Kenalan:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3, Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

Masamitsu Sato1,6,7

Cistanche boleh meningkatkan fungsi buah pinggang

Sel epitelium menyusun susunan tertib mikrotubulus bukan centrosomal, yang hujung tolaknya dikawal oleh CAMSAP3. Peranan mikrotubul ini dalam fungsi epitelium, bagaimanapun, kurang difahami. Di sini, kami menunjukkan bahawabuah pinggangtikus di mana Camsap3 bermutasi berkembangsistapada tubul berbelit proksimal (PCTs). PCT telah diluaskan dengan teruk dalam mutanbuah pinggang, dan mereka juga mempamerkan percambahan sel yang dipertingkatkan. Dalam PCT ini, sel epitelium menjadi gemuk bersama-sama dengan gangguan susunan microtubule serta struktur subselular tertentu seperti proses basal interdigitating. Tambahan pula, YAP dan PIEZO1, yang dikenali sebagai pengawal selia mekanosensitif untuk pembentukan dan percambahan sel, telah diaktifkan dalam sel PCT mutan ini. Pemerhatian ini mencadangkan bahawa rangkaian mikrotubule yang dimediasi CAMSAP3 adalah penting untuk mengekalkan sifat mekanikal sel PCT yang betul, dan kehilangannya mencetuskan ubah bentuk dan percambahan sel melalui pengaktifan mekanosensor, mengakibatkan pelebaran PCT.

Sel epitelium adalah komponen utama pelbagai organ. Mereka menunjukkan kekutuban apikal-ke-basal yang dikaitkan dengan fungsinya, seperti penyerapan dan rembesan. Dalam sel epitelium yang dibezakan, majoriti mikrotubulus adalah bukan centrosomal dan diselaraskan di sepanjang paksi apikal-ke-basal1–3. CAMSAP3 ialah ahli keluarga protein berkaitan spektrin yang dikawal oleh calmodulin (CAMSAP)/Nezha/Patronin dan penting untuk organisasi mikrotubule epitelium4–8 . CAMSAP3 mengikat dan menstabilkan hujung tolak mikrotubul4,6,9. Dalam sel-sel usus kecil pada tikus, CAMSAP3 tertumpu pada kawasan kortikal apikal, menambat hujung tolak mikrotubulus bukan centrosomal ke tapak ini10,11, menghasilkan pembentukan susunan mikrotubulu yang berorientasikan ke arah apicobasal dengan hujung tambah menunjuk pada asasnya. . Walau bagaimanapun, organisasi mikrotubule ciri ini hilang dalam tikus yang mempunyai gen mutan yang mengekodkan Camsap3 yang dipenggal (Camsap3dc/dc tikus), di mana domain pengikat mikrotubule C-terminal dipadamkan. Sel epitelium usus dalam tikus ini mempunyai pelbagai kecacatan sitologi, termasuk ketinggian sel berkurangan dan organel yang salah kedudukan seperti nukleus dan Golgi10. Walaupun gangguan besar dalam seni bina intraselular, sel epitelium mengekalkan helaian dua dimensi yang kelihatan normal10,12, dan usus yang bermutasi tidak mempunyai kecacatan fisiologi yang jelas.

tubulus (PCT), gelung Henle, tubul berbelit distal, dan saluran pengumpul. Substruktur nefron tese terdiri daripada satu lapisan epitelium, yang berfungsi untuk penapisan, penyerapan semula, dan rembesan.

A buah pinggang sistaadalah lesi patologi biasa padabuah pinggang. Lesi sistik adalah berubah-ubah; sama ada sista fokal atau berbilang terbentuk dalam satu bahagian atau dua hala dalam buah pinggang, menunjukkan tahap simptom yang berbeza13–15. Beberapa sista kongenitalbuah pinggangpenyakit, termasuk polikistikbuah pinggangpenyakit (PKD), penyakit buah pinggang glomerulocystic (GCKD) dan medullary cysticbuah pinggangpenyakit (MCKD), diketahui menyebabkan pelbagaibuah pinggangsista dalam buah pinggang dua hala. Dalam PKD, sista diedarkan secara seragam ke seluruh organ termasuk PCT, manakala GCKD dan MCKD mengembangkan sista dalam kapsul Bowman dan saluran pengumpul (terutamanya di kawasan medula), masing-masing16–19 .

Bagi PKD, dua punca utama diketahui: 1) mutasi dalam gen Pkd1 atau Pkd2, dan 2) mutasi dalam gen yang diperlukan untuk biogenesis cilium primer. Pkd1 dan Pkd2 masing-masing mengekod polycystin1 dan polycystin2, yang merupakan saluran kation bukan selektif20 yang menyetempat di beberapa petak selular termasuk silia utama21,22 . Dalam tikus yang membawa bentuk mutan PKD1 atau PKD2, protein polycystin tidak menyetempat ke silia23. Gen yang diperlukan untuk biogenesis silia primer termasuk If88 dan Kif3a, yang terlibat dalam pengangkutan intrafagel24-26 . Mutasi dalam gen ini juga mengakibatkanbuah pinggangpenyakit sista24–27 . Walaupun hubungan antara dua laluan kausal ini adalah rumit23, satu laluan yang telah ditunjukkan untuk mendorong PKD melibatkan pengesan isyarat Hippo Yap28 . Dalam tikus mutan Pkd1, pengaktif bersama transkripsi YAP/TAZ dan c-Myc efektornya diaktifkan dan menggalakkan cystogenesis28. Walau bagaimanapun, mekanisme yang mendasari perkembangan polikistikbuah pinggangsebahagian besarnya masih tidak diketahui.

Dalam kajian ini, kami menyiasat peranan CAMSAP3 dalambuah pinggangstruktur dan fungsi. Pemerhatian kami menunjukkan bahawa CAMSAP3 setempat secara apikal menyumbang kepada orientasi mikrotubul bukan centrosomal yang betul serta penubuhan seni bina intraselular sel epitelium dalam PCT, seperti yang diperhatikan dalam usus kecil. Tidak seperti epithelia usus, bagaimanapun, CAMSAP3disfungsimenyebabkan keabnormalan tahap organ dalam buah pinggang dua hala—iaitu, pembentukan sista dalam PCT. Kehilangan fungsi CAMSAP3 mengakibatkan pengaktifan pengawal selia mekanosensitif yang biasanya membantu memelihara integriti tisu. Kajian kami mencadangkan bahawa CAMSAP3-organisasi mikrotubulus bukan centrosomal adalah penting untuk mengekalkan sifat mekanosensitif PCT dan kehilangan sistem ini menyebabkan pembentukan sista serantau dalam buah pinggang.

