Curcumin Mengurangkan Senescence Sel Stem Mesenchymal Sumsum Tulang Anjing Semasa Pembesaran In Vitro Bahagian 2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

2.5. Autophagy Inovoloes dalam Menjalankan Kesan Perlindungan Cur dalam cBMSC Senescence

Untuk meneroka kesan autophagy yang disebabkan oleh Cur pada penuaan cBMSC, tahap autophagy telah dimodulasi melalui penggunaan RAP(200 nM) atau 3-MA(5 mM).3-MA melakukan tindakan perencatan yang ketara pada aktiviti autofagik, dimanifestasikan oleh penurunan regulasi ketara bagi ekspresi mRNA protein 1 rantaian ringan 3(LC3) yang berkaitan dengan mikrotubule, gen berkaitan autophagy(ATG)7, ATG12 dan unc51-seperti kinase pengaktif autophagy{ {14}}(ULK1); nisbah ungkapan 1 rantai ringan 3 jenis Ⅱ/I (LC{19}}I/I) yang berkurangan berkaitan mikrotubule; dan peningkatan ekspresi p62 berbanding dengan kumpulan kawalan (Rajah 5A, B). Sehubungan itu, berbanding dengan kumpulan Cur, penurunan dalam aktiviti autofagik diperhatikan dalam 3-kumpulan MA tambah Cur (Rajah 5A, B). Sebaliknya, peningkatan dalam aktiviti autofagik diperhatikan dalam kumpulan RAP, seperti yang dibuktikan oleh ekspresi mRNA terkawal LC3, ATG12, dan ATG7; peningkatan penukaran LC3-I kepada LC3-II; dan kemerosotan p62 (Rajah 5A, B).

Pertama, aktiviti autofagik disiasat secara sistematik. Pembentukan vakuol autofagik (juga dikenali sebagai autofagosom) dinilai melalui pemerhatian morfologi, dan keputusan menunjukkan bahawa terdapat lebih banyak vakuol autofagik dan titik LC3 dalam kumpulan Cur dan kumpulan RAP berbanding dengan kumpulan kawalan, manakala bilangan vakuol autofagik dan kumpulan RAP berkurangan. lebih sedikit titik LC3 diperhatikan dalam kumpulan 3-MA dan 3-MA ditambah Cur (Rajah 5C, E). Selain itu, pewarnaan LysoTracker menunjukkan bahawa pengasidan lisosom telah dipertingkatkan oleh RAP dan Cur dalam cBMSC dan menurun dalam kumpulan 3-MA dan 3-MA ditambah Cur(Rajah 5D). Keputusan menunjukkan bahawa Cur dan RAP memberikan kesan positif yang sama pada pengaktifan autophagy dan aktiviti autofagik ditindas oleh 3-MA.saiz zakar cistanche,Walau bagaimanapun, kesan perencatan 3-MA pada autophagy boleh diselamatkan sebahagiannya dengan menggunakan Cur.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Untuk mengesahkan sama ada autophagy mengambil bahagian dalam peraturan CB MSc senescence, kami selanjutnya mengkaji fenotip berkaitan senescence selepas mempromosikan atau menindas autophagy melalui rawatan farmakologi. Keputusan menunjukkan bahawa bilangan sel SA- -gal-positif yang berkurangan terdapat dalam kumpulan Cur dan RAP, manakala peningkatan bilangan sel SA- -gal-positif diperhatikan dalam {{5} }Kumpulan MA berbanding dengan kumpulan kawalan. Perlu diperhatikan bahawa bilangan sel SA- -gal-positif telah meningkat dengan ketara dalam 3-kumpulan MA tambah Cur berbanding dengan kumpulan Cur (Rajah). Keputusan analisis RT-qPCR menunjukkan bahawa rawatan dengan RAP dan Cur meningkatkan tahap ekspresi SOX-2 dan Nanog serta menurunkan tahap ekspresi IL-6, TNF-a, p21 dan p16 berbanding dengan kumpulan kawalan. Walau bagaimanapun, perencatan autophagy oleh 3-MA mengimbangi ungkapan p16, p21, TNF- dan IL-6(Rajah 6C-E). Tambahan pula, berbanding dengan kumpulan kawalan, kecekapan membentuk koloni cBMSC telah meningkat dalam kumpulan Cur dan RAP, manakala bilangan dan saiz CFU-F telah berkurangan dengan ketara dalam kumpulan 3-MA. Selain itu, telah ditunjukkan bahawa kesan dipertingkatkan Cur pada bilangan pembentuk koloni cBMSC boleh dimansuhkan melalui prasyarat dengan 3-MA (Rajah 6B).serbuk cistancheBukti ini menunjukkan bahawa RAP dan Cur boleh memperbaiki penuaan cBMSC, manakala 3-MA memburukkan penuaan cBMSC dan melemahkan kesan berfaedah yang dikenakan oleh Cur.

Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa perencatan autophagy dengan 3-MA mempercepatkan penuaan cBMSCs, manakala pengaktifan autophagy dengan Cur dan RAP mengurangkan penuaan cBMSC (Rajah 6F). Terutamanya, kesan perlindungan yang dikenakan oleh Cur telah dilemahkan oleh prarawatan dengan 3-MA(Rajah 6F), menunjukkan bahawa autophagy yang disebabkan oleh Cur ialah mekanisme molekul yang berpotensi untuk memperbaiki penuaan cBMSC.

3. Perbincangan

Organisma secara berterusan membaiki tisu yang cedera dan melambatkan proses yang berkaitan dengan penuaan disebabkan oleh ciri-ciri fungsi khas MSC yang secara meluas berada dalam pelbagai tisu dan organ [15]. Malangnya, usia dan penyakit adalah faktor utama untuk penuaan MSC dalam vivo, dan perbezaan dalaman dan luaran dalam persekitaran selular mempercepatkan penuaan MSC secara in vitro, kedua-duanya memberi kesan negatif kepada kapasiti mereka untuk imunosupresi, pembezaan dan penghijrahan, akhirnya mengurangkan keberkesanan diri. -pembaikan dan pemindahan dalam MSC [7,14,49-51].ekstrak cistanche salsaOja dan rakan sekerja menunjukkan bahawa BMSC manusia menghentikan percambahan pada peringkat kelima hingga kesembilan kultur gred klinikal dan mempamerkan fenotip penuaan tipikal, seperti morfologi hipertrofik dan rata, pengaktifan perencat kitaran sel kinase p16 dan p21, kadar percambahan menurun , dan aktiviti dipertingkat SA- -gal [52]. Jelas sekali, pengembangan in vitro tidak dapat dielakkan menimbulkan kemunculan penuaan pramatang dalam MSC, yang dianggap sebagai sistem model penting untuk penyelidikan penuaan selular in vitro [42, A4, A5]. Kajian semasa kami mendapati bahawa cBMSC sebelum petikan ke-3 menunjukkan morfologi seragam tetapi telah diperhatikan mengalami satu siri perubahan dari segi morfologi selular, fisiologi, dan ekspresi gen selepas laluan ke-6 (Rajah 2 dan 7), selaras dengan penuaan pramatang .

