Echinacoside Menginduksi Kematian Sel Kanser Apoptotik Dengan Menghalang Enzim Pembersih Kolam Nukleotida MTH1

Bahagian Satu Bagaimana echinacoside menghalang apoptosis sel dan meningkatkan daya ingatan

Untuk maklumat lanjut sila hubungi: Ali.ma@wecistanche.com

Abstrak:Perencatan enzim sanitasi kolam nukleotida MTH1 menyebabkan kerosakan DNA oksidatif yang meluas dan apoptosis dalam sel kanser dan oleh itu boleh digunakan sebagai strategi antikanser. Memandangkan produk semulajadi telah menjadi sumber yang kaya dengan bahan kimia perubatan, dalam kajian ini, kami menggunakan reaksi enzimatik bermangkin MTH1-sebagai ujian saringan vitro berdaya tinggi untuk mencari sebatian semula jadi yang mampu menghalang MTH1.Echinacoside, sebatian yang diperoleh daripada tumbuhan ubatan Cistanche dan Echinacea, berkesan menghalang aktiviti pemangkin MTH1 dalam ujian in vitro. Rawatan pelbagai saluran sel kanser manusia denganEchinacosidemengakibatkan peningkatan ketara dalam tahap selular guanin teroksida (8-oxoguanine), manakala tahap spesies oksigen reaktif selular kekal tidak berubah, menunjukkan bahawaEchinacosidejuga menghalang aktiviti MTH1 selular. Akibatnya,Echinacosiderawatan mendorong peningkatan segera dan dramatik dalam penanda kerosakan DNA dan pengawalseliaan perencat G1/S-CDK p21, yang diikuti oleh kematian sel apoptosis yang ketara dan penangkapan kitaran sel dalam kanser tetapi tidak dalam sel bukan kanser. Secara keseluruhan, kajian ini mengenal pasti sebatian semula jadi sebagai perencat MTH1 dan mencadangkan bahawa produk semulajadi boleh menjadi sumber penting agen antikanser.

Kata kunci:Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, kerosakan DNA,apoptosis, penangkapan kitaran sel.

Klik untuk kegunaan Cistanche untuk ingatan

pengenalan

Kolam selular dan mitokondria nukleosida trifosfat (NTP) dan deoxynucleoside triphosphate (dNTP) merupakan sasaran penting bagi pelbagai spesies oksigen reaktif (ROS).1–3 Oleh kerana kekhususan polimerase DNA kurang sempurna, 4,5 dNTP teroksida boleh digabungkan ke dalam DNA yang baru disintesis untuk menyebabkan penyimpangan genetik jika tidak diperbaiki.6 Contohnya, bes teroksida utama dalam kumpulan nukleotida, 8-oxoguanine (8-oxoG), boleh berpasangan bes dengan sitosin dan adenin. Apabila dimasukkan ke dalam adenine bertentangan semasa replikasi DNA, ia berpotensi menyebabkan T: A=G: C transversion,7 yang merupakan salah satu mutasi yang paling biasa ditemui dalam kanser manusia.8,9 Walaupun kebanyakan dNTP bebas teroksida disingkirkan oleh enzim sanitasi kolam nukleotida, kajian pada masa lalu telah mendedahkan bahawa kolam nukleotida masih merupakan sumber penting asas teroksida dalam molekul DNA dan penyumbang penting kepada kerosakan DNA oksidatif.3,10 Sel mamalia dipersenjatai dengan mekanisme pertahanan yang canggih untuk meminimumkan lesi genomik yang disebabkan oleh ROS. Enzim sanitasi kolam nukleotida menghidrolisis dNTP dan NTP teroksida, dengan itu menghalang penggabungannya ke dalam molekul DNA dan RNA.11,12 MTH1, ahli superfamili hidrolase Nudix (oleh itu juga dipanggil NUDT1),13 ialah trifosfatase yang bertanggungjawab untuk mengeluarkan NTP purin teroksida dan dNTP (8-oxodGTP, 2-OH-dATP, 8-OH-GTP dan 2-OH-ATP) daripada kumpulan nukleotida.14 Sejak 8-oxoguanine (8-oxoG) ialah bes teroksida utama di dalam sel, MTH1 ialah enzim paling penting untuk sanitasi kolam nukleotida.15 Namun begitu, walaupun di bawah pengawasan oleh enzim sanitasi kolam nukleotida, sebahagian besar dNTP teroksida adalah digabungkan ke dalam DNA, dan bes dalam molekul DNA juga boleh dioksidakan secara langsung oleh ROS.6 Sel kemudian bergantung pada strategi yang lebih terperinci yang melibatkan pelbagai glikosilase DNA, seperti OGG1 dan MUTYH, dan proses pembaikan DNA, termasuk pembaikan eksisi asas (BER) dan ketidakpadanan. pembaikan (MMR), untuk menetapkan asas bermasalah dalam molekul DNA.10, 16,17 BER dan MMR biasanya membaiki banyak bes teroksida dalam DNA setiap hari dan dengan itu memainkan peranan penting dalam melindungi integriti dan kestabilan genom.