Keputusan

Sistapembentukan dalambuah pinggangdaripada tikus mutan Camsap3. Analisis fenotip tikus mutan Camsap3dc/dc mendedahkannyabuah pinggangdalam umur (~ 2 tahun) Camsap3dc/dc tikus adalah hipertropik dan berubah warna (Rajah 1a). Untuk menganalisis lebih lanjut keabnormalan dalam Camsap3dc/dcbuah pinggang, kami memeriksa tikus yang lebih muda. Pada hari ke-21 selepas bersalin (P21), buah pinggang Camsap3dc/dc mempunyai penampilan yang normal. Walau bagaimanapun, pembahagian buah pinggang mendedahkan struktur sista di kawasan kortikal (Rajah 1b dan Rajah Tambahan S1a), seperti yang disahkan dengan mengira indeks sista, iaitu nisbah kawasan yang mengandungi sista kepada jumlah kawasan buah pinggang (Rajah 1). 1c). Kami memeriksa embrio mutan untuk menentukan bila sista mula terbentuk semasa pembangunan, yang mendedahkan tanda peningkatan pembentukan sista pada kira-kira hari embrio 17.5 (E17.5) (Tambahan Rajah S1a, anak panah). Pada P0, sista kortikal menjadi mudah dilihat (Tambahan Rajah S1a, anak panah), dan saiz serta bilangannya telah meningkat sebanyak P21 (Rajah 1b, Rajah Tambahan S1a, anak panah). Apabila tikus semakin tua, fenotip sista menjadi lebih jelas, walaupun tahap pembentukan sista berbeza-beza di kalangan individu (Rajah 1c dan Rajah Tambahan S1b). Di samping itu, nisbah berat buah pinggang kepada badan adalah lebih tinggi untuk tikus Camsap3dc/dc berbanding tikus jenis liar (WT) sepanjang hayat mereka (Rajah 1d dan Rajah Tambahan S1c, d). Tus, Camsap3dc/dc buah pinggang mempamerkan pembentukan sista, yang dipertingkatkan dari semasa ke semasa, mengakibatkan hipertrofi pada buah pinggang tua.

Tikus Camsap3dc/dc mengekspresikan CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10 terminal terminal-C, yang boleh terlibat dalam fenotip sista yang diperhatikan bagi buah pinggang tikus. Untuk menyiasat kemungkinan ini, kami menghasilkan tetikus Camsap3–/– (Camsap3-null) (Tambahan Rajah S2a,b) (lihat juga Kaedah secara terperinci). Tikus-tikus ini juga mempunyaibuah pinggangdengan berbilang sista, dan fenotipnya tidak dapat dibezakan daripada yang diperhatikan dalam tikus Camsap3dc/dc; terutamanya, tikus heterozigot (Camsap3 plus /–) tidak menunjukkan tanda-tanda buah pinggang polikistik (Tambahan Rajah S2c).

Pembentukan sista dalam PCT Camsap3dc/dcbuah pinggang. Untuk menentukan struktur mana yang menjadi sistik dalam mutanbuah pinggang, kami menjalankan imunostaining tiga segmen nefron untuk tiga protein, iaitu Megalin (disetempatkan kepada PCT), kotransporter Na plus /Cl– (tubul berbelit distal) dan aquaporin-2 (salur pengumpul). Keputusan menunjukkan bahawa pelebaran berlaku secara eksklusif pada tubul Megalin-positif pada P21 (Rajah 1e dan Rajah Tambahan S1e), menunjukkan bahawa sisogenesis adalah terhad kepada PCT. PCT dibahagikan kepada tiga segmen, iaitu S1, S2 dan S3, dan kami membezakan antara mereka dengan imunostaining untuk pengangkut glukosa SGLT1 dan SGLT2, yang menyetempat di segmen S3 dan S1/S2, masing-masing29,30 . Tubul diluaskan ditandakan semata-mata oleh SGLT2 (Rajah 1f), menunjukkan bahawa sisogenesis berlaku pada segmen S1/S2. Dalam tikus mutan yang lebih tua, bagaimanapun, pembentukan sista juga meluas ke kapsul Bowman (Rajah 1g).

Seni bina selular yang tidak teratur dalam PCT sista. Untuk meneroka kecacatan peringkat selular dalam PCT sista, kami mula-mula memeriksanya dengan mengimbas mikroskop elektron, mendapati bahawa populasibuah pinggangtubul membengkak dengan ketara dalam buah pinggang Camsap3dc/dc (Rajah 2a), walaupun tahap bengkak berbeza-beza dari kedudukan ke kedudukan tubul. Keratan rentas mendedahkan bahawa, pada bahagian tubul yang membengkak, lumennya mengembang bersama dengan penipisan lapisan epitelium yang membentuk tubul (Rajah 2a). Kuantifikasi menggunakan sampel bernoda hematoxylin dan eosin mengesahkan bahawa ketinggian sel berkurangan dalam tubul yang diluaskan (Rajah 2b), manakala perimeter apikal setiap sel meningkat (Rajah 2c), menunjukkan bahawa sel mutan adalah lebih gemuk daripada di WTbuah pinggang.

Kami seterusnya mengkaji sama ada seni bina sel dan / atau struktur subselular PCT terjejas oleh mutasi Camsap3. Imunostaining untuk DPP IV, penanda membran apikal, dan untuk Na plus /K plus -ATPase, penanda membran basolateral, menunjukkan bahawa kekutuban sel keseluruhan adalah normal dalam setiapbuah pinggangsel tubul Camsap3dc/dc

Rajah 1. Pembentukan sista dalam tubul berbelit proksimal Camsap3dc/dcbuah pinggang. (a) Morfologi buah pinggang tikus WT ( tambah / tambah ) dan mutan Camsap3 (Camsap3dc/dc) pada P666. (b) Pewarnaan H&E bagi buah pinggang WT dan Camsap3dc/dc pada P21. Pelbagai sista terbentuk dalam korteks buah pinggang Camsap3dc/dc. (c) Perubahan indeks sista tikus WT dan Camsap3dc/dc dari semasa ke semasa. 9 tikus telah diperiksa untuk WT atau Camsap3dc/dc. Lihat BAHAN DAN KAEDAH untuk definisi indeks sista. (d) Nisbah buah pinggang kepada berat badan. 11 tikus telah diperiksa untuk WT atau Camsap3dc/dc. (e) Imunostaining untuk penanda tubul berbelit proksimal (PCT) (Megalin), tubul berbelit distal (DCT), pengangkut bersama NaCl dan saluran pengumpul (CD) (aquaporin-2; AQP2) dalam WT dan Camsap3dc/ dcbuah pinggangpada P21. Imej paparan Megalin yang diperbesarkan menunjukkan Megalin yang dinyahlokasi dalam sel sista dalam buah pinggang Camsap3dc/dc, seperti yang ditunjukkan oleh kepala anak panah. Garis putus dan berterusan menunjukkan margin apikal dan basal sel, masing-masing. (f) Imunostaining untuk penanda segmen S1/S2 (SGLT2, hijau) dan segmen S3 (SGLT1, merah) dalam buah pinggang WT dan Camsap3dc/dc pada P21. Imej paparan pembesaran SGLT2 menunjukkan penurunan intensiti isyarat SGLT2 dalam sel sista dalam buah pinggang Camsap3dc/dc, seperti yang ditunjukkan oleh anak panah. (g) Morfologi glomerulus pada P21 dan P487. Anak panah menunjukkan glomerulus yang diluaskan. Lihat juga Rajah S1 dan S2.