Cistanche boleh anti-penuaan

Jumlah bukti yang semakin meningkat menunjukkan bahawa rangsangan farmakologi adalah pendekatan yang menjanjikan untuk menyelamatkan MSC daripada penuaan [53,54]. Dengan pemikiran ini, beberapa sebatian semula jadi dan sintetik telah disiasat secara meluas untuk menentukan potensi anti-radang, antioksidan, dan anti-penuaan mereka dalam vivo dan in vitro [15,55]. Sebagai sebatian fenolik yang berlaku secara semula jadi, Cur telah menimbulkan perhatian yang besar kerana kesannya yang bermanfaat terhadap biologi MSC [36,37,56,57]. Walau bagaimanapun, kesan kompleks pendedahan Cur pada MSC harus dipertimbangkan dengan teliti sebelum pelaksanaan penyelidikan bioperubatan yang berbeza. Yang dan rakan sekerja melaporkan bahawa kepekatan Cur yang tinggi (50 dan 100 uM) boleh menyebabkan kesan toksik akut dalam BMSC manusia secara in vitro, manakala pendedahan berterusan (7 d) hingga 10uM Cur menghalang percambahan BMSC manusia dan mendorong apoptosis sel [58]. Menariknya, kajian lain menunjukkan bahawa rawatan dengan Cur(<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Baru-baru ini, aktiviti biologi Cur telah dilaporkan secara meluas pada pelbagai model in vitro atau in vivo, terutamanya mengenai modulasi ciri biologi MSC. Aktiviti anti-penuaan Cur telah dibincangkan dengan kerap, dan Cur didapati mempamerkan kesan yang baik terhadap penuaan dan penyakit yang berkaitan dengan usia pada peringkat organisma dan selular. Walau bagaimanapun, mekanisme yang mendasari peraturannya adalah rumit kerana dos dan bentuk Cur yang berbeza, serta mekanisme penuaan [19]. Sebagai mekanisme intraselular utama degradasi molekul dan perolehan organel, autophagy memainkan peranan utama dalam melindungi MSC daripada keadaan tekanan dan mengekalkan homeostasis selular. Modulasi autophagy dianggap sebagai strategi baru untuk memperbaiki fungsi MSC [59]. Menurut data yang dikumpul daripada kajian besar, promosi atau penindasan autophagy oleh Cur dalam pelbagai model sel memberikan kesan sitoprotektif yang memuaskan [38-40].batang cistancheData kami menunjukkan bahawa peningkatan aktiviti autofagik diperhatikan selepas pendedahan kepada Cur, seperti yang dikenal pasti oleh pengawalseliaan gen berkaitan autophagy (LC3, ULK1, Atg7, dan Atg12), penjanaan LC3-II, peningkatan dalam bilangan vakuol autofagik dan organel vesikular berasid, dan penurunan ketara dalam tahap protein p62 (Rajah 4). Selain itu, lisosom dianggap sebagai organel yang sangat diperlukan untuk autophagy, manakala disregulasi pH lisosom dan perubahan aktiviti vakuolar H plus -ATPase (v-ATPase) diperhatikan dalam proses penuaan MSC, sekali gus menggalakkan pengasidan lisosom dan autophagy dan menyumbang untuk melambatkan penuaan MSC [60]. Yan dan rakan sekerja menunjukkan bahawa Cur boleh mengaktifkan fungsi lisosom fibroblas embrio tetikus (MEFs) dan mendorong autophagy, yang berfungsi sebagai isyarat survival yang penting [38]. Begitu juga, kami melihat bahawa rawatan Cur meningkatkan pengasidan lisosom dalam cBMSC (Rajah 4), menunjukkan bahawa Cur mungkin terlibat dalam mengaktifkan fungsi lisosom, yang sangat diperlukan untuk meningkatkan aktiviti autofagik.