Dalam sel yang berada di bawah tekanan oksidatif yang tinggi, peningkatan penggabungan nukleotida teroksida ke dalam DNA mungkin mengatasi kapasiti pembaikan selular dan mencetuskan tindak balas kerosakan DNA (DDR).18 Isyarat DDR yang berterusan akan membawa kepada penangkapan kitaran sel, penuaan selular pramatang atau apoptosis, oleh itu. menetapkan halangan untuk tumorigenesis.19 Namun, walaupun sel-sel kanser memaparkan ketegangan oksidatif yang sangat meningkat dan menjana beban nukleotida teroksida yang berpotensi maut,20 mereka boleh bertahan dalam penuaan atau apoptosis yang berkaitan dengan DDR.21 Sebilangan besar kajian telah menunjukkan bahawa MTH1, dengan berkesan membuang 8-oxodGTP dan 2-OH-dATP yang berbahaya dalam sel tumor, memainkan peranan penting dalam perkembangan kanser.22 MTH1 didapati terlalu tertekan dalam pelbagai jenis kanser,23– 25 dan 8-paras oxoG, dan tahap lesi DNA oksidatif adalah lebih rendah pada tumor berbanding tisu normal di sekelilingnya.26–28 Secara fungsional, ekspresi berlebihan MTH1 mengurangkan kebas dengan ketara mutasi DNA yang dilihat dalam fibroblas embrio tetikus yang kekurangan MMR10 dan membenarkan sel mengatasi penuaan dan apoptosis selular pramatang akibat onkogenik Ras;29 manakala penindasan MTH1 menghalang perkembangan kanser dalam OGG1-tikus kekurangan30 dan menggalakkan ROS -induced DDR dan senescence selular dalam Ras-transformed cells.3,29,31 Oleh itu, walaupun MTH1 memainkan peranan perlindungan dengan menghalang mutasi yang disebabkan oleh ROS dalam sel yang sihat, kajian ini mendapati bahawa MTH1 amat diperlukan untuk kemunculan dan survival kanser sel. Kajian terkini telah memberikan lebih banyak bukti untuk menyokong peranan MTH1 dalam perkembangan kanser.31–34 Penindasan MTH1 oleh RNAi atau perencat molekul kecil dalam pelbagai barisan sel kanser mengakibatkan peningkatan ketara penggabungan 8-oxodG ke dalam DNA genomik, yang membawa kepada peningkatan yang ketara. kepada kerosakan DNA yang meluas, kematian sel apoptosis, dan mengurangkan kemandirian sel kanser. 32,33 Dalam kajian xenograf tetikus, perencatan MTH1 dengan cekap menyekat pertumbuhan eksplan kanser. Yang penting, penindasan MTH1 tidak memberi kesan kepada pertumbuhan dan kemandirian sel normal, mungkin kerana sel normal mempunyai ROS yang lebih rendah dan oleh itu kurang bergantung kepada MTH1 untuk kelangsungan hidup.32,33 Penemuan ini menunjukkan bahawa perencatan MTH1 adalah strategi baru yang menjanjikan untuk melawan kanser .

Produk semula jadi telah menjadi sumber yang kaya dengan sebatian perubatan.35 Banyak terapeutik moden, termasuk ubat anti-kanser, telah diperoleh daripada persediaan herba atau botani.36–39 Namun, sebilangan besar herba tradisional dicadangkan untuk memiliki pelbagai sifat terapeutik untuk kekal untuk dicirikan, sebahagian besarnya disebabkan oleh kesukaran dalam mengawal komposisi mereka untuk menentukan dengan jelas keberkesanan dan mekanisme tindakannya.40 Pendekatan baharu yang membolehkan pengesanan sebatian aktif dan analisis mekanisme molekul diperlukan. Dalam hal ini, saringan in vitro berpandukan tinggi berpandukan boleh memainkan peranan penting dalam mencari sebatian perubatan yang ditakrifkan secara mekanis daripada sumber semula jadi. Dalam kajian ini, kami menggunakan tindak balas enzimatik bermangkin MTH1-sebagai ujian in vitro pemprosesan tinggi untuk mencari sebatian semula jadi yang boleh menghalang MTH1. Anehnya, saringan mendedahkan perkara ituEchinacoside, produk semula jadi yang paling terkenal dengan aktiviti antioksidannya yang kuat, mampu menghalang MTH1.