Rajah 2. Seni bina selular tidak teratur dalam sel PCT sista. (a) Mengimbas imej mikroskop elektron ▸

Cistanche boleh meningkatkan fungsi buah pinggang

daripada WT dan Camsap3dc/dcbuah pinggangpada P21. Tubul renal dalam Camsap3dc/dcbuah pinggangsepara bengkak. (b) Pengiraan ketinggian sel dalam korteks [ tambah / tambah , n=121 sel; dc/dc (diluaskan), n=128 sel; dc/dc (tidak diluaskan), n=66 sel]. Bar ralat menunjukkan SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">buah pinggang. (i) Bilangan silia primer pada PCT. Bilangan silia primer dikira menggunakan panjang lilitan apikal keratan rentas PCT, bersama-sama dengan bilangan silia dan nukleus primer. [ tambah / tambah , N=340 sel, 63 keratan rentas PCT, Bilangan silia primer=268; dc/dc, N=221 sel, 29 keratan rentas PCT, Bilangan silia primer=133].

tikus (Rajah 2d). Sebaliknya, walaupun Megalin terkumpul di kawasan apikal dalam sel WT, ia meresap ke dalam sitoplasma dalam beberapa sel Camsap3dc/dc sista (Rajah 1e pandangan diperbesar, dan Rajah 2d). Pewarnaan pendarfluor untuk F-aktin, yang terkumpul pada ketumpatan tinggi dalam mikrovili apikal, mencadangkan bahawa mikrovili kadang-kadang tidak tersusun dalam sel-sel gemuk mutan.buah pinggang(Rajah 2e kepala anak panah), seperti yang disahkan oleh mikroskop elektron penghantaran (Rajah 2f). Ezrin, sebahagian daripada kompleks ERM yang dikaitkan dengan membran plasma apikal31, telah berkurangan atau hilang dalam sel sista Camsap3dc/dcbuah pinggang(Rajah 2e), menunjukkan bahawa seni bina cytoarkitektur adalah tidak normal dalam sel mutan. Di samping itu, sedangkan radas Golgi positif Giantin secara amnya diedarkan sebagai helai nipis yang disandingkan dengan nukleus dalam sel WT, Golgi kadangkala menjadi pekat dalam sel Camsap3dc/dc (Rajah 2e). Mikroskopi elektron penghantaran mendedahkan kecacatan subselular tambahan dalam PCT diluaskan Camsap3dc/dcbuah pinggang. Dalam sel WT PCT, mitokondria dipanjangkan, menunjukkan orientasi tersusun di sepanjang paksi apico-basal sel, manakala dalam sel PCT sista, mitokondria cenderung bulat - tidak lagi memaparkan sebarang orientasi tersusun (Rajah 2f). Dalam sel-sel ini, jaluran basal juga tidak teratur, kehilangan invaginasi selari dan dalam yang biasa dalam sel WT (Rajah 2f kepala anak panah dan lukisan yang dikesan), seperti yang ditunjukkan oleh imunostaining untuk Na plus /K plus -ATPase (Rajah). . 2d anak panah). Selain itu, nukleus telah digemukkan dalam sel sista, berbanding dengan bentuk bulatnya dalam sel WT (Rajah 2f, g). Silia primer dapat dikesan pada bahagian luminal sel PCT dalam kedua-dua buah pinggang WT dan mutan (Rajah 2h, i), tidak seperti kes tikus mutan yang rosak untuk ciliogenesis, yang menyebabkan buah pinggang polikistik24–27, menunjukkan bahawa kerosakan ciliogenesis adalah bukan sebab yang mungkin untuk

memerhatikan fenotip polikistik dalam tikus Camsap3dc/dc. Secara kolektif, pemerhatian ini menunjukkan bahawadisfungsiCAMSAP3 mengganggu seni bina subselular sel sista PCT.

Tikus Camsap3dc/dc menunjukkan beberapa kecacatan fisiologi. Kami seterusnya memeriksa sama ada buah pinggang Camsap3dc/dc mempunyai sebarang kecacatan fisiologi. Kajian imunositologi yang dinyatakan di atas menunjukkan bahawa Megalin, yang berfungsi sebagai reseptor endositik multiligan32,33, cenderung meresap ke dalam sitoplasma sel PCT Camsap3dc/dc (Rajah 1e anak panah, dan Rajah 2d), berbeza dengan penyetempatan apikal yang jelas dalam sel WT PCT. Tambahan pula, walaupun pengangkut glukosa SGLT2, yang bertanggungjawab untuk 90 peratus penyerapan semula glukosa29, disetempatkan terutamanya di kawasan apikal sel Camsap3dc/dc (seperti yang juga dilihat dalam sel WT), keamatan isyaratnya menurun di kawasan tertentu tubul sista ( Rajah 1f anak panah), menunjukkan bahawa fisiologi tubul mutan mungkin telah terjejas secara negatif. Oleh itu, kami menjalankan ujian air kencing dan darah, menggunakan P396- hingga P424-tikus lama. Ujian air kencing mendedahkan kecenderungan pengeluaran berlebihan K plus, Mg2 plus, dan nitrogen urea dalam Camsap3dc/dc tikus (Tambahan Rajah S3a). Ujian darah dengan lebih meyakinkan menunjukkan bahawa tikus Camsap3dc/dc mempunyai paras K plus dan Mg2 plus yang jauh lebih rendah berbanding tikus WT atau Camsap3 plus /dc, walaupun tiada perubahan dikesan dalam tahap nitrogen urea dan glukosa (Tambahan Rajah S3b) . Tahap kreatinin air kencing dan darah tidak berbeza antara WT dan tikus mutan (Tambahan Rajah S3c). Jadi, kami hanya memerhatikan kecacatan fisiologi separa dalam tikus Camsap3dc/dc.

Organisasi mikrotubul dalambuah pinggangsel epitelium tubulus. Oleh kerana mutasi Camsap3 membawa kepada kekeliruan mikrotubul dalam sel epitelium usus kecil10,12, kami meneliti sama ada ini juga berlaku dalambuah pinggangsel epitelium. Kami mula-mula mengimunisasikan -tubulin bersama-sama dengan Megalin. Terutama, kedua-dua dalam buah pinggang WT dan Camsap3dc/dc, tubul Megalin-negatif, iaitu, sama ada tubul berbelit distal atau saluran pengumpul, menunjukkan intensiti imunostaining -tubulin yang lebih kuat daripada yang diperhatikan untuk -tubulin dalam PCT Megalin-positif (Rajah 3a, b) . Seperti yang terdapat dalam usus kecil10, CAMSAP3 disetempatkan secara apikal dalam semua sel epitelium WTbuah pinggang, bertindih dengan hujung apikal mikrotubul yang dijajarkan di sepanjang paksi apiko-basal (Rajah 3c kiri). Sel epitelium buah pinggang Camsap3dc/dc juga agak imunopositif untuk CAMSAP3 tetapi pada kedudukan yang tidak teratur (Rajah 3c kanan, anak panah), menunjukkan bahawa CAMSAP3 yang bermutasi dikekalkan dalam sel, berlabuh pada beberapa struktur yang tidak dikenal pasti. Dalam sel sista buah pinggang mutan, susunan mikrotubulus telah berselirat dan tidak teratur (Rajah 3c kanan), seperti yang diperhatikan dalam sel usus Camsap3dc/dc tikus10 . Dalam sel bukan kistik, bagaimanapun, organisasi mikrotubulus tidak terjejas