Autophagy kebanyakannya merupakan mekanisme sitoprotektif, dan semakin banyak bukti menunjukkan bahawa sifat anti-penuaan sebatian semula jadi dan sintetik dikaitkan dengan modulasi autophagy [29,54,61,62]. Walau bagaimanapun, kesan modulasi autophagy pada penuaan MSC dan mekanisme yang sepadan belum lagi dinilai dan diterokai sepenuhnya. Laporan awal telah menunjukkan bahawa autophagy adalah mekanisme sitoprotektif dan peningkatan tahap autophagy boleh melambatkan penuaan selular dengan mengurangkan pengumpulan metabolit toksik dan memulihkan fungsi organel [63]. Menariknya, penyiasatan baru-baru ini juga menunjukkan bahawa peningkatan bilangan vakuol autofagik dan protein berkaitan autophagy (LC3-II, ATG7 dan ATG12) telah diperhatikan semasa penuaan MSC, manakala perencatan autophagy dengan bafilomycin A1 dan {{11 }}MA ditunjukkan untuk mengurangkan peratusan sel SA- -gal-positif dan ungkapan p16 dan p21 [35]. Untuk menjelaskan lebih lanjut hubungan antara autophagy yang disebabkan oleh Cur dan kesannya pada cBMSCsenescence, autophagy telah dimodulasi dengan prarawatan dengan rapamycin atau 3-MA. Jelas sekali, aktiviti autofagik didapati dilemahkan oleh 3-MA, manakala RAP dan Cur (1 uM) ditunjukkan dengan ketara meningkatkan autophagy (Rajah 5). Selaras dengan laporan terdahulu [5], penemuan kami juga menunjukkan bahawa perencatan autophagy oleh 3-MA mempercepatkan penuaan selular dalam cBMSCs. Kesan yang hampir konsisten pada pengaktifan autophagy telah dilakukan oleh Cur(1uMand RAP manakala kesan sitoprotektif analog dalam cBMSC telah dipaparkan. Oleh itu, apabila autophagy dihalang oleh 3-MA, kesan perlindungan yang dikenakan oleh Cur telah berkurangan (Rajah ), menunjukkan bahawa autophagy yang disebabkan oleh Cur ialah mekanisme molekul yang berpotensi untuk memperbaiki penuaan cBMSC (Rajah 7).

Di bawah keadaan fisiologi, autophagy berlaku pada tahap asas dalam semua sel eukariotik untuk mengekalkan homeostasis selular. Walau bagaimanapun, pelbagai keadaan tekanan boleh membawa kepada autophagy yang tidak normal, yang mempunyai pengaruh ke atas nasib sel melainkan autophagy dipulihkan ke tahap optimum [41,44,64]. Bukti kami mengesahkan bahawa autophagy yang disebabkan oleh Cur mempamerkan kesan yang baik terhadap peraturan penuaan cBMSC. Dalam senario ini, rangsangan penghasil tekanan yang pelbagai dan tetapan ekstraselular harus dipertimbangkan dengan teliti sebelum rawatan Cur, dan adalah menarik untuk menyiasat sama ada autophagy yang disebabkan oleh Cur boleh secara selektif meningkatkan fungsi MSC pada dos dan tempoh yang telah ditetapkan. Selain itu, sistem penyampaian kurkumin berasaskan nanoteknologi telah mempamerkan tahap keterlarutan fasa akueus dan bioavailabiliti yang lebih baik [65,66]; ia boleh menjadi alat yang menjanjikan untuk menangguhkan dan mengatasi penuaan MSC. Jawapan kepada persoalan sama ada autophagy adalah mekanisme asas utama dalam melambatkan penuaan MSC masih memerlukan lebih banyak butiran yang akan disediakan oleh penyelidikan masa depan.

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Haiwan

Sampel sumsum tulang telah dikumpulkan daripada 6 ekor anjing luar bandar Cina betina dewasa yang sihat (12-berusia sebulan). Semua kajian telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Fakulti Universiti Pertanian Sichuan (no. kelulusan2020-0608)dan dijalankan mengikut piawaian etika undang-undang perlindungan haiwan Republik Rakyat China.

4.2. Penyediaan Penyelesaian Curcumin

Cur(HPLC Lebih daripada atau sama dengan 98 peratus , nombor CAS:458-37-7; Solar Science& Technology Co., Ltd., Beijing, China) telah dilarutkan dalam DMSO kepada kepekatan stok 20 mmol/ L. ditapis melalui membran penapis mikroporous organik 0.22 μm dan disimpan pada -80 darjah . Larutan Cur yang berbeza telah disediakan dalam medium untuk kajian in vitro.