Bahan dan kaedah

Bahan

Sebatian herba semulajadi telah dibeli daripada Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Republik Rakyat China. Nama, nombor katalog, nombor pendaftaran Perkhidmatan Abstrak Kimia (CAS), dan ketulenan setiap sebatian disenaraikan dalam Jadual S1. Penyelesaian stok sebatian telah disediakan dalam 100 peratus dimetil sulfoksida (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Amerika Syarikat), dan penyelesaian berfungsi disediakan dalam penimbal ujian atau medium kultur sel lengkap. Penyelesaian yang sama tanpa sebatian ujian tetapi mengandungi jumlah DMSO yang sama digunakan sebagai kawalan kenderaan. (S)-crizotinib telah dibeli daripada Selleck Chemicals, Houston, TX, Amerika Syarikat.

Pemeriksaan in vitro

Ujian enzimatik in vitro yang digunakan untuk menyaring sebatian herba semulajadi mengikut prosedur yang diterangkan oleh Gad et al.32 Secara ringkas, pencairan bersiri bagi sebatian individu telah disediakan dalam penimbal ujian yang terdiri daripada 100 mM Tris- asetat (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg asetat, 0.005 peratus Tween 20 dan 1 mM DTT. Seterusnya, 0.5 nM manusia rekombinan MTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), dan 0.2 U / mL pyrophosphatases tak organik (Thermo Fisher Scientific) telah ditambah, dan plat diinkubasi pada penggoncang pinggan selama 1 jam pada suhu bilik. Isipadu tindak balas akhir ialah 100 μL pada 96-plat perigi. Pada akhir tindak balas, hijau malachite (J&K Scientific, Beijing, Republik Rakyat China) telah ditambah,41, dan plat diinkubasi pada suhu bilik selama 15 minit lagi. Penyerapan pada 630 nm diukur oleh pembaca mikroplat BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, Amerika Syarikat). Nilai kepekatan perencatan (IC50) ditentukan oleh analisis regresi tak linear menggunakan perisian GraphPad Prism.

Kultur sel

Osteosarcoma MG-63 manusia, hepatokarsinoma SK-HEP-1, kanser payudara MCF7, kanser kolorektal SW480, buah pinggang embrio HEK293 dan garisan sel fibroblas NIH/3T3 tikus adalah daripada American Type Culture Collection, dan normal manusia talian sel hati L-O2 telah dibeli dari KenGen Biotech, Nanjing, Republik Rakyat China. Sel-sel ini dikekalkan pada 37 darjah dalam suasana lembap dengan 5 peratus CO2, mengikut arahan yang diberikan oleh pembekal. Tiada pernyataan etika diperlukan daripada lembaga semakan institusi untuk penggunaan talian sel ini.

Pengukuran 8-oxoG intrasel

Tahap oxoG {{{0}}intraselular diukur dengan pewarnaan dengan Cy3-avidin terkonjugasi.42 Sebanyak 1×104 sel telah disemai pada penutup penutup bulat dalam 12-plat perigi. Keesokan harinya, sel telah dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, atau 80 μMEchinacosideselama 5 jam, 12 jam atau 24 jam dan kemudian dibetulkan dengan metanol sejuk ais selama 20 minit, diikuti dengan pengeraman dalam Tris-buffered saline (TBS) dengan 0.1 peratus Triton X -100 (Sigma-Aldrich) selama 15 minit. Sampel telah disekat dalam TBS dengan 0.1 peratus Triton X-100 dan 15 peratus serum lembu janin selama 1 jam pada suhu bilik dan kemudian diwarnai dengan Cy3-avidin terkonjugasi (0.5 ug/ mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) dalam larutan penyekat selama 1 jam pada 37 darjah . Selepas dicuci dalam salin penampan fosfat (PBS) 3 kali selama 5 minit, slip penutup telah dimeterai pada slaid kaca dalam Sederhana Pemasangan VECTASHIELD dengan 4′,6-diamidino-2-phenylindole (Vector Laboratories, Burlingame, CA , USA). Imej diambil dan dianalisis oleh mikroskop confocal Zeiss LCM 510.

Pengukuran ROS intraselular

Tahap ROS intraselular diukur dengan sitometri aliran menggunakan kit ujian ROS berasaskan sel (Bioteknologi Beyotime, Haimen, Republik Rakyat China). Sel yang ditanam dalam plat enam telaga dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, atau 80 μMEchinacosideselama 5 jam, 12 jam, atau 24 jam, dibasuh dua kali dengan PBS, dan diinkubasi dengan 10 μM dichlorofluorescein diacetate selama 30 minit pada 37 darjah . Sel-sel itu kemudiannya dicuba dan dianalisis oleh sitometer aliran FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, Amerika Syarikat). Tahap ROS intrasel-selular dinyatakan sebagai purata keamatan pendarfluor dichloro di-hydro fluorescein sel. Nombor yang ditunjukkan ialah purata tiga eksperimen bebas.

