Penentuan Echinacoside dalam Ekstrak Air Cistanche Herba Oleh HPLC

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Kolej Perubatan Klinikal Ketiga Universiti Perubatan Cina Guangzhou, Guangzhou 510405 Guangdong, China; 2. Hospital Gabungan Ketiga Universiti Perubatan Cina Guangzhou,Guangzhou 510378 Guangdong,China） 

Abstrak: Objektif Kaedah HPLC telah ditubuhkan untuk penentuanEchinacosidedalam ekstrak air Cistanche deserticola. KaedahEchinacoside ditentukan oleh HPLC. Pemisahan dilakukan pada Inertsil ODSSP C18 lajur dengan fasa bergerak terdiri daripada asetonitril（A）dan 0.4 peratus larutan asid fosforik（B）,melalui elusi kecerunan. Panjang gelombang pengesanan ditetapkan pada 333 nm,dan suhu lajur ialah 30 darjah . Kadar alir ialah 1.0 mL·min-1 dan isipadu suntikan ialah 10 μL.KeputusanHubungan linear echinacoside dalam julat kepekatan 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 adalah baik（r = 0.999 8）. Pemulihan adalah 94.59 peratus -105.31 peratus（RSD= 2.93 peratus,n = 9）. Kandungan echinacoside dalam ekstrak air herba Cistanche ialah 15.527,7.347,12.267 mg·g-1 . 

Kesimpulan: Kaedah HPLC yang ditetapkan dengan kebolehulangan yang baik adalah tepat,mudah dan boleh dilaksanakan. Ia sesuai untuk penentuan echinacoside dalam ekstrak airCistanche deserticola ma. 

Kata kunci:HPLC;ekstrak air daripadaCistanche deserticola;Echinacoside;penentuan kandungan

Cistanche deserticolaadalah tonik yang biasa digunakan dalam perubatan tradisional Cina dalam amalan klinikal, dan mempunyai reputasi "ginseng padang pasir". Cistanche deserticola yang termasuk dalam edisi 2015 Chinese Pharmacopoeia ialah batang kering, bersisik, berdaging bagi tumbuhan Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma atau Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Ia mempunyai sifat hangat, rasa manis dan masin, dan tergolong dalam meridian buah pinggang dan usus besar. Ia mempunyai kesan mengencangkan buah pinggang, memberi manfaat kepada pati dan darah, melembapkan usus, dan melegakan sembelit [2]. 

ginseng padang pasir

"Shennong Materia Medica Classic" menyatakan bahawa ia boleh "menyuburkan bahagian tengah, menyuburkan lima organ dalaman, dan menguatkan yin dan menyuburkan intipati.".Cistanche deserticola terutamanya mengandungi glikosida phenylethanoid, iridoid dan glikosida, lignan dan glikosida, polisakarida, ester, dan alkaloid [3].Phenylethanol glikosidaadalah komponen aktif utamaCistanche deserticola, antaranya echinacea dan poolside adalah komponen penunjuk untuk pengenalpastian dan penentuan kandungan Cistanche deserticola dalam Pharmacopoeia Cina. 

Phenylethanol glycoside adalah komponen aktif utama Cistanche deserticola

Kajian farmakologi [4] menunjukkan bahawa Cistanche deserticolamempunyai pelbagai kesan farmakologi seperti melembapkan usus dan melegakan sembelit, melindungi hati, menentang osteoporosis, antioksida, anti-penuaan, dan anti-keletihan.. Ekstrak akueus daripadaCistanche deserticolaboleh menggalakkan protein morfogenetik tulang 2 gen osteoblas pada tikus, serta fosfatase asid tahan tartrat dan osteocalcin dalam serum tikus yang diovariektomi., serta gen Smad1 dan Smad5 dan mengubah faktor pertumbuhan dalam sumsum tulang- Ungkapan, dsb., mempunyaikesan anti-osteoporosis [5-6]. Echinoside boleh menggalakkan percambahan osteoblas dan menggalakkan pembezaan sel stem mesenchymal sumsum tulang kepada osteoblas secara in vitro[7-9]. 

Echinoside, komponen kimia utama Cistanche deserticola

Klik di sini untuk melihat produk Natural Cistanche Echinacoside

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, terdapat banyak laporan mengenai penentuan kandungan echinacoside dan poolside dalam ekstrak alkohol Cistanche deserticola dan penyediaan kompaunnya [10-12], tetapi terdapat beberapa laporan mengenai penentuan kandungan komponen penunjuk dalam ekstrak air Cistanche deserticola. Dalam kajian ini, kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) digunakan untuk menentukan kandungan echinacoside dalam ekstrak air Cistanche deserticola.