4.3. Kultur dan Pengembangan Sel

cBMSC diperolehi daripada sumsum tulang. Sel-sel telah dikultur dalam medium lengkap yang terdiri daripada Medium Helang Modified Dulbecco rendah glukosa (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, USA), 10 peratus serum lembu janin (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China ), dan 1 peratus penisilin/streptomisin. Pada pertemuan 80-90 peratus, sel yang melekat dilepaskan dengan Penyelesaian Pencernaan Trypsin (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) dan terus berkembang pada nisbah 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Curie Pertumbuhan Sel

Untuk menentukan keupayaan proliferatif cBMSC dalam petikan (P)3,6, dan 9, sel telah disemai dalam tiga 48-plat perigi (2500 sel/telaga). Selepas pengeraman 48 jam, sel-sel dibebaskan dengan Penyelesaian Pencernaan Trypsin dan dikira dengan hemocytometer. Prosedur pengiraan sel diulang setiap 48 jam dan dikekalkan selama 14 hari.

4.5. Pengesanan Imunofenotip cBMSC oleh Sitometri Aliran

Dalam petikan ke-3, cBMSC telah dibasuh dengan PBS dan trypsinized. Sel-sel (3 × 105 sel / mL) telah digantung semula dalam penimbal pewarnaan, dan penggantungan sel （100 μL） telah diinkubasi dengan antibodi monoklonal berlabel FITC, PE, atau APC berlabel pendarfluor terhadap antigen permukaan CD45, CD34, dan ITGB1(eBioscience, San Diego, CA, USA) dan CD31, CD90, dan CD105 yang tidak berlabel bukan pendarfluor (Biosynthesis biotechnology Co.Ltd. Beijing, China) selama 15 minit pada 4 darjah . Sel-sel telah dibasuh dengan PBS dan diinkubasi dengan IgG anti-arnab kambing konjugasi FITC selama 15 minit pada 4 darjah. Antigen permukaan dikesan oleh sitometri aliran (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, Amerika Syarikat). Analisis data telah dijalankan dengan perisian CytExpert.

4.6. Ujian Pembezaan In Vitro

cBMSC disalut pada ketumpatan 5×104 sel/mL dalam 6-plat telaga. Pada 70-80 peratus pertemuan, medium lengkap telah digantikan dengan medium aruhan pembezaan osteogenik atau adipogenik dan ditukar setiap 3 hari (Cvagen, Suzhou, China). Pemendapan kalsium dikesan dengan pewarnaan Alizarin Red S (Solarbio, Beijing, China) selepas 3 minggu induksi osteogenik dan pengumpulan titisan lipid diperhatikan menggunakan pewarnaan Oil Red O (Solarbio, Beijing, China) selepas 2 minggu induksi adipogenik.

4.7.Kesan Cur pada Daya Daya Selular

Daya maju selular cBMSC ditentukan menggunakan kit CCK-8 (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China).faedah dan kesan sampingan cistanche tubulosacBMSC telah diprakultur dalam 96-plat perigi selama 24 h.cBMSC dirawat dengan Cur pada kepekatan yang berbeza (0.1, 0.5, 1, 5 dan 1{ {14}} umol/L) selama 12j, 24j,48j dan 72j. Sel telah dirawat dengan 0.1 peratus DMSO, yang digunakan sebagai kawalan Selepas mengeram dengan 10 μL larutan CCK{17}} setiap telaga selama 2 jam, ketumpatan optik diukur oleh pembaca plat mikro pada 450 nm (Thermo Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat). Daya maju sel relatif dikira mengikut arahan pengilang.

