniti, dan keupayaan seksual, mengurangkan mati pucuk, dan meminimumkan sembelit. Kajian ini tertumpu kepada penyiasatan kesan anti-radang dan perlindungan echinacoside (ECH) dalamEkstrak cistanche tubulosa(CTE) pada sistem pembiakan lelaki tikus diabetes. Kesan antioksidan, anti-radang dan perlindungan CTE dinilai oleh kedua-dua kaedah in vitro dan in vivo. Keputusan in vitro menunjukkan bahawa ECH menghalang pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) dan meningkatkan ekspresi protein StAR, CYP11A1, CYP17A1, dan HSD17p3. Analisis in vivo telah dijalankan dengan tiga dos echinacoside (ECH) (8{10}}, 160 dan 320 mg/kg) dalam CTE. Secara keseluruhan, 0.571 mg/kg rosiglitazone (RSG) telah diberikan sebagai kawalan positif. Diabetes disebabkan oleh streptozotocin (STZ) (65 mg/kg) dan nikotinamida (230 mg/kg) dalam kombinasi dengan diet tinggi lemak (45 peratus). Kajian in vivo mengesahkan bahawa ECH meningkatkan paras gula darah, rintangan insulin, rintangan leptin dan peroksidasi lipid. Ia boleh memulihkan kisspeptin 1 (KiSS1), reseptor bergandingan protein G GPR 54, penindas isyarat sitokin 3 (SOCS-3), dan ekspresi asid ribonukleik (mRNA) messenger sirtuin 1 (SIRT1) dalam hipotalamus dan memulihkan jantina tahap hormon. Oleh itu, kajian ini mengesahkan kesan antioksidan, anti-radang, dan steroidogenesis CTE.
Kata kunci:kencing manis; ketidaksuburan;Ekstrak cistanche tubulosa (CTE); echinacoside (ECH); aktiviti anti-radang; aktiviti antioksidan; kesan steroidogenesis
Rawatan untuk diabetes:Ekstrak cistanche tubulosa(CTE)
1. Pengenalan
Diabetes mellitus (DM) adalah keadaan di mana terdapat peningkatan paras glukosa dalam darah disebabkan oleh ketidakcekapan pankreas dalam menghasilkan insulin yang mencukupi, atau ketidakupayaan badan untuk menggunakannya dengan berkesan. Menurut WHO, bilangan penghidap diabetes meningkat daripada 108 juta pada tahun 1980 kepada 422 juta pada tahun 2014 [1]. Terdapat empat kategori utama: pra-diabetes (peringkat sebelum diabetes), jenis 1 (di mana pankreas gagal menghasilkan insulin), jenis 2 (badan gagal menggunakan insulin), dan diabetes semasa mengandung (yang berlaku semasa kehamilan). Tekanan oksidatif berlaku akibat ketidakseimbangan antara penghasilan spesies oksigen reaktif (ROS) dan antioksidan [2] akhirnya membawa kepada keadaan diabetes. Komplikasi diabetes termasuk kegagalan buah pinggang, kerosakan saraf, buta, strok, serangan jantung, kematian janin, dan ketidaksuburan. [1]. Kajian menunjukkan bahawa nukleus sperma, asid deoksiribonukleik (DNA), dan mitokondria telah rosak dengan ketara pada pesakit diabetes lelaki [3]. Tekanan oksidatif semasa pengangkutan sperma akan mengubah proses sistem pembiakan lelaki [4,5].
Proses spermatogenesis dikawal oleh paksi hipotalamus-pituitari-gonadal (HPG). Hormon pelepas gonadotropin (GnRH) yang dihasilkan oleh hipotalamus merangsang pengeluaran hormon luteinizing (LH) dan hormon perangsang folikel (FSH). Sel Leydig ditemui bersebelahan dengan tubul seminiferus dan menghasilkan testosteron di bawah kawalan LH. FSH mencetuskan pengeluaran protein pengikat antigen (ABP) yang membantu untuk melepasi hormon lelaki. Oleh itu, kemandulan dan masalah lain timbul terutamanya disebabkan oleh gangguan yang berlaku pada paksi HPG. Pentadbiran gabungan streptozotocin-nikotinamide mendorong kencing manis dalam tikus eksperimen. Streptozotocin ialah sebatian kimia toksik kepada sel p penghasil insulin dalam pankreas dan nikotinamida ialah vitamin larut air yang melindungi sel p daripada kerosakan sepenuhnya [6].