Rajah 3. Mikrotubul dalam sel epitelium tubul renal. (a) Imunostaining untuk -tubulin, Megalin, dan nukleus dalam buah pinggang WT dan Camsap3dc/dc pada P21. (b) Pengiraan keamatan -tubulin dalam PCT dan DCT/CD buah pinggang WT (PCT, n=28 tubul; DCT/CD, n=18 tubul) dan Camsap3dc/dc buah pinggang (PCT, n { {8}} tubul; DCT/ CD, n=9 tubul). Bar ralat menunjukkan SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

banyak walaupun tanpa ketiadaan CAMSAP3 berfungsi, yang mungkin menjelaskan mengapa sel-sel ini tidak menunjukkan keabnormalan sitologi. Selain itu, Camsap3-sel epitelium buah pinggang nol juga menunjukkan kecacatan mikrotubulus yang serupa tetapi hanya dalam sel sista (Tambahan Rajah S2d). Secara kolektif, keputusan ini menunjukkan bahawa CAMSAP3 memainkan peranan dalam mengekalkan organisasi apico-basal microtubules hanya untuk subpopulasi sel epitelium buah pinggang.

Percambahan sel dipertingkatkan dalam PCT Camsap3dc/dc. Pembentukan sista dalam buah pinggang berkait rapat dengan peningkatan percambahan sel buah pinggang34 . Untuk menguji sama ada percambahan sel telah diubah dalam buah pinggang Camsap3dc/dc, kami membandingkan percambahan sel PCT antara WT dan buah pinggang mutan dengan pewarnaan bersama untuk Megalin dan Ki-67, penanda untuk percambahan sel. Sel Ki-67–positif jarang diperhatikan dalam PCT buah pinggang WT, manakala ia mudah kelihatan dalam sel PCT buah pinggang Camsap3dc/dc. Walau bagaimanapun, Ki-67 dikesan dalam kedua-dua tubul tidak diluaskan dan diluaskan (Rajah 4a,b), tidak menunjukkan korelasi antara percambahan sel dan pembentukan sista. Tus, CAMSAP3disfungsimemang menggalakkan percambahan sel, tetapi proses ini tidak selalu dikaitkan dengan pembentukan sista.

Perubahan dalam penyetempatan YAP dan myosin bukan otot dikaitkan dengan ubah bentuk sel. YAP ialah pengaktif transkrip yang mengawal percambahan sel35 serta pembentukan sel yang bergantung kepada ketegangan mekanikal36 . YAP diaktifkan bersama-sama penyetempatan nuklearnya dalam buah pinggang tikus Pkd1-kekurangan, model PKD37 dan pengaktifan Yap menggalakkan percambahan sel dan pelebaran tiub dalam buah pinggang28 . Oleh itu, kami menguji sama ada YAP juga diaktifkan dalam PCT buah pinggang Camsap3dc/dc. Imunostaining untuk YAP mendedahkan penyetempatan sitoplasmanya dalam PCT buah pinggang WT. Hebatnya, YAP menjadi tertumpu dalam nukleus Camsap3dc/dc PCT, tetapi hanya dalam bahagian diluaskannya (Rajah 5a), seperti yang disahkan oleh kuantifikasi (Rajah 5b), menunjukkan bahawa pengagihan semula YAP yang diperhatikan berlaku sebagai tindak balas kepada perubahan dalam sel morfologi dan bukannya CAMSAP3disfungsiper se.

YAP ialah efektor hiliran laluan Hippo, yang dikawal oleh isyarat mekanikal38 . Malah, sel sista dalam buah pinggang Camsap3dc/dc kelihatan meregang, menunjukkan bahawa mereka mungkin terdedah kepada ketegangan yang meningkat.

Rajah 4. Pembiakan sel dalam Camsap3dc/dc PCT. (a) Imunostaining untuk Ki-67, Megalin dan DAPI dalam buah pinggang WT dan Camsap3dc/dc pada P22. Anak panah menunjukkan sel Ki-67–positif dalam tubul sista. (b) Peratusan sel Ki-67–positif dalam sel epitelium PCT [ tambah / tambah , n=700 sel; dc/dc (diluaskan), n=224 sel; dc/dc (tidak diluaskan), n=396 sel]. Bar ralat menunjukkan SD *p<0.05,>

Oleh itu, kami menyiasat sama ada sebarang perubahan mekanikal berlaku bersamaan dengan pembentukan sista. Oleh kerana pengaktifan myosin II bukan otot adalah proses sensitif ketegangan39, kami menilai taburan rantai cahaya myosin 2 (MLC2), yang terlibat dalam pengaktifan myosin II, dalam buah pinggang. Walaupun MLC2 meresap ke dalam sitoplasma dalam sel tubul WT, ia menjadi tertumpu berhampiran bahagian apikal sel sista dalam buah pinggang Camsap3dc/dc (Rajah 5c anak panah), menunjukkan bahawa sel-sel ini tertakluk kepada daya tegangan. Sel-sel dalam PCT tidak diluaskan tidak menunjukkan kepekatan MCL2 sedemikian. Penemuan ini adalah selaras dengan idea bahawa YAP memasuki nukleus apabila sel diregangkan secara mekanikal40,41 .

Perubahan dalam pengedaran PIEZO1 dalam Camsap3dc/dc PCT. Untuk menguji lebih lanjut sama ada sel sista terdedah kepada daya regangan, kami memeriksa taburan subselular PIEZO1, saluran ion mekanosensitif42–45, kerana ini adalah penanda biasa untuk regangan mekanikal; Penyetempatan PIEZO1 beralih daripada membran plasma/sitoplasma ke sampul nuklear apabila ia merasakan isyarat regangan46 . Imunostaining untuk PIEZO1 menunjukkan bahawa PIEZO1 kebanyakannya disetempat dalam sitoplasma sel WT PCT, manakala penyetempatannya bertindih dengan nukleus dalam sel sista Camsap3dc/dc PCTs (Rajah 6a). Imunostaining untuk YAP dan PIEZO1 dalam bahagian berurutan juga mencadangkan bahawa penyetempatan nuklear mereka bertepatan dengan PCT yang diluaskan (Tambahan Rajah S4, anak panah). Sebaliknya, dalam PCT Camsap3dc/dc yang tidak diluaskan, taburan PIEZO1 kelihatan sitoplasma (Rajah 6a). Walau bagaimanapun, pemerhatian rapi terhadap imej imunofuoresensi serta kuantifikasi menunjukkan bahawa penyetempatan nuklearnya cenderung meningkat sedikit sebanyak, berbanding dengan sel WT (Rajah 6a, b). Jadi, tidak seperti YAP, nampaknya PIEZO1 mula diaktifkan sebelum ubah bentuk sel yang boleh dikesan dalam PCT Camsap3dc/dc.