Pewarnaan imunofluoresen

Sel-sel yang ditanam di atas slip penutup telah dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM atau 80 μMEchinacosideselama 5 jam, 12 jam atau 24 jam dan kemudian dibasuh sekali dengan PBS, tetap dengan 4 peratus paraformaldehid dalam PBS selama 20 minit dan disekat dalam TBS dengan 0.1 peratus Triton X-100 dan 15 peratus serum lembu janin selama 1 jam pada suhu bilik. Sel tetap diwarnakan selama 2 jam pada suhu bilik dengan antibodi utama terhadap 8-oxoG (anti monoklonal tetikus-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (anti arnab-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, USA) atau caspase aktif-3 (anti-caspase arnab-3, Bioss, Beijing, Republik Rakyat China), diikuti dengan pewarnaan dengan Alexa 488-antitikus keldai konjugat ( Abcam) atau Cy3-anti-arnab kambing konjugasi (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu bilik. Selepas dicuci dalam PBS 3 kali selama 5 minit, slip penutup dimeteraikan pada slaid kaca dalam Medium Pemasangan VECTASHIELD dengan DAPI (Vector Laboratories). Imej diambil oleh mikroskop confocal Zeiss LCM 510.

Ujian pembentukan koloni

Sehari sebelum rawatan, sel telah disemai dalam plat enam telaga pada kepekatan 1×104 sel setiap telaga. Mereka kemudian dirawat dengan 0 μM, 60 μM, atau 80 μM Echinacoside selama 7 hari. Selepas mencuci dengan PBS, sel telah ditetapkan dengan metanol sejuk ais dan diwarnai dengan larutan kristal ungu (Sigma Aldrich) (0.5 peratus dalam 25 peratus metanol). Imej diambil selepas mengeringkan pinggan semalaman. Kristal ungu kristal telah dibubarkan dengan menambah 70 peratus etanol, dan penyerapan pada 595 nm diukur oleh pembaca plat mikro BioRad 680. Data dianalisis menggunakan perisian GraphPad Prism.

Ujian MTT

Sehari sebelum rawatan, sel telah disemai dalam 96-plat perigi pada kepekatan 1×104 sel setiap telaga, diikuti dengan rawatan dengan pencairan bersiri Echinacoside selama 24 jam atau 48 jam, atau dengan 60 μM Echinacoside selama 5 jam , 12 jam, atau 24 jam. Medium telah dialih keluar, dan sel telah dibasuh dengan PBS, dan kemudian, 20 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,

5-larutan diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (5 mg/mL dalam PBS, pH 7.2) (Thermo Fisher Scientific) telah ditambahkan pada setiap telaga. Plat diinkubasi pada suhu 37 darjah selama 4 jam lagi. Pada akhirnya, larutan MTT telah dikeluarkan dan 150 μL DMSO ditambahkan ke setiap telaga. Plat telah diinkubasi pada penggoncang plat selama 10 minit, dan penyerapan pada 570 nm diukur oleh pembaca plat mikro BioRad 680. Setiap eksperimen dijalankan dua kali dalam tiga kali ganda. Data dianalisis menggunakan perisian GraphPad Prism. Nilai IC50 ditentukan menggunakan analisis regresi tak linear.

Analisis kitaran sel

Sel dalam plat enam telaga dirawat dengan 0 μM, 6{{10}} μM atau 80 μM Echinacoside selama 24 jam, dituai dengan trypsin (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , dibasuh dua kali dengan PBS, dan kemudian diperbaiki dengan etanol sejuk ais (70 peratus ) selama 2 jam pada -20 darjah . Sel tetap dibasuh dua kali dalam PBS sejuk dan digantung semula dalam 300 μL PBS yang baru disediakan dengan 0.1 peratus Triton X-100, 0.2 mg/mL RNase A (Sigma Aldrich), 10 ug/mL propidium iodide (PI) tanpa DNase. ) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Switzerland). Selepas pengeraman pada 37 darjah dalam gelap selama 20 minit, sel-sel telah ditapis melalui jaringan nilon Falcon (BD Biosciences), dimuatkan ke cytometer aliran FAC-Calibur, dan dianalisis menggunakan perisian ModFit (BD Biosciences).