1. bahan

1.1 Radas

LC-20AT kromatografi cecair berprestasi tinggi, SPD-20Pengesan, SIL-20Pensampel automatik, CTO-10kotak suhu lajur ASvp, stesen kerja kromatografi cecair LCsolution, Shimadzu Corporation Jepun; MES125P-OCE-DU Baki Analitikal Elektronik, Sartorius, Jerman; SHZ-D (III) pam vakum pelbagai guna air beredar, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 sistem peredaran penyejukan penyejat berputar, penyejat berputar RV10DS96, IKA, Jerman; Mandian Air Termostatik Elektrik DK-S26, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Mesin air ultra-tulen siri UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Bahan Ubat dan Reagen

Bahan ubat Rong Daging, dibeli dari Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., nombor kelompok: 18010011806001, 181001. Batang kering, bersisik, berdaging dari tumbuhan Leobaceae Cistanche deserticola yang dikenal pasti oleh Ketua Pakar Herba Cina Tu Xingming Third. Hospital Universiti Perubatan Cina Tradisional Guangzhou disimpan di Bilik Pemeriksaan Dadah Hospital Gabungan Ketiga Universiti Perubatan Cina Tradisional Guangzhou; Bahan rujukan Echinoside, kandungan 89.7 peratus , China Institute for the Control of Food and Drug Control, nombor kelompok: 111670-201706; Acetonitril adalah tulen dari segi kromatografi (Merck, Jerman); Metanol dan asid fosforik adalah tulen secara analitik (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Air adalah air ultra-tulen.

2. Kaedah dan Keputusan

2.1 Penyediaan Ekstrak Air daripada Cistanche deserticola

Ambilserbuk cistanche, tambahkan 10 kali ganda jumlah air suling, haba dan refluks untuk mengekstrak dua kali, setiap kali selama 1 jam. Tapis, gabungkan turasan dan gunakan penyejat berputar untuk menumpukan turasan kepada kandungan dadah mentah sebanyak 0.100 g · mL-1. Simpan pada 4 darjah untuk siap sedia. 2.2 Keadaan kromatografi dan kesesuaian sistem Lajur kromatografi: Lajur InertsilODS SPC18 (150mm × 4.6mm,5 μm）; Fasa mudah alih: asetonitril (A) - 0.4 peratus larutan asid fosforik (B), elusi kecerunan: 0~ 5min, 17 peratus A; 5~25min,20 peratus A; 25~30min,17 peratus A; Panjang gelombang pengesanan: 333nm; Suhu lajur: 30 darjah ; Kadar alir: 1.0mL · min-1; Isipadu suntikan: 10 μ L. Di bawah keadaan kromatografi ini, resolusi antara puncak echinacea dan komponen bersebelahan adalah lebih besar daripada 1.5, dan bilangan teori lajur tidak boleh kurang daripada 4000 untuk puncak echinacea. Kromatogram ditunjukkan dalam Rajah 1.

Rajah1 Kromatogram HPLC echinacoside（A）dan ekstrak air herba Cistanche（B）

2.3 Penyediaan penyelesaian

2.3.1 Penyelesaian rujukan

Timbang jumlah yang sesuaiEchinacetinbahan rujukan, timbang dengan tepat, letakkan dalam kelalang volumetrik 10mL, tambah metanol untuk larut, dan jadikan ia mengandungi 898.794 Echinacetin setiap mililiter μ G larutan rujukan, disimpan pada 4 darjah untuk siap sedia.

Echinoside daripada Cistanche deserticola

2.3.2 Penyelesaian ujian

Sukat 2 dengan tepat.0 mL ekstrak akueus Cistanche deserticola, sejat dalam tab mandi air, larut dalam metanol, bawa kepada isipadu tetap dalam 10 kelalang volumetrik mL, goncang dengan baik, 0.22 μ M microporous penapisan membran, iaitu.

2.4 Penyiasatan perhubungan linear

Ukur {{0}} dengan tepat.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, dan 3.00 mL larutan rujukan di bawah 2.3.1 dan letakkannya dalam kelalang volumetrik 5 mL, tambah metanol kepada isipadu malar dan goncang dengan baik untuk mendapatkan kepekatan kecerunan 44.9397, 89.8794, 179.7588, 359.54976, 359.5176, , dan 539.2764 μ G · mL-1 larutan rujukan, 0.22 μ M penapisan membran mikroporous. Lakukan penentuan mengikut keadaan kromatografi dalam 2.2 dan rekodkan kawasan puncak. Menggunakan kepekatan jisim bahan rujukan sebagai absis (X, μ G · mL-1), kawasan puncak ialah ordinat (Y), dan persamaan regresi linear diperoleh: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Keputusan menunjukkan bahawa echinacea berjulat dari 44.9397 hingga 539.2764 μ Hubungan linear dalam julat kepekatan g · mL-1 adalah baik.

2.5 Ujian ketepatan

Ambil larutan rujukan 539.2764 μ G · mL-1, suntik sampel secara berterusan 6 kali mengikut keadaan kromatografi dalam 2.2, dan rekodkan kawasan puncak. Keputusan RSD bagi kawasan puncak echinacea ialah 1.81 peratus, menunjukkan ketepatan instrumen yang baik.

2.6 Ujian kestabilan

Mengukur 2 dengan tepat.0 mL daripadaCistanche deserticolaekstrak akueus, sejat hingga kering dalam tab mandi air, larut dalam metanol, bawa kepada isipadu tetap dalam kelalang volumetrik 10 mL, goncang dengan baik, 0.22 μ Tapis dengan membran mikroliang, suntik sampel untuk penentuan pada 0, 2, 4, 8, 12, dan 24 jam mengikut keadaan kromatografi dalam 2.2, dan merekodkan kawasan puncak. Keputusan RSD bagi kawasan puncak echinacea ialah 1.16 peratus, menunjukkan bahawa penyelesaian ujian mempunyai kestabilan yang baik dalam masa 24 jam.

2.7 Ujian kebolehulangan

Sukat dengan tepat 6 bahagian 2.0 mL akueusekstrak Cistanche deserticola, sediakan 6 bahagian larutan ujian secara selari mengikut kaedah yang diterangkan dalam 2.3.2, suntikan sampel untuk penentuan mengikut keadaan kromatografi yang diterangkan dalam 2.2, dan rekodkan kawasan puncak. Keputusan RSD kepekatan jisim echinacea ialah 1.28 peratus, menunjukkan bahawa kaedah tersebut mempunyai kebolehulangan yang baik.

Percubaan Cistanche deserticola

2.8 Ujian Pemulihan Penambahan Contoh

Ukur 9 bahagian 1 dengan tepat.0 mL daripadaCistanche deserticolaekstrak akueus, tambah {{0}}.8, 1.0, dan 1.2 mL larutan rujukan (101.552 mg · mL - 1), sejat dalam tab mandi air, larut dalam metanol, dan bawa ke isipadu dalam kelalang volumetrik mL; Goncang dengan baik, 0.22 μ Tapis dengan membran penapis mikroporous m untuk menyediakan larutan ujian kepekatan tinggi, sederhana dan rendah. Sediakan 3 bahagian setiap kepekatan secara selari, ukur mengikut keadaan kromatografi dalam 2.2, rekodkan kawasan puncak, dan kira pemulihan ketagihan sampel. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 1.

2.9 Penentuan kandungan sampel

Ukur 3 bahagian 2 dengan tepat.0mLekstrak air daripada Cistanche deserticola, sejat hingga kering dalam tab mandi air, larut dalam metanol, bawa kepada isipadu malar dalam 10mL kelalang volumetrik, goncang dengan baik, 0.22 μ Tapis dengan membran mikroliang, ukur mengikut keadaan kromatografi dalam 2.2, rekod kawasan puncak, dan kira kandungan echinacea. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 2.

Jadual 1 Keputusan ujian pemulihan echinacoside

Jadual 2 Keputusan penentuan kandungan echinacoside dalam ekstrak air herba Cistanche

3.Perbincangan

3.1 Kaedah penyediaan artikel ujian

Ekstrak akueus daripadaCistanche deserticolamengandungi pelbagai komponen kimia seperti fenil etanol glikosida dan polisakarida, yang menyebabkan gangguan tertentu terhadap komponen yang akan diuji. Kajian ini menyiasat dua kepekatan berbeza pelarut, 50 peratus metanol, dan metanol. Keputusan menunjukkan bahawa kesan pemisahan puncak dalam kromatogram produk ujian menggunakan 50 peratus metanol kerana pelarut adalah lemah antara echinacea dan komponen bersebelahan; Menggunakan metanol sebagai pelarut, resolusi puncak glikosida echinacea adalah baik, dan tiada gangguan daripada puncak kekotoran lain. Oleh itu, metanol dipilih sebagai pelarut untuk larutan ujian. Menggunakan metanol sebagai pelarut, ekstrak air Cistanche deserticola disejat hingga kering dalam mandi air. Dua kaedah rawatan telah digunakan: pembubaran metanol, goncangan isipadu malar, dan pelarutan ultrasonik metanol (10 min). Keputusan menunjukkan bahawa tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara kedua-dua kaedah. Kaedah ini dipilih untuk menyediakan penyelesaian ujian kerana operasi mudah pelarutan metanol dan gegaran isipadu malar.