Cistanche tubulosa ialah spesies tumbuhan padang pasir yang juga dikenali sebagai "Rou Cong-Rong" [7]. Ia adalah tumbuhan parasit bukan klorofil yang tumbuh terutamanya pada akar pokok Calotropis Procera dan diedarkan secara meluas di tanah gersang Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolia, Iran, dan India. Nama biasa Cistanche tubulosa ialah "Desert Hyacinth". Ia diterima secara meluas dalam perubatan tradisional Cina dan telah diberi nama "Ginseng of the Desert". Ia digunakan secara meluas dalam bidang perubatan untuk merawat leucorrhea morbid, metrorrhagia yang berlimpah, penyakit buah pinggang kronik, sembelit, mati pucuk, dan kemandulan. Juzuk kimia daripadaCistanche tubulosaterdiri daripada glikosida phenylethanoid tidak meruap (PHG), iridoid, lignan, minyak meruap, alditol, oligosakarida, dan polisakarida [8]. Kajian menunjukkan bahawa echinacoside dari herba ini melindungi fibroblas yang rosak dengan mengawal tahap ROS [9]. Kompaun ini menghasilkan aktiviti antioksidan, vasorelaxation, dan anti-radang bersama-sama dengan neuroprotection dan pencegahan osteoporosis [10,11].
Kajian ini bertujuan untuk menyiasatkesan ekstrak Cistanche tubulosamengandungi ECH pada disfungsi pembiakan tikus diabetes yang disebabkan oleh streptozotocin-nikotinamide.
Cistanche tubulosa
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1.Bahan
ECH dan CTE telah dibeli daripada Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Produk akhir glikasi lanjutan (AGEs) telah dibeli daripada Biovision (San Francisco, CA, Amerika Syarikat). Talian sel LC-540 dan TM3 telah dibeli daripada Institut Penyelidikan dan Pembangunan Industri Makanan (Hsinchu, Taiwan). Tikus jantan Sprague-Dawley (SD) berusia lima minggu telah dibeli dari Pusat Haiwan Makmal Kebangsaan (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® telah dibeli daripada PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) diperoleh daripada Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanol dan 4-(2-hydroxyethyl)-1-asid piperazineethanesulfonic (HEPES) juga dibeli daripada Sigma. Medium Eagle/F12 yang diubah suai Dulbecco dan trypsin-EDTA diperoleh daripada GIBCO (New York, NY, Amerika Syarikat). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), dimetil sulfoksida (DMSO), dan nitroblue tetrazolium (NBT) telah dibeli daripada Sigma. Kit enzimatik glukosa diperolehi dari Kyokutoseiyaku, Tokyo, Jepun. Kit Insulin ELISA telah dibeli daripada Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Sweden). Reagen Pengekstrakan Protein Tisu T-PER diperoleh daripada Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Antibodi poliklonal Anti-Manusia/Tetikus/Tikus-kappa B NF-kB telah dibeli dari Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Amerika Syarikat. Reseptor Anti-Tetikus/Tikus untuk antibodi poliklonal produk akhir glikasi lanjutan (RAGE), antibodi poliklonal anti-Manusia/Tetikus/Tikus StAR dan anti-Manusia/Tetikus/Tikus Cytochrome P450 17A1 antibodi monoklonal telah dibeli daripada Gene Tex (Irvine, CA, Amerika Syarikat). Antibodi poliklonal CYP11A1 Anti-Manusia/Tetikus/Tikus diperoleh daripada Teknologi Isyarat Sel (Beverly, PA, Amerika Syarikat). Reagen easy-Blue telah dibeli daripada Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agarose dan penanda DNA 100 bp diperolehi daripada Promega, Corporation (Madison, WI, Amerika Syarikat). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit dibeli dari QIAGEN, Hilden, Jerman.
2.2.Kaedah
2.2.1. Analisis In Vitro
Kultur Sel LC{{{0}} dan TM3: Garisan sel LC-540 telah dikultur pada 37 OC dalam medium Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) ditambah dengan natrium bikarbonat (1.5 g/L), L -glutamin (2 mM), asid amino bukan penting (0.1 mM), natrium piruvat (1.0 mM), dan serum lembu janin (FBS) (10 peratus ) dalam 5 peratus inkubator CO2 (inkubator CO2, Napco 5410, Taiwan). Barisan sel TM3 telah dibiakkan dalam medium Eagle diubahsuai Dulbecco/s (DMEM) ditambah dengan glukosa (4.5 g/L), natrium piruvat (0.5 mM), L-glutamin (2.5 mM), natrium bikarbonat (1.2 g/L), 4-(2-hydroxyethyl)-1-asid piperazineethanesulfonic (HEPES, 15 mM), dan serum anak lembu janin (FCS, 10 peratus ) atau serum kuda (5 peratus ) pada 37 OC dalam 5 peratus inkubator CO2.
Penentuan Daya Daya Sel Echinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- reagen diphenyltetrazolium bromide (MTT) ialah digunakan untuk ujian daya maju sel. Kepekatan sel telah dilaraskan kepada 2 x 105 sel / mL dalam 96-plat perigi. Kemudian, 20 卩L ECH (dicairkan dalam 2 peratus medium) ditambah dan diinkubasi selama 24 jam pada 37 OC dalam inkubator CO2 5 peratus. Kemudian, 100 卩L reagen MTT telah ditambah dan diinkubasi untuk 4hat37 OC dalam keadaan gelap. Penyerapan diukur pada 570 nm (pembaca ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Switzerland).
CeH viabiHiy ( peratus )=[(Sampel pada 570 nm — Kosong pada 570 nm)]/[(Acontrol pada 570 — Kosong pada 570)] x 100.
Ujian Pengurangan Nitroblue Tetrazolium (NBT) dan 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Assay: Bilangan sel telah dilaraskan kepada 1x 1{{10}}6 sel/mL . Kemudian, 50 mg/mL ECH, resveratrol (RES) dan produk akhir glikasi termaju (AGEs) (kawalan) telah ditambah dan dikultur bersama selama 18 jam pada suhu 37OC. Kemudian, 0.3 mL larutan NBT (0.1 mg/mL NBT, 5 peratus FBS, dan 3 peratus dimetil sulfoksida (DMSO) yang dilarutkan dalam 10 mL DMEM) telah ditambah dan diinkubasi pada 37 OC dalam 5 peratus CO2 selama 1 jam. Selepas sentrifugasi (pada 800 xg selama 3 minit) supernatan dikeluarkan dan 200 卩L DMSO ditambah dan digoncang selama 5 minit dalam pengayun ultrasonik (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Penyerapan diukur pada 630 nm. Untuk ujian radikal DPPH, Trolox (dalam 95 peratus alkohol) telah diambil sebagai standard. Kemudian, 75 卩L larutan DPPH 0.5 mM dicampur dengan 25 卩L sampel dan dibenarkan bertindak balas pada suhu bilik di tempat yang gelap selama 30 minit. Campuran digoncang dan penyerapan diukur pada 517 nm.
Analisis Kandungan Spesies Oksigen Reaktif (ROS): Nombor sel telah dilaraskan kepada 2 x 105 sel/mL dalam 12-plat perigi yang mengandungi 2 peratus FBS. Kemudian, 50 卩L/mL ECH, RES, dan AGEs telah ditambah ke dalam plat dan diinkubasi pada 37 OC selama 24 jam. Selepas 24 jam, 2Z,7Z-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) telah ditambah dan diinkubasi pada 37 OC selama 30 minit. Selepas sentrifugasi (400x g, 5 min), supernatan dikeluarkan dan sel dibasuh dua kali dengan garam penampan fosfat (PBS). Selepas sel digantung dalam 1 mL PBS dan tahap ROS ditentukan dengan menggunakan cytometer aliran (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).
Pengenalpastian dan Analisis Kuantitatif Protein: Protein diekstrak dengan menggunakan reagen pengekstrakan protein (T-PER). Ketumpatan sel telah dilaraskan kepada 2 x 105 sel/ml dalam 12-plat perigi dan 50 卩L/mL ECH, RES, dan reseptor untuk antagonis produk akhir glikasi lanjutan (RAGE), dan AGE telah ditambah dan diinkubasi pada 37 OC dalam inkubator CO2 5 peratus selama 24 jam. Selepas itu, 400 卩L T-PER ditambah, dikikis sel dan diempar pada 125,000xg selama 20 min (4 OC). Supernatan telah dikumpul dan disimpan di -80 OC (-80 OC freezer, Nuaire, Plymouth, MN, USA) untuk analisis lanjut. Kit asid bicinchoninic (BCA) digunakan untuk pengiraan protein. Kemudian, 10 卩L larutan sel standard dan 200 RL reagen BCA telah ditambahkan pada 8-plat perigi dan diinkubasi pada 37 O Cin inkubator CO2 5 peratus selama 30 minit. Penyerapan diukur pada 562 nm. Analisis pengenalpastian protein dilakukan oleh elektroforesis natrium dodesil sulfat (SDS)-polyacrylamide gel (SDS-PAGE). Sampel disediakan dengan menambahkan lisat protein kepada penimbal pemuatan protein dan analisis western blot dilakukan untuk mengesan protein tertentu.