Analisis pemecahan DNA

Sel-sel yang ditanam dalam plat enam telaga dirawat dengan 0 μM, 60 μM atau 80 μM Echinacoside selama 24 jam dan difiksasi dalam 4 peratus paraformaldehid (Sigma-Aldrich) sejuk ais selama 20 minit. Selepas mencuci dengan PBS, sel telah dimeterai dalam Medium Pemasangan VECTASHIELD dengan DAPI (Makmal Vektor). Morfologi nuklear telah difoto dengan mikroskop pendarfluor Olympus. Untuk mengesan pemecahan DNA pada gel agarose, DNA telah diekstrak menggunakan kit mikro DNA QIAamp (Qiagen NV, Venlo, Belanda), dan elektroforesis dilakukan pada 2 peratus gel agarose yang mengandungi 0.1 ug/mL etidium bromida.

Analisis apoptosis oleh sitometri aliran

Sel apoptosis telah diperiksa menggunakan kit pengesanan Apoptosis Annexin V-FITC (Terbaik, Shanghai, Republik Rakyat China), mengikut arahan pengilang. Sel yang ditanam dalam 96-plat perigi dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM atau 160 μM Echinacoside selama 2 jam, 5 jam, 12 jam atau 24 jam, dibasuh dua kali dengan PBS, dan kemudian digantung semula dalam penimbal pengikat. Seterusnya, 5 μL Annexin V-FITC dan 5 μL PI (Roche) ditambah secara berurutan, dan sel-sel diinkubasi selama 15 minit dalam gelap pada suhu bilik. Sel-sel telah dimuatkan ke cytometer aliran FACSCalibur (BD Biosciences), dan data dianalisis menggunakan perisian Cell Quest (BD Biosciences).

Analisis Western blot

Sel yang ditanam dalam plat enam telaga dirawat dengan 0 μM, 6{{10}} μM atau 80 μM Echinacoside selama 5 jam, 12 jam atau 24 jam, dibasuh dua kali dengan PBS dan mengikis pinggan menggunakan 100 μL penimbal radioimunopresipitasi (150 mM NaCl, 1.0 peratus IGEPAL CA-630, 0.5 peratus natrium deoksikolat, 0.1 peratus natrium dodesil sulfat , dan 50 mM Tris, pH 8.0) (Sigma-Aldrich) yang mengandungi 1 mM fenilmetana sulfonil fluorida. Sampel telah disentrifugasi pada 12,000 × g selama 20 minit pada 4 darjah . Kepekatan protein dalam supernatan ditentukan oleh reagen Bradford (Dingguo, Changchun, Republik Rakyat China). Sampel didenaturasi pada 95 darjah selama 10 minit dan diasingkan pada 12 peratus gel elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida. Selepas elektroforesis, protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (Millipore), diikuti dengan menyekat dalam garam penampan Tris dengan Tween 20 (10 mM Tris, pH 7.5; 100 mM NaCl; 0.1 peratus Tween 20) yang mengandungi 5 peratus (w/v) susu tanpa lemak selama 1 jam pada suhu bilik. Tompok telah disiasat dengan antibodi primer terhadap p21 (Abcam), poli (ADP-ribose) polimerase (Bioss), atau caspase teraktif-3 (Bioss), diikuti oleh antibodi sekunder konjugasi peroksidase lobak pedas (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Isyarat telah dibangunkan menggunakan kit pengesanan chemiluminescence Western blotting yang dipertingkatkan (Trans gen Biotech, Changchun, Republik Rakyat China). Eksperimen diulang tiga kali.

Pengukuran mitokondria

potensi membran

Potensi membran mitokondria diukur menggunakan pewarna JC{{0}} (Bioteknologi), mengikut arahan pengilang. Sel yang ditanam dalam plat enam telaga dirawat dengan 0 μM, 60 μM, atau 80 μM Echinacoside selama 5 jam, 12 jam atau 24 jam, dibasuh dua kali dalam PBS dan kemudian diinkubasi dengan JC-1 selama 20 minit. Imej diambil menggunakan mikroskop pendarfluor Olympus.

Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan Perisian GraphPad Prism. Kepentingan dikira menggunakan analisis varians sehala dan P0.05 dianggap signifikan secara statistik. Keputusan dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai.

Keputusan

Pengenalpastian Echinacoside sebagai perencat MTH1

Untuk mencari sebatian semula jadi yang mampu menghalang MTH1, kami menggunakan MTH1-tindak balas enzimatik bermangkin sebagai pemprosesan tinggi dalam ujian saringan Vitro. Selain nukleotida purin teroksida, MTH1 juga boleh menghidrolisis deoksiguanosin trifosfat normal untuk menghasilkan deoksiguanosin monofosfat dan pirofosfat. Dengan kehadiran pirofosfatase tak organik yang berlebihan, semua pirofosfat ditukar kepada fosfat tak organik, yang boleh dikira menggunakan ujian penyerapan berasaskan hijau malachite, 41 dengan itu membolehkan pengukuran tidak langsung aktiviti MTH1.32 Untuk menguji sistem ujian, kami mula-mula mengukur kesan (S)-crizotinib, sebatian dengan potensi terbukti sebagai perencat MTH1.33 Hasilnya menunjukkan bahawa (S)-crizotinib sememangnya kuat menghalang MTH1 (Rajah 1A) dengan IC50 500 nM, iaitu tujuh kali ganda lebih tinggi daripada yang dilaporkan. oleh Huber et al (72 nM).33 Ini mungkin disebabkan oleh perbezaan kaedah pengesanan atau sumber bahan kimia dan enzim. Kami menggunakan pendekatan kromogenik yang kurang sensitif, manakala Huber et al menggunakan kaedah bioluminesen yang sangat sensitif.33 Dengan mengingati perkara ini, kami menyaring 12 sebatian semula jadi yang tersedia secara komersil (Jadual S1), yang setiap satunya merupakan ramuan utama herba tradisional yang berpotensi sebagai antitumor. aktiviti. Echinacoside, sebatian yang disucikan daripada tumbuhan ubatan parasit Cistanche salsa (Rajah 1C), menghalang tindak balas dengan ketara (Rajah 1B), dengan IC50 sebanyak 7.01±2.13 μM (Rajah 1D). Menambah 50 kali lebih pyrophosphatase tidak mempunyai kesan ke atas hasilnya manakala menambah lima kali lebih banyak protein MTH1 dengan ketara mengurangkan tahap perencatan, menunjukkan bahawa Echinacoside secara khusus menghalang aktiviti MTH1 dalam ujian enzimatik in vitro.

Echinacoside menghalang MTH1 selular untuk meningkatkan 8-oxoG intraselular

Seterusnya, kami bertanya sama ada Echinacoside boleh menghalang aktiviti MTH1 intraselular. Perencatan MTH1 selular akan meningkatkan 8-oxoG intrasel. Avidin telah ditunjukkan untuk mengikat kepada 8-oxoG dengan kekhususan yang tinggi;42 oleh itu, kami menggunakan pewarnaan imunofluoresen dengan Cy3-avidin terkonjugasi untuk membandingkan 8-paras oxoG intraselular dalam pelbagai saluran sel kanser sebelum dan selepas rawatan Echinacoside. Osteosarkoma MG-63 manusia, hepatokarsinoma SK-HEP-1, MCF{{10}} dan sel kanser kolorektal SW480 telah dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, atau 80 μM Echinacoside selama 5 jam, 12 jam atau 24 jam. Pewarnaan dengan Cy3-avidin terkonjugasi mendedahkan bahawa rawatan dengan 60 μM Echinacoside selama 24 jam dengan jelas dan ketara meningkatkan tahap 8-oxoG (Cy3-bahan reaktif avidin) selular dalam sel-sel kanser ini ( Rajah 2A dan B). Kepekatan yang lebih tinggi (80 μM) Echinacoside menghasilkan pewarnaan oxoG 8-selular yang lebih kuat (Rajah 2B), mencadangkan hubungan tindak balas dos. Keputusan yang sama diperoleh dengan pewarnaan imunofluoresen dengan antibodi anti-8-oxoG monoklonal tetikus (Rajah S1A).43 Kepekatan Echinacoside (60 μM) yang diperlukan untuk peningkatan ketara dalam 8-oxoG selular adalah jauh lebih tinggi daripada IC50 (7.01 μM) daripada ujian in vitro. Ini mungkin disebabkan oleh perbezaan sensitiviti kedua-dua ujian. Pewarnaan imunofluoresen jauh kurang sensitif daripada ujian enzimatik in vitro; tambahan pula, bilangan molekul perencat yang boleh mencapai dan berinteraksi dengan MTH1 selular dipengaruhi oleh proses biologi yang kompleks; selain itu, dalam ujian in vitro, dGTP yang kurang digemari digunakan sebagai substrat, dan oleh itu mungkin lebih mudah (mengambil lebih sedikit perencat) untuk menghalang MTH1, menghasilkan IC50 yang lebih rendah dalam ujian in vitro.