Perbincangan

Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa mutasi CAMSAP3 atau kehilangannya mengakibatkan pelebaran sel PCT, yang menyebabkan keratan rentas tubul kelihatan kistik. Tanda sisogenesis telah pun diperhatikan seawal E17.5, dengan peningkatan secara beransur-ansur pengembangan semasa penuaan dan lanjutan akhirnya ke kapsul Bowman. Sel-sel epitelium di kawasan yang diluaskan menjadi lebih nipis, mempamerkan pelbagai kecacatan sitologi, seperti yang diperhatikan dalam sel-sel usus kecil Camsap3dc/dc tikus10,12 . Beberapa kecacatan khusus buah pinggang juga diperhatikan, termasuk gangguan penjajaran mitokondria dan corak membran plasma basal. Perubahan ini bertepatan dengan gangguan susunan mikrotubulus, menunjukkan bahawa rangkaian mikrotubulus pengantara CAMSAP3-bertanggungjawab untuk organisasi normal struktur subselular ini dalam sel PCT, seperti yang terdapat dalam jenis sel lain. Sebaliknya, walaupun CAMSAP3 nampaknya dinyatakan dalam semua sel epitelium tubul renal, fenotip struktur yang menyimpang hanya diperhatikan dalam PCT, mencadangkan kewujudan mekanisme berlebihan untuk mengekalkan rangkaian mikrotubulus tanpa adanya CAMSAP3. Ada kemungkinan molekul selain CAMSAP3, seperti CAMSAP lain, boleh mengambil bahagian dalam mengekalkan integriti rangkaian mikrotubule dalam sel ini. Sel PCT mempunyai ketumpatan mikrotubulus yang agak lebih rendah daripada sel tubul lain. Ini mungkin memudahkan ubah bentuk sel, kerana rangkaian mikrotubulus yang akan kekal selepas kehilangan CAMSAP3 mungkin tidak mencukupi untuk dikekalkan.

seni bina sel yang betul. Walaupun dalam sel PCT, bagaimanapun, mekanisme nampaknya wujud yang mengimbangi kehilangan CAMSAP3, kerana pelebaran PCT tidak berlaku secara seragam.

Rajah 5. Penyetempatan YAP dan myosin bukan otot yang dikaitkan dengan ubah bentuk sel. (a) Imunostaining untuk YAP, Megalin, dan DAPI dalam buah pinggang WT dan Camsap3dc/dc pada P22. Isyarat pendarfluor DAPI dan YAP telah diimbas di sepanjang garis yang dilukis dalam imej yang diperbesarkan, dan perubahan ruang dalam keamatan fuoresen ditunjukkan dalam warna biru untuk DAPI dan hijau untuk YAP. Garis putus-putus menunjukkan anggaran luas nukleus. Anak panah menunjukkan kedudukan nukleus dalam sel perwakilan. (b) Nisbah keamatan YAP nuklear kepada keamatan YAP sitoplasma [ tambah / tambah , n=81 sel; dc/dc (diluaskan), n =43 sel; dc/dc (tidak diluaskan), n=53 sel]. Plot kotak menunjukkan nilai kuartil pertama, median dan kuartil ketiga. ***hlm<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Rajah 6. Perubahan dalam taburan PIEZO1 dalam PCT Camsap3dc/dc. (a) Imunostaining untuk PIEZO1, Megalin, dan DAPI dalam buah pinggang WT dan Camsap3dc/dc pada P22. Isyarat pendarfluor DAPI dan PIEZO1 telah diimbas di sepanjang garis yang dilukis dalam imej yang diperbesarkan, dan perubahan spatial dalam keamatan fuoresensi ditunjukkan dalam warna biru untuk DAPI dan hijau untuk PIEZO1. Garis putus-putus menunjukkan anggaran luas nukleus. Anak panah menunjukkan kedudukan nukleus dalam sel perwakilan. (b) Nisbah keamatan piezo1 nuklear kepada keamatan piezo1 sitoplasma [ tambah / tambah , n=66 sel; dc/dc (diluaskan), n =44 sel; dc/dc (tidak diluaskan), n=81 sel]. Plot kotak menunjukkan nilai kuartil pertama, median dan kuartil ketiga. ***hlm<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Maka, bagaimanakah PCT diluaskan secara serantau, disertai dengan penggemukan sel epitelium? Terutama, pembentukan sista dapat dikesan pada E17.5, dan masa ini berkorelasi dengan permulaan pengeluaran air kencing primitif pada tikus47 . Oleh itu, kita boleh membuat hipotesis bahawa 'urine fow' adalah faktor mekanikal yang berpotensi yang mendorong pelebaran tubul renal. Ada kemungkinan sel PCT yang telah kehilangan sitoskeleton mikrotubulus pengantara CAMSAP3-secara mekanikal lebih mudah terdedah kepada daya luaran, iaitu, lebih mudah berubah bentuk, berbanding dengan sel WT PCT. Jadi, daya yang dihasilkan oleh fow air kencing dalam tubulus renal mungkin menyebabkan pembesaran tubul, membawa kepada penggemukan mereka. Daya sedemikian mungkin tidak seragam, mengakibatkan darjah pelebaran berubah-ubah di sepanjang PCT. Idea ini, tidak perlu dikatakan, tidak mengecualikan mekanisme lain yang mungkin untuk pelebaran PCT.

Pemerhatian kami menunjukkan bahawa PIEZO1 dipindahkan dari sitoplasma ke kawasan nuklear dalam sel PCT diluaskan buah pinggang Camsap3dc/dc, menunjukkan bahawa mekanosensor ini diaktifkan sebagai tindak balas kepada ubah bentuk sel, kemungkinan besar 'regangan' sel seperti yang dilaporkan sebelum ini46 . Keadaan regangan sel PCT yang diluaskan telah disahkan oleh pemerhatian bahawa MLC2 telah meningkat di kawasan kortikal mereka. Analisis kami selanjutnya menunjukkan bahawa PIEZO1 telah diaktifkan sedikit sebanyak dalam sel PCT yang tidak diluaskan, menunjukkan bahawa walaupun sel-sel ini mengalami perubahan mekanikal walaupun penampilannya kelihatan normal. Mekanosensor lain, YAP, juga diaktifkan dalam sel PCT, tetapi pengaktifannya kelihatan hanya berlaku dalam sel yang diregangkan.

Oleh itu, bagaimanakah pengawal selia mekanosensitif ini menyumbang kepada ubah bentuk sel, serta percambahan sel yang dipromosikan tanpa kehadiran CAMSAP3? Telah ditunjukkan bahawa pengaktifan PIEZO1 yang disebabkan oleh regangan menggalakkan percambahan sel dalam sel epitelium46, menunjukkan bahawa mekanisme ini juga berfungsi dalam sel PCT buah pinggang Camsap3dc/dc. Idea ini konsisten dengan pemerhatian kami bahawa peningkatan percambahan sel dan pengaktifan PIEZO1 separa berlaku bersama-sama, walaupun dalam sel PCT Camsap3dc/dc yang tidak diluaskan. Mengenai YAP, pengaktifannya telah ditangguhkan, tidak menunjukkan korelasi yang jelas dengan permulaan peningkatan percambahan sel. YAP dikenali bukan sahaja sebagai faktor pertumbuhan sel tetapi juga sebagai pengawal selia homeostasis mekanikal, seperti yang ditunjukkan sebelum ini36,48 . Oleh itu, kemungkinan YAP, yang dipindahkan ke dalam nukleus bersama-sama dengan ubah bentuk sel PCT, mungkin berfungsi untuk mengawal bentuknya, iaitu memulihkan bentuk sel-sel ini yang rosak. Jika tidak, YAP mungkin bekerjasama dengan PIEZO1 dalam meningkatkan percambahan sel yang diluaskan, kerana YAP diketahui terlibat dalam pembentukan buah pinggang polikistik melalui peningkatan percambahan sel28 .

Kami mendapati bahawa tikus Camsap3dc/dc mempunyai paras darah K plus dan Mg2 plus yang jauh lebih rendah, menunjukkan bahawa buah pinggang mereka mungkin mengalami beberapa fungsi yang tidak normal. Kecacatan sitologi yang teruk yang kami perhatikan dalam membran plasma apikal dan basal sel PCT, di mana jentera pengangkutan aktif terletak, mungkin berkaitan dengan keabnormalan ini. Walau bagaimanapun, kami tidak boleh mengecualikan kemungkinan bahawa bahagian lain tubul renal atau organ lain juga boleh rosak dari segi fungsi, mendorong fenotip ini. Di samping itu, kami tidak memperoleh sebarang bukti bahawa fungsi flltering glomerulus telah rosak, kerana paras darah kreatinin dan nitrogen urea, yang dikumuhkan melalui glomerulus, adalah normal.

Gangguan biogenesis cilium primer membawa kepada PKD24–27 . Dalam kes mutasi Camsap3, pembentukan silia primer nampaknya tidak terjejas. Satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa kehilangan CAMSAP3 dalam sel epitelium berbilang bersilia hidung menjejaskan pembentukan pasangan tengah mikrotubulus dalam axoneme, menyebabkan motilitas menyimpang dalam silia motil49 . Walaupun silia primer pada sel epitelium tidak bergerak dan tidak mempunyai pasangan tengah mikrotubulus50, masih tidak pasti sama ada silia primer dalam tikus mutan Camsap3 masih berfungsi. Walaupun ketidakpastian ini, keabnormalan dalam mutan PKD dan Camsap3 agak berbeza, kerana pembentukan sista berlaku secara seragam di seluruh buah pinggang di bekas, sedangkan ia adalah peristiwa tempatan di kedua. Perbezaan ini berkemungkinan besar disebabkan oleh latar belakang molekul berbeza pembentukan sista di antara mereka.

Untuk meringkaskan, kajian kami mendedahkan bahawa CAMSAP3 adalah penting untuk mengekalkan struktur dan fungsi tubul renal di kawasan proksimal, mungkin melalui peraturan pemasangan mikrotubulus bukan centrosomal. Kajian lanjut akan diperlukan, walau bagaimanapun, untuk pemahaman yang menyeluruh tentang bagaimana kehilangan sistem organisasi mikrotubulus ini mengganggu fungsi fisiologi buah pinggang.

Bahan dan kaedah

Semua eksperimen telah dilakukan mengikut garis panduan, peraturan dan diluluskan oleh Pusat Penyelidikan Dinamik Biosistem RIKEN dan/atau Jawatankuasa Biokeselamatan Institusi Universiti Waseda.

tikus. Tikus mutan Camsap3 (Camsap3dc/dc) yang digunakan dalam kajian ini telah dihasilkan dalam kajian kami sebelum ini10 (nombor akses CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant peratus 20 tikus peratus 20list.html). Dalam tikus tersebut, kawasan C-terminal Camsap3, iaitu exon 14–17, telah dialih keluar dan sebelum ini kami mengesahkan bahawa sel tetikus mengekspresikan CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10 yang tidak berfungsi secara terminal. Dalam kajian ini, tikus generasi N4 dan 5 telah digunakan dalam eksperimen.

Tikus kalah mati Camsap3 (Camsap3–/–) (nombor kesertaan CDB0033E), yang tidak mempunyai keseluruhan 22-kb rantau pengekodan Camsap3, telah dijana dengan CRISPR/Cas9-pengeditan genom pengantara melalui elektroporasi zigot51. Ringkasnya, dua RNA panduan dan oligodeoxynucleotide satu lembar (ssODN) telah direka bentuk untuk memadamkan kawasan 22-kb, dan tapak EcoRI telah ditambahkan untuk tujuan pengecaman bagi pemasukan yang berjaya dalam tikus mutan. Untuk elektroporasi, cRNA, tracrRNA, ssODN dan protein Cas9 diperkenalkan ke dalam zigot C57BL/6. Selepas elektroporasi, zigot telah dipindahkan ke dalam tikus betina ICR pseudopregnant, dan tikus pengasas telah disaring oleh penjujukan PCR dan DNA. Tikus kalah mati pokok (#4, #10, #23) telah diperoleh, dan salah satu daripadanya (#23) mempunyai alel knock-in EcoRI yang direka bentuk. Urutan RNA panduan telah direka oleh CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp). Urutan crRNA, tracrRNA dan ssODN yang digunakan untuk penyuntingan genom telah disintesis seperti berikut: 5′-cRNA, 5′-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3′, 3′-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA, 5′-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . Huruf besar dan huruf kecil masing-masing menunjukkan pengekodan dan urutan tambahan. Garis tetikus #23 telah disilangkan dengan C57BL/6 tiga kali, dan tikus generasi N3 digunakan dalam eksperimen.

Eksperimen menggunakan tikus telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Pusat RIKEN untuk Penyelidikan Dinamik Biosistem atau Universiti Waseda, dan telah dilakukan mengikut protokol yang disediakan oleh jawatankuasa tersebut. Kajian telah dijalankan dengan mematuhi garis panduan ARRIVE: https: //arriveguidelines.org.

Genotaip. Genotip untuk tikus dilakukan oleh PCR. Untuk tikus Camsap3dc/dc, kami menggunakan primer yang diterangkan dalam Toya et al. (2016). Untuk tikus Camsap3–/–, kami menggunakan primer berikut untuk mengesan alel jenis liar (WT) (P1/P2, 411 bp) atau Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) (Tambahan Rajah S2a, b) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . Rantau P1/P3 di WT tidak dikuatkan di bawah keadaan PCR yang digunakan.

Histologi: Penyediaan bahagian tisu beku. Tisu buah pinggang yang dibedah telah difx dalam 2 peratus paraform- aldehid (Termo Fisher) / 0.1 M sorbitol (Nacalai Tesque) / penampan PEM selama 1 jam pada suhu bilik. Resipi untuk PEM ialah: 100 mM PAIP (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque), dan 5 mM MgCl2 (Wako), dilaraskan kepada pH 6.9 dengan 2 M KOH. Selepas fxasi, tisu buah pinggang dibilas tiga kali dengan PEM selama 10 minit. Sepuluh, cryoprotection telah dijalankan dengan sukrosa / PEM: 15 peratus sukrosa dalam larutan PEM selama 2 jam pada 4 darjah, diikuti dengan 20 peratus sukrosa dalam larutan PEM semalaman pada 4 darjah, dan penggantian dengan 30 peratus sukrosa dalam larutan PEM selama ~ 2 jam pada 4 darjah. Tisu buah pinggang dibekukan dalam sebatian OCT dalam acuan benam (Polysciences, Inc.) dalam nitrogen cecair dan disimpan pada suhu -80 darjah . Sampel beku dihiris pada ketebalan 5 µm dengan CM1850 Cryostat (Leica). Bahagian pada slaid kaca disimpan pada suhu -80 darjah sehingga pewarnaan.

Histologi: Penyediaan bahagian tisu terbenam parafn. Tisu buah pinggang yang dibedah telah difx dalam larutan Super Fix (Kurabo) selama 2 jam pada suhu bilik, kemudian dipindahkan ke 4 darjah semalaman. Setiap sampel didedahkan kepada tiga larutan etanol akueus dengan kepekatan yang semakin meningkat pada suhu bilik: 30 peratus etanol selama 3{{20}} min dua kali, 50 peratus etanol untuk 3{ {35}} min, dan akhirnya 70 peratus etanol selama 30 min. Setiap sampel telah diproses dengan Pemproses Tisu ASP300 (Leica). Sepuluh, sampel tisu buah pinggang dibenamkan dalam lilin parafn (Sakura Finetek) dengan EG1160 (Leica) dan disimpan pada 4 darjah . Sampel yang dibenamkan parafn dihiris pada ketebalan 6 µm dengan RV240 Rotary Microtome (Yamato Kohki). Bahagian pada slaid kaca disimpan pada 4 darjah sehingga pewarnaan. Pewarnaan immunofuorescent. Bahagian buah pinggang beku telah direndam dalam 0.1 peratus Triton X-100 (Nacalai Tesque) / PEM selama 10 minit pada suhu bilik. Sepuluh, sampel telah dipermudahkan dengan menggunakan 0.2 peratus Triton X-100 / PEM selama 10 minit pada suhu bilik. Sekali lagi, sampel direndam dalam 0.1 peratus Triton X-100 / PEM selama 10 minit pada suhu bilik. Seterusnya, sampel disekat dengan 3 peratus albumin serum lembu (BSA; Roche) / 0.1 peratus Triton X-100 / PEM selama 30 minit pada suhu bilik, diikuti dengan tindak balas antibodi primer selama semalaman pada 4 darjah . Antibodi utama telah dicairkan dalam 3 peratus BSA / 0.1 peratus Triton X-100 / PEM. Untuk antibodi utama yang dibangkitkan pada tikus, penyekatan tambahan dengan Reagen Penyekat MOM (Makmal Vektor) telah dijalankan sebelum menyekat dalam 3 peratus BSA / 0.1 peratus Triton X-100 / PEM. Reagen Penyekat MOM telah dicairkan dalam 0.1 peratus Triton X-100 / PEM dan digunakan pada sampel selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas rawatan MOM, sampel telah dibasuh dengan 0.1 peratus Triton X-100 / PEM tiga kali selama 5, 10 dan 15 minit pada suhu bilik. Selepas tindak balas antibodi utama, sampel telah dibasuh selama 15 minit pada suhu bilik dengan 0.1 peratus Triton X-100 / PEM tiga kali. Tindak balas antibodi sekunder telah dijalankan selama 2 jam pada suhu bilik dalam gelap. Antibodi sekunder telah dicairkan dalam 3 peratus BSA / 0.1 peratus Triton X-100 / PEM. Selepas tindak balas, sampel telah dibasuh dengan 0.1 peratus Triton X-100 / PEM tiga kali selama 5, 10 dan 15 minit pada suhu bilik dan dimeterai dengan Medium Pemasangan VECTASHIELD (Makmal Vektor). Antibodi dan reagen. DNA telah diwarnai dengan larutan DAPI (Dojindo, D523, 1:1000). F-actin telah diwarnai dengan Alexa Fluor 594 phalloidin (Termo Fisher, A12381, 1:400). Microtubules telah diwarnai dengan anti- -tubulin-FITC tetikus (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Antibodi utama berikut digunakan: anti-Megalin kambing (P-20; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), pengangkut bersama anti-NaCl arnab (MERCK, AB3533, 1:500 ), arnab anti-aquaporin-2 (abcam, AB3274, 1:400), kambing anti-SGLT1 (M-19; Santa Cruz Biotech-nology, sc-20582, 1:200) , arnab anti-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), anti-ezrin tetikus (3C12; abcam, ab4069, 1:500), arnab anti-giantin (Covance, PRB-114 C, 1:700), arnab anti-aPKC (Santa Cruz Biotech-nology, sc-216, 1:400), kambing anti-DPP IV (Sistem R&D, AF954, 1:100), tetikus anti-Na tambah /K tambah -ATPase (abcam, ab7671, 1:100), tubulin anti-asetilasi tetikus (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), arnab anti-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), tetikus tubulin anti-tyrosinated (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), arnab anti-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), arnab anti-YAP (Cell Signaling, #4912, 1:100 ), rantai cahaya anti-myosin arnab 2 (Isyarat Sel, #8505, 1:100), arnab anti-piezo1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), anti-E-cadherin tikus (52, 1:400) dan anti-merlin arnab (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Antibodi sekunder berikut telah digunakan: kunci donat Dylight 594–IgG anti-kambing terkonjugasi (Jackson, 1:500), kambing Alexa Fluor 488/594–IgG anti-arnab terkonjugasi (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), kambing Alexa Fluor 488/594–konjugat anti-tikus IgG (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500) dan kambing Alexa Fluor 488–IgG anti-tikus konjugasi (Termo Fisher, A-11006,

1:400). Kekhususan pengikatan antibodi anti-YAP (Cell Signaling, #4912) dan anti-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) yang digunakan dalam kajian telah disahkan oleh kerja terdahulu46,53 . Pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E). Slaid kaca dengan bahagian buah pinggang diletakkan pada plat 55 darjah selama 30 minit untuk meregangkan parafn. Sampel kemudian direndam dalam xilena selama 15 minit dua kali diikuti dengan rendaman dalam siri 70–100 peratus etanol: 100 peratus etanol selama 5 minit dua kali, 90 peratus etanol selama 5 minit, 80 peratus etanol selama 5 minit, dan 70 peratus etanol selama 5 minit. Selepas membilas dalam air selama 20 minit dan dalam H2O (ddH2O) suling/deionisasi selama 1 minit, sampel telah diwarnakan dalam larutan hematoksilin (Wako) Mayer selama 5 minit. Sampel dicelup dalam ddH2O dua kali, kemudian dibilas dengan ddH2O selama 10 minit. Sampel sekali lagi dicelup dalam ddH2O dan kemudian diwarnakan dalam larutan eosin (Merck) selama 2 minit. Untuk pembersihan, sampel direndam dalam ddH2O selama 30 saat, diikuti dengan rendaman dalam siri 70–100 peratus etanol dan xilena: 70 peratus etanol selama 5 saat, 80 peratus etanol selama 5 saat, 90 peratus etanol selama 5 saat, 100 peratus etanol selama 5 s dua kali, dan xilena selama 10 min. Akhirnya, sampel telah dimeterai dalam gliserol. Mikroskopi. Imej diperoleh dengan BZ-X710 All-in-one Fluorescence Microscope (Keyence) atau LSM880 laser scanning confocal microscope (Zeiss). Untuk BZ-X710, kanta objektif yang digunakan ialah Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × dan Nikon CFI Plan Fluor 4 × . Imej yang diperoleh telah diproses dengan perisian BZ-X Analyzer. Te LSM880 dilengkapi dengan mikroskop terbalik Axio Observer Z1 dengan kanta objektif rendaman minyak Plan- Apochromat 63 × /1.40 NA (Zeiss). Imej telah diproses dan dianalisis menggunakan ImageJ dan Adobe Photoshop CC2019. Analisis indeks kistik. Indeks kistik dianalisis oleh ImageJ menggunakan imej bernoda H&E pada bahagian mendatar buah pinggang. Sebagai ukuran bagi kawasan yang mengandungi sista, perimeter lumen tiub yang diluaskan telah dikesan menggunakan fungsi "Pemilihan tangan bebas", dan kawasannya diukur dengan fungsi "Ukur". Kerja ini dilakukan untuk semua sista dalam bahagian buah pinggang, dan kawasan semua sista telah ditambah bersama untuk menentukan kawasan yang mengandungi sista. Jumlah kawasan buah pinggang diukur dengan cara yang sama. Lingkaran luar buah pinggang dikesan menggunakan fungsi "Pemilihan tangan bebas", dan kawasannya dinilai. Akhirnya, kami mengira indeks sista dengan membahagikan kawasan yang mengandungi sista dengan jumlah kawasan buah pinggang.

Definisi tubul diluaskan dan tubul tidak diluaskan. Dalam penyelidikan ini, tubul dengan luas lumen Lebih besar daripada atau sama dengan 500 µm2 telah ditakrifkan sebagai "diluaskan", manakala tubulus dengan luas lumen<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Mikroskopi elektron. Untuk mikroskop elektron, tikus jantan P21 telah diperiksa. Sampel untuk mengimbas mikroskop elektron telah disediakan mengikut Takahashi-Iwanaga54 dengan pengubahsuaian tertentu, seperti berikut. Tikus telah dibius dengan isofuran dan wangi dengan 2 peratus (w/vol) formaldehid dan 2.5 peratus (vol/vol) glutaraldehid dalam 0.1 M penampan cacodylate, pH 7.4. Setiap buah pinggang dipotong dan dipotong menjadi kiub yang direndam dalam fxative yang sama semalaman, dan kemudian dibilas dengan 0.1 M penampan cacodylate. Sampel fx telah dipindahkan melalui larutan akueus 30 peratus dimetil sulfoksida ke dalam 60 peratus dimetil sulfoksida, dan kemudian dipecahkan dalam cecair N2 . Sampel yang patah dibilas dengan 0.1 M penampan cacodylate dan diletakkan dalam 6 N NaOH selama 1{{30}}–20 min pada 60 darjah . Selepas pemekatan dalam larutan NaOH, setiap sampel dibilas dengan penimbal kakodilat 0.1 M yang mengandungi 0.05 peratus Tween 20 dan postfxed dengan 1 peratus OsO4 dalam penampan kakodilat 0.1 M pada ais selama 2 jam. Sampel postfxed ialah: (1) dibilas dengan ddH2O dan diletakkan dalam 1 peratus tiokarbohidrazid berair selama 20 minit pada suhu bilik, dan (2) dibilas dengan ddH2O dan postfx sekali lagi dalam 1 peratus OsO4 dalam penampan cacodylate 0.1 M selama 1 jam pada suhu bilik . Selepas mengulangi langkah (1) dan (2), sampel dibilas dengan ddH2O, dan diwarnakan dengan larutan uranil asetat 0.5 peratus semalaman pada suhu bilik. Blok tisu dibilas dengan ddH2O dan didehidrasi melalui siri etanol berperingkat, dipindahkan ke isopentyl asetat, dan dikeringkan titik kritikal menggunakan CO2 cecair. Spesimen kering disaluti sejatan dengan osmium dan diperiksa menggunakan mikroskop elektron pengimbas JSM{54}}LV pada voltan pecutan 10 kV. Imej telah diproses dengan Adobe Photoshop.

Untuk mikroskop elektron penghantaran, kiub buah pinggang yang dibedah telah difx selama sekurang-kurangnya 2 jam dalam 2 peratus (w/vol) formaldehid dan 2.5 peratus (vol/vol) glutaraldehid dalam 0.1 M penampan cacodylate pada suhu bilik. Sampel telah dibasuh dengan 0.1 M penampan cacodylate dan postfxed dengan 1 peratus OsO4 dalam {{10}}.1 M cacodylate bufer pada ais selama 2 jam. Sampel kemudian dibasuh dengan ddH2O dan diwarnakan semalaman dengan 0.5 peratus uranil asetat berair pada suhu bilik. Sampel yang diwarnakan telah didehidrasi dengan siri etanol tergred, dipindahkan ke propilena oksida, dan dibenamkan dalam Polybed 812 (Polysciences). Bahagian ultranipis dipotong dengan pisau berlian, diwarnakan dua kali dengan uranil asetat dan plumbum sitrat, dan diperhatikan pada voltan pecutan 100 kV menggunakan mikroskop elektron penghantaran (JEM-1010; JEOL) dilengkapi dengan kamera peranti berganding cas ( Model BioScan 792; Gatan). Imej telah diproses dengan Adobe Photoshop.

Ujian air kencing dan ujian darah. Sebagai perbandingan dengan tikus Camsap3dc/dc, tikus WT (tambah / tambah) dan heterozigot (tambah /dc) digunakan sebagai kawalan dalam ujian ini. Tikus heterozigot tidak menunjukkan tanda-tanda Camsap3disfungsi10dan telah menyusun tatasusunan apiko-basal mikrotubulus. Tikus berumur 56-60 minggu.

Tikus ditempatkan dalam sangkar metabolik (TECNIPLAST). Sampel air kencing dikumpul setiap hari selama lima hari berturut-turut, dan sampel yang dikumpul disimpan pada suhu -80 darjah. Akhir sekali, kesemua lima sampel bagi setiap tetikus dicampurkan supaya campuran fnal mencerminkan keadaan purata setiap tetikus dalam tempoh tersebut.

Untuk pengumpulan darah, tikus telah mentadbir {{0}}.02 mL anestesia setiap gram berat badan. Komposisi anestesia ialah Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolam (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL, dan 0.9 peratus NaCl berair hingga 1 mL. Darah dikumpulkan melalui tusukan jantung. Untuk mengelakkan hemolisis, picagari dimasukkan perlahan-lahan dan ditarik keluar. Setiap sampel darah disimpan pada suhu bilik selama 1 jam untuk membeku. Setiap sampel kemudiannya disentrifugasi (10,000×g, 25 darjah , 15 min), dan serum dikumpulkan dan disimpan pada −80 darjah . Semua sampel air kencing dan darah telah dianalisis oleh Oriental Yeast Co.