4.8. Ujian Pembentukan Koloni

Kecekapan pembaharuan diri cBMSC telah dikesan menggunakan ujian unit-fibroblast （CFU-F） yang membentuk koloni. cBMSC telah disemai （3× 10² sel/telaga） dalam 6-plat perigi. Selepas dua minggu kultur, sel-sel telah ditetapkan dengan 4 peratus paraformaldehid selama 30 minit dan diperhatikan di bawah mikroskop terbalik (LX73, Olympus Corporation, Tokyo, Jepun) selepas pewarnaan dengan 1 peratus kristal violet selama 10 minit. Untuk CFU-F, lebih daripada 50 sel telah dikira. Kecekapan CFU-F dikira seperti berikut:

Kecekapan CFU-F=bilangan CFU-F/bilangan benih (300 sel)[68].

4.9. Ujian Pewarnaan Beta-Galactosidase

Aktiviti -galactosidase yang berkaitan dengan penuaan (SA- -}gal) dalam cBMSC dianggarkan menggunakan kit pewarnaan SA- -gal (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) mengikut arahan pengilang . Selepas pewarnaan, sel-sel diperiksa di bawah mikroskop terbalik. Sel yang diwarnakan secara positif dikira untuk menilai penuaan selular.

4.10.Transkripsi Songsang PCR Kuantitatif Masa Nyata(RT-qPCR)

Jumlah RNA telah diekstrak daripada pelet sel menggunakan kaedah reagen Trizol. cDNA telah disintesis menggunakan kit reagen PrimeScriptTM RT dengan Pemadam gDNA (Takara, Shiga, Jepun). Primer PCR (Jadual 2) selain GAPDH merujuk kepada kajian terdahulu [67] direka menggunakan perisian Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) berdasarkan jujukan cDNA. qPCR dilakukan menggunakan Campuran PCR Hijau TB (Takara, Shiga, Jepun) pada Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata Sentuh CFX96 (Bio-Rad, Richmond, CA, Amerika Syarikat). Keadaan tindak balas adalah seperti berikut:95 darjah selama 3{16}} s dan kemudian 39 kitaran 95 darjah selama 5s dan 60 darjah selama 30 saat. Analisis lengkung lebur telah dilakukan bermula pada 95 darjah selama 10s, kemudian antara 65 hingga 95 darjah, meningkat sebanyak 0.5 darjah setiap kitaran. GAPDH digunakan sebagai kawalan dalaman untuk menormalkan semua data dan ungkapan relatif dikira melalui kaedah Ambang Kitaran perbandingan (Ct).

4.11. Penjejakan Lusosomal UIsing LysoTracker

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) telah digunakan untuk mengesan lisosom, yang boleh mempamerkan peningkatan intensiti pendarfluor apabila pengasidan lisosom. Kami menyemai cBMSC dalam 12-plat perigi dan merawatnya dengan Cur selama 24 jam, kemudian sel-sel tersebut dirawat dengan Lyso-Tracker(60 nM) dan Hoechst 33,342 (2 ug/mL) selama 20 minit. Pendarfluor diperhatikan menggunakan mikroskop pendarfluor terbalik selepas mencuci dengan PBS.

4.12. Imunofluoresensi

cBMSC (2×104 sel/slaid) telah disemai pada slaid dan dibetulkan dengan 4 peratus paraformaldehid selama 30 minit. Selepas pengeraman bersama dengan 0.5 peratus Triton X-100 selama 5 minit (Solarbio, Beijing, China), bahagian tersebut direndam dalam larutan penyekat selama 30 minit. Cecair tertutup dikeluarkan, dan sel diinkubasi dengan antibodi anti-LC3B (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, Amerika Syarikat) semalaman pada 4 darjah, kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi fluorochrome (Abcam, Cambridge, MA, Amerika Syarikat) selama 50 minit pada 37 darjah C. Akhirnya, sel-sel telah diwarnakan dengan DAPI (Bioteknologi Beyotime, Shanghai, China) dan dipantau di bawah mikroskop confocal.

