Echinacoside Melambatkan Penuaan Selular Sel Fibroblastik Manusia MRC-5

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Bahan aktif Cistanche: Bagaimanakah echinacoside anti-penuaan?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

Dalam kajian ini, kesan echinacoside, salah satu phenylethanoids yang diasingkan daripada batang salsa Cistanches, ubat herba tradisional Cina, pada sel MRC-5 fibroblastik paru-paru embrio manusia, telah disiasat. Aktiviti percambahan sel telah dinilai dengan Alamar Blue, menunjukkan bahawa rawatan dengan echinacoside boleh melambatkan penuaan. Keputusan sitometri aliran menunjukkan bahawa echinacoside boleh mencetuskan sel dalam fasa G1 untuk memasuki fasa S dan fasa G2, dan boleh meningkatkan degradasi ROS. Keputusan daripada ujian komet menunjukkan bahawa echinacoside boleh melindungi sel daripada kerosakan DNA, sebahagiannya menjelaskan mekanisme kesannya. Semua keputusan di atas menunjukkan bahawa echinacoside mempunyai potensi aktiviti anti-penuaan.

Cistanche deserticola mempunyai banyak kesan, klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pengenalan

Sel normal yang dikultur secara in vitro membiak untuk bilangan yang terhad penggandaan populasi ('had Hayflflick') dan memasuki peringkat penuaan replikatif. Sel sensen mengalami penahanan pertumbuhan sel dalam fasa G1 dan perubahan dalam morfologi dan metabolisme, termasuk pembesaran selular, peningkatan biogenesis lisosom dan ekspresi aktiviti -galactosidase yang lebih tinggi pada pH 6 (senescence-associated -galactosidase, SA- - -Gal ) (Hayflflick dan Moorhead 1961; Dimri 1995). Pengumpulan sel senescent meramalkan penurunan berkaitan usia dalamtisu/organfungsi. Untuk mengakses cara melambatkan atau membalikkan penuaan, usaha untuk menemui bahan anti-penuaan aktif tidak pernah berhenti.Echinacosideadalah salah satu feniletanoid yang diasingkan daripada batangsalsa cistanches, ubat herba tradisional Cina, yang mempunyai potensi aktiviti biologi, baik sebagai antiserum dananti-keletihanejen (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Ia juga telah dilaporkan berkelakuan in vitro sebagai kuatpercumaradikalpemulung(Facino et al. 1995) dan pameranneuroprotektifaktivitiin vitro dan in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside mungkin merupakan calon untuk bahan anti-penuaan, dan aktiviti anti-penuaan mungkin merupakan salah satu sifat biologinya. Oleh itu, kami merawat saluran sel fibroblastik paru-paru embrio manusia tua MRC-5 dengan echinacoside, menjangkakan ia boleh melambatkan atau membalikkan penuaan.

2. Siasatan dan keputusan

Pertama, kami menambah echinacoside ke dalam medium kultur untuk memeriksa pengaruhnya terhadap pertumbuhan sel dan kitaran sel. Telah diperhatikan bahawa daya maju sel dengan pendedahan 48 jam kepada echinacoside meningkat jelas berbanding kawalan, apabila kepekatan meningkat (Rajah 1A), menunjukkan bahawa echinacoside membantu sel senescent membiak. Keputusan pewarnaan SA- Gal menunjukkan bahawa paras SA- -Gal menurun dengan jelas selepas rawatan echinacoside (data tidak ditunjukkan), menunjukkan bahawa sebahagian daripada sel senescent telah diterbalikkan daripada senescence. Untuk mengesahkan sama ada sel senescent memang didorong untuk membiak oleh echinacoside, fellow cytometry telah diperkenalkan untuk memeriksa perubahan fasa kitaran sel sel MRC senescent-5 selepas rawatan dengan echinacoside. Dalam kajian kami, kami mendapati bahawa dengan kepekatan Echinacoside meningkat, nisbah sel dalam tempoh G1 dikurangkan secara beransur-ansur. Sebaliknya, lebih banyak sel telah didorong untuk memasuki fasa S dan fasa G2 (Rajah 1B). Pengumpulan fokus heterochromatin (SAHF) yang berkaitan dengan penuaan adalah satu lagi biomarker spesifik sel senescent (Shay dan Wright 2001). Sel senescent memaparkan fokus DNA bertitik yang divisualisasikan oleh pewarnaan Hoechst (Rajah 1C). Sebaliknya, sel MRC-5 yang dirawat dengan echinacoside kelihatan mempunyai kurang SAHF.

Tahap spesies oksigen reaktif (ROS) meningkat apabila sel menghampiri had Hayflflick (Hutter et al. 2002). Rawatan berterusan terhadap sel dengan tahap sub-mematikan ROS bukan sahaja meningkatkan tahap produk kerosakan oksidatif seperti lipofuscin (Sitte et al. 2001) tetapi juga menyebabkan penahanan pertumbuhan kekal disertai dengan pengaktifan perencatan pertumbuhan p53- laluan (Toussaint et al. 2000). Oleh itu, pada peringkat selular, ROS memainkan peranan penting dalam mendorong penuaan. Pewarna pendarfluor FL DCFH-DA digunakan untuk mengukur kandungan ROS dengan sesama sitometri. Telah ditunjukkan bahawa berbanding dengan kawalan, kandungan ROS telah berkurangan dengan jelas dalam sel yang diinkubasi dengan echinacoside (Rajah 2A). Keputusan ini menunjukkan bahawaechinacosidemungkin bertindak sebagai anti-oksidan, menurunkan pengeluaran ROS atau mempercepatkan penyingkiran ROS.

Spesies oksigen reaktif terkumpul (ROS) menyebabkan kemerosotan ketara makromolekul dalam sel, termasuk protein, DNA dan telomer (Kovtun et al. 2007). Kerosakan DNA oksidatif mencetuskan penangkapan pertumbuhan53-bergantung pada G1, berikutan ungkapan p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) dan penuaan sel dalam fibroblas manusia normal. Kami menggunakan ujian komet untuk mengukur kerosakan DNA dan pembaikannya. Saiz serpihan DNA dan bilangan pecahan menentukan penghijrahan dan corak komet yang dilihat. Kandungan DNA ekor (produk panjang ekor dan kandungan DNA ekor) meningkat dengan kerosakan. Keputusan kami menunjukkan bahawa prarawatan dengan echinacoside sebahagiannya boleh menggalakkan pembaikan kerosakan DNA, sekurang-kurangnya melindungi sel daripada lesi DNA yang disebabkan oleh H2O2 (Rajah 2B). Berdasarkan fakta ini, kami membuat kesimpulan bahawa echinacoside mempunyai aktiviti anti-penuaan sekurang-kurangnya dalam sel MRC{12}}. Hasil kajian kami menunjukkan bahawa echinacoside boleh mengurangkan pengumpulan ROS, melindungi sel daripada kerosakan DNA, menggalakkan sel MRC-5 daripada fasa G1 ke fasa S dan G2, dan dengan itu meningkatkan pembiakan sel. Secara umumnya, kesan echinacoside pada sel MRC-5 boleh dibahagikan kepada dua aspek: untuk menggalakkan percambahan sel dan untuk mengurangkan pengumpulan ROS. Walaupun mekanisme tepat penuaan sel masih tidak diketahui dan rangkaian peraturan kitaran sel kekal kontroversi, kami telah menunjukkan bahawa echinacoside boleh melindungi sel daripada kerosakan oksidatif. Oleh itu, kami membuat spekulasi bahawaechinacosidemungkin calon yang baik untuk mengawal selia penuaan, walaupun mekanisme asas yang tepat masih menjadi persoalan terbuka dan kajian lanjut sedang dijalankan.

3. Eksperimen

3.1. Kultur dan rawatan sel

Talian sel fibroblastik paru-paru embrio manusia MRC{{0}} (Institut Biokimia dan Biologi Sel, SIBS, CAS) dikekalkan dalam medium penting minimum yang diubah suai (Gibco/BRL) dan ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin. Sel MRC-5 mengalami penuaan replikatif selepas berbilang laluan sel, dinilai dengan memperlahankan metabolisme dan pemberhentian pembahagian dalam masa 7 hari. Semua kultur disemai pada ketumpatan sel 104/cm2 melainkan dinyatakan sebaliknya dan dibenarkan membiak, tidak terganggu, selama 7 hari. Pelbagai kepekatan echinacoside telah ditambah 48 jam sebelum pemeriksaan dengan pelarut sebagai kawalan melainkan dinyatakan sebaliknya. Kepekatan DMSO dalam budaya adalah kurang daripada 0.3 peratus (v/v). Untuk rawatan H2O2, sel telah diinduksi dengan 250 M H2O2 selama 12 jam.

3.2. Ujian kadar kelangsungan hidup

Sel telah dikultur dan dirawat dengan echinacoside pada 96 plat telaga. Sebelum pengesanan, 10 peratus Alamar BlueTM telah ditambah ke dalam medium dan diinkubasi selama 4 jam. Penyerapan diukur dengan spektrofotometer.

3.3. Analisis sitometri aliran

Sitometri aliran diperkenalkan untuk mengukur kandungan DNA dan tahap ROS intraselular masing-masing menggunakan propidium iodide dan DCFH-DA. Sel disalut pada ketumpatan 105sel/10 ml larutan sel dalam pinggan berdiameter 100 mm dan ditambah dengan echinacoside selama 48 jam selepas pembenihan sel. Selepas rawatan 48 jam, sel dituai dan dibasuh dalam PBS selepas sentrifugasi, kemudian digantung semula dalam larutan PBS dengan 0.1 peratus RNase dan 50 g/ml propidium iodide atau medium kultur yang mengandungi 10 M DCFH-DA selama 30 minit. Kandungan DNA atau ROS kemudiannya ditentukan oleh pengisihan sel yang diaktifkan pendarfluor FL pada Sistem Sitometri Aliran Beckman Coulter. Data telah dianalisis oleh perisian MultiCycle.

3.4. Pewarnaan Hoechst

Sel telah dikultur dan dirawat dengan echinacoside selama 48 jam pada plat 96 sumur. Medium dikeluarkan, Sel dibasuh dengan PBS, kemudian difiksasi dengan 4 peratus formaldehid dalam PBS selama 20 minit, diikuti dengan pencucian dengan PBS sekali, dan diwarnakan dengan pewarna Hoechst selama 10 minit. Gambar telah ditangkap.

3.5. Elektroforesis gel sel tunggal (ujian komet)

Ujian komet telah dijalankan seperti yang dilaporkan (Olive dan Banath 2006). Imej komet individu dianalisis dengan perisian CometScore. Pengiktirafan: Kerja ini disokong secara kewangan oleh Program Penyelidikan Asas Kebangsaan (Projek 973) China (No. 2007CB507406), Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (No. 30572341), dan Dana Sains Perubatan Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008 ).