2.2.2.Analisis Dalam Vivo
Reka Bentuk Model Haiwan: Enam puluh {{0}}tikus jantan Sprague-Dawley (SD) berumur enam puluh {{0}}minggu telah dibeli dari Pusat Haiwan Makmal Kebangsaan (Taipei, Taiwan). Setiap tikus ditempatkan secara individu dalam sangkar keluli tahan karat disinfektan di bawah suhu terkawal (23 土 1 darjah ) dan kelembapan (40-60 peratus ) dengan kitaran gelap 12 jam/12 jam. Makanan dan air disediakan secara ad libitum. Setiap tikus dijinakkan pada minggu pertama dan diberi diet tikus makmal 5001 sebagai diet utama. Semua prosedur mengikut piawaian Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (No. Kelulusan IACUC 101026) Universiti Lautan Taiwan Kebangsaan, Taiwan. Selepas pembiakan, tikus dibahagikan kepada dua kumpulan: kumpulan kawalan (Con) yang diberi makan dengan diet makmal 5001, dan kumpulan kencing manis yang diberi diet tinggi lemak (HFD, 40 peratus ) untuk keseluruhan eksperimen. Selepas diberi makan dengan HFD selama 4 minggu, tikus kumpulan diabetes disuntik dengan streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) untuk menyebabkan diabetes mellitus (DM). Dalam masa 15 minit selepas suntikan STZ, nikotinamida (230 mg/Kg Berat Badan) telah disuntik. Seminggu selepas suntikan, ujian toleransi glukosa oral (OGTT) dijalankan untuk menentukan kejayaan induksi diabetes Mellitus (DM). Selepas itu, haiwan itu dibahagikan kepada enam kumpulan: kawalan (diberi makan dengan diet makmal 5001); Kumpulan DM (DM tambah 45 peratus HFD); Kumpulan DMR (DM ditambah rosiglitazone: 0.571 mg/kg BW) ditambah 45 peratus HFD; Kumpulan DME1 (DM campur CTE: 80 mg/kg BW) ditambah 45 peratus HFD; Kumpulan DME2 (DM campur CTE: 160 mg/kg BW) ditambah 45 peratus HFD; dan kumpulan DME4 (DM campur CTE: 320 mg/kg BW) ditambah 45 peratus HFD. Rosiglitazone (RSG) diambil sebagai kawalan positif. Tiga dos CTE (80, 160, dan 320 mg/kg) telah digunakan mengikut cadangan garis panduan penilaian fungsi makanan kesihatan Taiwan Food and Drug Administration (TFDA). Rawatan diberikan sehingga tamat eksperimen. Semua tikus eksperimen telah dikorbankan selepas 6 minggu. Darah yang dikumpul daripada tikus telah disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 minit pada 4 darjah .
Bahan-bahan berkesan Mian cistanche tubulosa
Supernatan telah diperiksa untuk analisis berikut
Jumlah Glukosa, Trigliserida, dan Penentuan Kolesterol: Penentuan glukosa telah dijalankan oleh kit enzimatik glukosa. Kemudian, 20 sampel plasma darah ditambah kepada reagen dan disimpan pada suhu 37 darjah selama 5 minit. Jumlah trigliserida dan jumlah kepekatan kolesterol ditentukan dengan menggunakan kit enzim trigliserida dan kolesterol. Kemudian, 10 ^L plasma darah ditambah kepada reagen dan eksperimen dijalankan mengikut arahan pengilang. Penyerapan diukur pada 510 nm.
Jumlah glukosa/trigliserida/kolesterol plasma (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200.
Sampel: Penyerapan sampel darah, ABlank: Nilai serapan kit tanpa sampel, Piawaian: Nilai penyerapan reagen piawai, 200: reagen piawai pada kepekatan 200 mg/dL.
Penilaian Insulin, Leptin dan Model Homeostatik-Kerintangan Insulin (HOMA-IR) Penentuan: Tahap insulin ditentukan oleh kit ELISA insulin. Di sini, 25 plasma darah telah ditambah kepada reagen dan penyerapan diukur pada 450 nm. Jumlah kandungan leptin ditentukan dengan menggunakan kit ujian imunometrik enzim leptin. Kemudian, 100 plasma dianalisis dan penyerapan diukur pada 450 nm menggunakan pembaca ELISA. Keseluruhan eksperimen dijalankan mengikut arahan pengilang. Nilai HOMA-IR ditentukan daripada persamaan penilaian model homeostasis=Kepekatan insulin plasma puasa (mU/mL) x kepekatan glukosa plasma puasa (mmol/L)/22.5.
Pengoksidaan Lipid Plasma: Di sini, {{0}}.5 mL plasma darah dicampurkan dengan 1 mL reagen (15 peratus , w/v asid trichloroacetic dalam 0.25 N asid hidroklorik (HCl ) dan 0.375 peratus , w/v asid tiobarbiturik dalam 0.25 N HCl) dan diletakkan di dalam tab mandi air (Water Bath, BUCHI461, Zurich, Switzerland) pada 100 darjah C selama 15 min. Selepas penyejukan, 1 mL n-butanol ditambah, digoncang kuat, dan disentrifugasi pada 1500 xg selama 10 minit. Supernatan dikumpul dan penyerapan diukur pada 532 nm [12].
Kepekatan Malondialdehid (MDA) (nM/mL)=[(Sampel pada 532 nm - Kosong pada 532 nm)/ (Astandard pada 532 nm - Kosong pada 532 nm)] x 5.
Penentuan Tahap Testosteron Plasma dan Hormon Luteinizing (LH): Kit ELISA testosteron digunakan untuk mengukur tahap testosteron dalam plasma darah. Kit RIA digunakan untuk menentukan kepekatan LH. Kemudian, 50 卩L plasma ditambah dan pengiraan adalah berdasarkan kepekatan hormon LH-RP-3 (standard). Langkah selanjutnya telah dijalankan mengikut arahan pengilang.
Penentuan Faktor Nekrosis Tumor (TNF)-a dan Interleukin-6 (IL-6) Kepekatan: Antibodi yang ditangkap telah dicairkan 250 kali dalam penimbal salutan, ditambah pada {{4} }plat perigi (100 卩L/telaga), dan disimpan pada suhu 4 darjah C untuk semalaman. Supernatan disedut dan dibasuh lima kali dengan penimbal pencuci (1 kali PBS, 0.05 peratus Tween 20). Selepas pengeraman (1 jam) dengan 200 ^g pelarut ujian, sel-sel telah dibasuh 5 kali dengan penimbal pencuci dan 100 ^L larutan piawai TNF-a atau sampel ujian telah ditambah pada setiap telaga dan diinkubasi selama 2 jam. Selepas mencuci, 100 RL IL-6 antibodi yang dikesan ditambah dan diinkubasi untuk suhu bilik 1hat. Supernatan disedut dan dicuci 5 kali. Kemudian, 480 RL enzim avidin-horseradish peroxidase (HRP) telah ditambah dan diinkubasi selama 30 minit pada suhu bilik. Supernatan disedut dan dibasuh lima kali dengan penimbal pencuci. Kemudian, 100 RL larutan substrat ditambah dan diinkubasi selama 15 minit pada suhu bilik. Kemudian, 50 RL larutan henti (asid fosforik 1M) ditambahkan pada setiap telaga dan penyerapan diukur pada 450 nm.
Faedah Cistanche Echinacoside: Anti-pengoksidaan
Analisis Parameter Sperma dan Testis
Pengumpulan Sampel Sperma: Pengumpulan sampel sperma dilakukan mengikut kaedah yang dilaporkan sebelum ini dalam [13]. Sperma dikumpulkan dari supernatan dan digunakan untuk analisis lanjut.
Bilangan Sperma, Motilitas Sperma dan Sperma Tidak Normal: Bilangan sperma dikira menggunakan hemocytometer dan larutan trypan blue. Kemudian, 100 RL cecair sperma dicampur dengan larutan biru trypan, dan bilangan sperma, motilitas, dan sperma abnormal dikira menggunakan hemocytometer dan mikroskop [14].
Nitro blue Tetrazolium NBT Pengurangan dan Pengoksidaan Lipid Sperma dan Testis: Pengoksidaan lipid dan pengurangan NBT dianalisis mengikut prosedur analisis plasma yang sama.
Penentuan Aktiviti Superoxide Dismutase (SOD) dan Catalase: Aktiviti Superoxide dismutase (SOD) dianalisis dengan menggunakan kit RANSEL. Di sini, {{0}}.05 mL homogenat testis telah ditambah kepada 1.7 mL larutan tindak balas (0.05 mM xanthine, 0.025 mM 2-({ {9}}iodofenil)- 3-(4-nitrophenol)-5-feniltetrazolium klorida (INT)). Selepas mencampurkan, 0.25 ml xanthine oxidase (80 U/L) telah ditambah dan bertindak balas pada suhu bilik selama 30 s pada suhu bilik. Penyerapan diukur pada 505 nm. Kepekatan protein homogenat testis ditentukan oleh kit ujian protein Bio-Rad DC dan aktiviti spesifiknya (protein U/mg) telah dikira. Aktiviti katalase (CAT) ditentukan mengikut kaedah yang dilaporkan sebelum ini [15].
Pewarnaan H&E (Hematoxylin dan Eosin).
Testis direndam dalam 10 peratus formalin selama 24 jam dan disimpan pada suhu 4 darjah C. Potong tisu mengikut saiz mikro dan dilekatkan pada slaid. Selepas penetapan (95 peratus metanol ditambah 5 peratus asid asetik), slaid direndam dalam hematoxylin selama 3 minit, dibasuh dengan air mengalir selama 5 minit, dan kemudian direndam dengan 50 peratus, 70 peratus, dan 90 peratus alkohol selama satu minit. Selepas itu, slaid diwarnakan dengan eosin selama 10 s dan direndam dalam alkohol 100 peratus selama satu minit sehingga ia pudar. Akhirnya, slaid direndam dalam xilena selama satu minit. Kemudian, slaid itu dikeringkan di udara dan dimeteraikan. Tiub berwarna diletakkan dalam mikroskop kontras fasa terbalik (Mikroskop Perbezaan Fasa Terbalik, Olympus CK-2, Tokyo, Jepun) untuk memerhati morfologi.
Analisis Hipotalamus
KISS1 tetikus, G-protein coupled receptor (GPR) 54, penindas isyarat sitokin 3 (SOCS-3), dan jujukan gen sirtuin 1(SIRT1) telah dikenal pasti daripada pangkalan data gen NCBI (National Center for Biotechnology Information). dan buku asas khusus telah direka bentuk menggunakan Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Primer yang digunakan dalam eksperimen disenaraikan dalam Jadual 1.
Pengekstrakan asid Ribonukleik (RNA) daripada Hipotalamus. Pengekstrakan RNA daripada hipotalamus otak dijalankan dengan menggunakan Kit Mini Tisu Lipid RNeasy. MRNA yang diperolehi diukur secara kuantitatif oleh transkripsi terbalik (RT) dan tindak balas rantai polimerase (PCR). DNA pujian yang diperoleh daripada analisis RT disimpan pada -20 darjah untuk kegunaan kemudian. DNA yang diekstrak telah tertakluk kepada analisis tindak balas rantai polimerase (PCR) menggunakan polimerase Taq. Kemudian, 5~10 ^L produk PCR telah diambil dan dianalisis dengan elektroforesis pada koloid agar 1.5 peratus. Imej itu diambil dalam sistem pengimejan UVP BioDoc-It. Asid deoksiribonukleik pelengkap (cDNA) transkripsi terbalik telah diambil dan PCR dilakukan menggunakan Kit Supermix Hijau IQ SYBR. Kemudian, ia dianalisis dengan Perisian Sistem Optik iQTM 5. Protein diekstrak dengan menggunakan reagen pengekstrakan protein (T-PER). Kemudian, 20 mg homogenat testis ditambah kepada 400 ^L T-PER dan disentrifugasi (Empar Berkelajuan Tinggi, Hettich CR-12, Tuttlingen, Jerman) pada 4 darjah (125,000 xg) untuk 20 min. Kaedah berikut adalah serupa dengan "analisis pengenalpastian dan kuantifikasi protein" analisis in vitro.
2.3.Analisis Statistik
Keputusan percubaan dinyatakan sebagai min 土 sisihan piawai (Min 土 SD) dan data dianalisis menggunakan perisian Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, Amerika Syarikat. Perbezaan antara kumpulan dianalisis dengan analisis varians sehala (ANOVA). Perbandingan berbilang kumpulan berbeza telah dianalisis oleh ujian Duncan pada nilai p < 0.05="" sebagai="" aras="">