{{0}}oxoG selular dijana oleh ROS, yang dilawan oleh antioksidan. Oleh itu, peningkatan dalam ROS selular atau penindasan aktiviti antioksidan juga akan mengakibatkan peningkatan paras 8-oxoG selular. Echinacoside sendiri adalah antioksidan kuat44,45 dan oleh itu harus meningkatkan dan bukannya menyekat aktiviti antioksidan. Untuk memeriksa sama ada tahap ROS selular telah diubah oleh rawatan Echinacoside, sel kanser yang sama telah dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, atau 80 μM Echinacoside selama 5 jam, 12 jam, atau 24 jam dan kemudian dianalisis mengikut aliran sitometri selepas pewarnaan dengan probe pendarfluor 2',7'-dichlorofluorescein diacetate. Keputusan menunjukkan bahawa tiada rawatan ini mengubah tahap ROS selular (Rajah 2C dan D). Oleh itu, peningkatan tahap 8-oxoG selular berkemungkinan besar disebabkan oleh perencatan MTH1 oleh Echinacoside.

Echinacoside menyebabkan kerosakan DNA yang meluas khususnya dalam sel-sel kanser Penggabungan {{0}}oxoG ke dalam DNA akan merangsang BER dan MMR, yang menjana pecahan DNA rantai tunggal (SSB) dan jurang.16,17 Biasanya, pecahan ini, dan jurang dimeterai oleh mekanisme pembaikan yang melibatkan pengisian celah dan pengikatan oleh polimerase dan ligase DNA.46,47 Walau bagaimanapun, peningkatan pesat dalam SSB selular boleh memenuhi kapasiti pembaikan selular, yang membawa kepada pembentukan banyak pecahan DNA rantai ganda (DSB)18 dan isyarat DDR. Untuk memeriksa sama ada peningkatan 8-oxoG selular yang disebabkan oleh Echinacoside menyebabkan kerosakan DNA, kami telah memeriksa salah satu penanda awal kerosakan DNA, 53BP1, yang mengikat tapak DSB sebagai tindak balas selular terawal kepada DSB.48 MG -63, SK-HEP-1, MCF-7, dan garisan sel kanser SW480 dan garisan sel bukan kanser hati normal manusia L-O2,49 buah pinggang embrio manusia HEK 293 dan fibroblas tikus NIH /3T3 telah dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, atau 80 μM Echinacoside selama 5 jam, 12 jam atau 24 jam. Immunostaining pendarfluor menunjukkan bahawa rawatan dengan 60 μM Echinacoside selama 24 jam secara khusus meningkatkan bilangan sel dengan lima atau lebih fokus nuklear 53BP1 yang ternoda kuat dalam semua kanser tetapi tidak dalam mana-mana garisan sel bukan kanser (Rajah 2E dan F). Peningkatan ketara dalam bilangan sel 53BP1 plus dilihat seawal 5 jam selepas memulakan rawatan Echinacoside (Rajah 2F). Kepekatan yang lebih tinggi (80 μM) Echinacoside atau masa rawatan yang lebih lama (12 jam dan 24 jam) menghasilkan peningkatan yang lebih besar dalam kedua-dua bilangan 53BP1 tambah sel (Rajah 2F) dan bilangan fokus 53BP1 selular. Bersama-sama, keputusan ini mencadangkan bahawa perencatan MTH1 oleh Echinacoside menyebabkan 8-pengumpulan oxo dan kerosakan DNA yang meluas dalam kanser tetapi tidak dalam sel bukan kanser.

Echinacoside menghalang percambahan sel kanser

Dalam sel berbasikal, pecahan untai DNA yang tidak dibaiki akan menyebabkan keruntuhan garpu replikasi DNA, yang kemudiannya akan membawa kepada penyumbatan percambahan sel dengan induksi penangkapan kitaran sel dan apoptosis.50 Untuk menyemak kesan Echinacoside pada pertumbuhan dan percambahan sel, kita mula-mula menganalisis pertumbuhan sel kanser MG-63 yang dirawat Echinacoside, SK-HEP-1, MCF-7 dan SW480 melalui ujian pembentukan koloni. Keputusan menunjukkan bahawa sel-sel kanser yang dirawat dengan 60 μM atau 80 μM Echinacoside membentuk lebih sedikit koloni, dan koloni yang terbentuk adalah lebih kecil (Rajah 3A dan B), menunjukkan potensi pertumbuhan yang sangat ditindas. Seterusnya, kami menganalisis percambahan sel-sel kanser ini, bersama-sama dengan sel bukan kanser L-O2, HEK 293, dan NIH/3T3 oleh ujian MTT. Keputusan menunjukkan bahawa Echinacoside bergantung kepada dos menghalang percambahan kanser tetapi bukan sel bukan kanser (Rajah 3C). Kajian kursus masa terhadap sel kanser yang dirawat dengan 60 μM Echinacoside menunjukkan bahawa selepas 5 jam, tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara kumpulan bukan rawatan dan rawatan, tetapi selepas 12 jam, percambahan sel kanser telah dihalang dengan ketara oleh 60 μM Echinacoside (Rajah 3D).

Penangkapan kitaran sel akibat Echinacoside

Selaras dengan pemerhatian terhadap pertumbuhan dan percambahan sel, analisis Western blot menunjukkan bahawa rawatan 24 jam dengan 60 μM dan 80 μM Echinacoside dengan ketara meningkatkan tahap protein penyekat G1 /S-CDK dan perencat sintesis DNA p21Cip/ WAF1 dalam sel kanser MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 dan SW480 (Rajah 4A dan B). Selain itu, sama dengan 53BP1, peningkatan ketara dalam tahap protein p21 dilihat seawal 5 jam selepas memulakan rawatan Echinacoside (Rajah 4B). Analisis bilangan sel pada peringkat berbeza kitaran sel oleh sitometri aliran mendedahkan bahawa dos rawatan Echinacoside bergantung kepada mengurangkan peratusan sel dalam kedua-dua fasa S dan G2 / M, manakala peratusan sel dalam fasa G1 meningkat (Rajah 4C dan D). Selepas rawatan 80 μM Echinacoside sel MG-63 selama 24 jam, sel dalam fasa G2 /M menurun daripada 15 peratus kepada hampir sifar, dan sel dalam fasa S menurun daripada 37 peratus kepada 17 peratus, manakala sel dalam G0/ 1 fasa meningkat daripada 43 peratus kepada 80 peratus (Rajah 4E). Keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan dengan Echinacoside menyebabkan penangkapan kitaran sel dan menyekat sel-sel kanser dalam fasa G1.

Apoptosis yang disebabkan oleh Echinacoside dalam sel-sel kanser

Selaras dengan pemerhatian ke atas percambahan sel, analisis Western blot menunjukkan bahawa rawatan dengan 60 μM dan 80 μM Echinacoside selama 24 jam meningkatkan tahap caspase aktif-3 dan protein polimerase terbelah (ADP-ribose) dalam sel-sel kanser (Rajah 5A dan B), mencadangkan induksi apoptosis yang bergantung kepada caspase. Kami kemudian memeriksa beberapa penanda selular apoptosis. Pertama, morfologi nuklear sel kanser yang dirawat Echinacoside telah didedahkan dengan pewarnaan dengan pewarna DNA DAPI, yang menunjukkan bahawa rawatan 24 jam dengan 60 μM dan 80 μM Echinacoside meningkatkan bilangan ciri apoptosis, termasuk pyknosis dan kromatin pekat (nukleus yang lebih cerah. ) (Rajah 5C). Kedua, DNA yang diekstrak daripada sel-sel kanser yang dirawat sama telah dianalisis oleh elektroforesis pada gel agarose, yang mendedahkan corak tangga apoptosis biasa (Rajah S1B). Akhirnya, caspase aktif selular-3 telah dikesan oleh pewarnaan imunofluoresen, yang mendedahkan isyarat caspase{14}} diaktifkan yang kuat dalam sel kanser yang dirawat Echinacoside (Rajah S1C). Seterusnya, peratusan sel apoptosis diukur dengan pewarnaan berganda Annexin V-FITC dan PI dan sitometri aliran. Analisis sel yang dirawat dengan 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM, atau 160 μM Echinacoside selama 2 jam, 5 jam, 12 jam atau 24 jam menunjukkan bahawa 60 μM atau kepekatan Echinacoside yang lebih tinggi menyebabkan apoptosis yang ketara dalam sel kanser MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 dan SW480 (Rajah 6A), tetapi bukan dalam sel bukan kanser L-O2, HEK 293 dan NIH/3T3 (Rajah S2). Selepas rawatan sel MG-63 dengan 60 μM, 80 μM atau 160 μM Echinacoside selama 24 jam, peratusan sel apoptosis masing-masing meningkat daripada 8.89 peratus kepada 33.72 peratus , 39.01 peratus dan 48.12 peratus (Rajah 6A) . Kajian kursus masa menunjukkan bahawa selepas 5 jam, tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara kumpulan bukan rawatan dan rawatan, tetapi apoptosis yang ketara dilihat selepas rawatan dengan kepekatan Echinacoside 60 μM atau lebih tinggi selama 12 jam (Rajah 6B dan S3).

Akhir sekali, pengukuran potensi membran mitokondria oleh pewarna pendarfluor JC-1 jelas menunjukkan kehilangan potensi membran mitokondria yang ketara selepas rawatan dengan 60 μM Echinacoside selama 12 jam (Rajah 6C), tetapi tidak selepas 5 jam, menunjukkan pengaktifan laluan apoptosis intrinsik berikutan kerosakan DNA yang disebabkan oleh 8-oxodG yang tinggi.