cistanche herba cina

3.2 Pemilihan fasa mudah alih

Dalam kajian ini, rujukan telah dibuat kepada fasa mudah alih (metanol-0.1 peratus asid formik) yang digunakan untuk penentuan kandungan Cistanche deserticola dalam Chinese Pharmacopoeia (Jilid I) (2015). Keputusan menunjukkan bahawa puncak glikosida echinacea melebar dan terdapat fenomena kelebihan utama, yang mungkin berkaitan dengan keupayaan elusi lemah fasa mudah alih; Merujuk kepada literatur yang berkaitan [12-13], asetonitril-0.5 peratus asid asetik digunakan sebagai fasa mudah alih, tetapi bentuk puncak echinacea adalah lemah dan terdapat fenomena ekor. Memandangkan nilai pH fasa mudah alih, asetonitril-0.4 peratus asid fosforik akhirnya digunakan sebagai fasa mudah alih. Akibatnya, nombor plat teori puncak echinacea adalah lebih besar daripada 4000, dan resolusi antara echinacea dan puncak komponen bersebelahan adalah lebih besar daripada 1.5. Bentuk puncak adalah simetri, tanpa gangguan dari puncak kekotoran, dan garis dasar adalah stabil. Oleh itu, dalam kajian ini, asetonitril - 0.4 peratus asid fosforik digunakan sebagai fasa mudah alih kromatografi untuk penentuan kandungan echinacea. Dalam kajian ini,kaedah HPLC digunakan untuk menentukan Echinacea dalam ekstrak akueus Cistanche deserticola.

Serbuk ekstrak cistanche

Kaedahnya mudah, tepat dan boleh dihasilkan semula. Ia sesuai untuk penentuan echinacea dalam ekstrak akueus cistanche deserticola dan boleh digunakan sebagai kaedah kawalan kualiti untuk ekstrak akueus cistanche deserticola.Kajian ini hanya menentukan kandungan echinacea dalam ekstrak air Cistanche deserticola.Pada masa hadapan,ia dirancang untuk menentukan kandungan echinacea dalam rebusan kompaun Cistanche deserticola untuk meneroka kesan pelbagai faktor ke atas kandungan echinacea, menyediakan rujukan untuk kawalan kualiti rebusan yang mengandungi Cistanche deserticola.

rujukan:

[1] Zhong Ping Desert ginseng dan cistanche [J] Forest and Human Beings, 2004, 24 (11): 25

[2] Pharmacopoeia Suruhanjaya Farmakope Kebangsaan Republik Rakyat China (Bahagian I) [M] Beijing: Akhbar Sains dan Teknologi Perubatan China, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei, et al Kemajuan penyelidikan dalam Cistanche deserticola [J] Kajian Penilaian Dadah, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian Kemajuan dalam penyelidikan farmakologi mengenai Cistanche deserticola [J] Perubatan Tradisional Cina Guangming, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Kesan ekstrak akueus cistanche deserticola pada ekspresi gen protein morfogenetik tulang 2 dalam osteoblas tikus [J] Haiwan ChinaPenternakan dan Perubatan Veterinar, 2013, 40 (1): 17-21

[6] LIANG H,YU F,TONG Z,et al. Ekstrak akueus herba Cistanches yang menjejaskan serum BGP dan TRAP dan sumsum tulang mRNA Smad1, mRNA Smad5, mRNA- 1 TGF{3}} dan tahap ekspresi mRNA TIEG1 dalam penyakit osteoporosis[J]. Laporan Biologi Molekul, 2013, 40 （2）:757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming, et al Pemerhatian ke atas Echinoside Menggalakkan Percambahan Osteoblast Tikus dengan Mengaktifkan ERK/BMP-2 Laluan Isyarat [J] Forum Perubatan Akar Umbi, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Tian Yuan Kajian tentang pembezaan sel stem mesenchymal sumsum tulang kepada osteoblas yang disebabkan oleh echinaside dan mekanismenya [D] Shenyang: Universiti Perubatan Tradisional Cina Liaoning, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan, dsb. Kajian tentang Pembezaan Terinduksi Echinoside bagi Sel Stem Mesenchymal Sumsum Tulang kepada Osteoblas [J] Farmakologi dan Klinik Perubatan Tradisional Cina, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie, et al Determination of Echinoside and Piloside in Cistanche deserticola Micropowder oleh HPLC [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun, et al Penentuan Serentak Echinoside, Piloside, dan Isopiloside dalam Jumlah Kapsul Glikosida Cistanche oleh HPLC [J] Sains dan Teknologi Dunia - Pemodenan Perubatan Tradisional Cina, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Kajian farmakodinamik dan metabonomik Xu Xiaoxue mengenai kesan anti osteoporosis Cistanche deserticola dan komponen berkesannya [D] Yinchuan: Universiti Perubatan Ningxia, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan, et al Penentuan Echinoside dan Piloside dalam Cecair Oral Qirong Runchang oleh Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi [J] Jurnal Universiti Perubatan Xinjiang, 2018, 41 (7): 886-888892