4.13.Analisis Western Blotting

Sampel sel telah dilisiskan dengan tisu dan lisat sel (Solarbio, Beijing, China) yang mengandungi perencat protease selepas dibasuh dengan PBS sejuk ais. Lisat sel yang mengandungi 15 ugs protein setiap sampel telah dimuatkan ke dalam gel natrium-dodesil sulfat-polyacrylamide (SDS-PA) (Solarbio, Beijing, China) dan dipisahkan oleh elektroforesis. Selepas memindahkan protein ke membran polyvinylidene fluoride (PVDF), yang terakhir telah disekat secara tidak spesifik dengan 5 peratus susu kering tanpa lemak (Solarbio, Beijing, China) selama 1 jam pada suhu bilik. Membran diinkubasi semalaman dengan antibodi utama anti-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-p62/SQSTM1(1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA ), dan anti- -aktin (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) pada 4 darjah , dan tompok itu dibasuh dengan TBST(Solarbio, Beijing, China) sebelum mengeramkannya dengan antibodi sekunder (1 :2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) pada 37 darjah selama 1 jam. Selepas itu, membran telah dibangunkan melalui pendedahan kepada reagen chemiluminescence (Millipore, Billerica, MA, USA) dan divisualisasikan dengan Sistem Pengimejan ChemiDocTM(Tanon-5200, Shanghai, China). Ketumpatan jalur dikira menggunakan perisian Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) untuk setiap kumpulan dan dinormalisasi dengan -actin.

4.14. Mikroskopi Elektron Penghantaran (TEM)

Pelet sel telah dihadam dan dikumpulkan ke dalam tiub emparan 1.5mL, kemudian difiksasi dengan 2.5 peratus glutaraldehid (Solarbio, Beijing, China) selama 2 jam pada suhu bilik. Sampel telah difiksasi selepas 1 peratus osmium tetroksida selama 1 jam selepas dibasuh dengan PBS, kemudian kami meningkatkan dehidrasi secara berperingkat dalam larutan aseton dan membenamkannya dalam resin epoksi812 (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Bejing, China). Selepas itu, bahagian 50 nm diperoleh daripada ultra-mikrotom (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Jerman). Bahagian tersebut telah diwarnai dengan uranil asetat (Zhongjingkevi, Bejing, China) selama 10-15 min dan sitrat plumbum (Zhongjingkei, Beijing, China) selama 2 minit. Semua spesimen telah dilihat pada TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokyo, Jepun).

4.15. Analisis statistik

Keputusan diperoleh daripada tiga eksperimen bebas dan semua data ditunjukkan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Nilai statistik dianalisis menggunakan IBM SPSs Statistics 25 dan digambarkan menggunakan GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Perbezaan ketara secara statistik ditentukan menggunakan dilakukan menggunakan analisis varians sehala (ANOVA) dan ujian-t Pelajar. nilai p<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Kesimpulan

Penemuan kami memberi penerangan tentang hubungan antara Cur, cBMSC senescence, dan autophagy. Data dari kajian kami menunjukkan bahawa Cur boleh mengurangkan keadaan penuaan cBMSC sambil mengaktifkan autophagy dan mempromosikan pengasidan lisosom. Selain itu, bukti lanjut menunjukkan bahawa autophagy yang disebabkan oleh Cur adalah mekanisme yang berpotensi untuk memperbaiki penuaan cBMSC. Cur boleh menjadi pengaktif dan konservator yang menjanjikan untuk meningkatkan fungsi MSC. Pada pendapat kami, kesan positif Cur terhadap penuaan tidak boleh diabaikan. Kajian masa depan harus memberi tumpuan kepada kesan peraturan Cur pada nasib MSC untuk meningkatkan potensi terapeutik MSC dalam pelbagai penyakit, seperti kerosakan tisu dan penyakit degeneratif dan keradangan.

Artikel ini dipetik daripada Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms