Gabungan Pangenomics Dan Transcriptomik Mendedahkan Teras dan Proses Virulensi Berlebihan dalam Patogen Tumbuhan Kulat yang Berkembang Pantas
Dec 05, 2023
Abstrak
Latar belakang
Mengkaji variasi genomik dalam patogen yang berkembang pesat berpotensi membolehkan pengenalpastian gen yang menyokong "biologi teras" mereka, hadir, berfungsi dan dinyatakan oleh semua strain atau "biologi fleksibel", berbeza antara strain. Gen yang menyokong biologi fleksibel boleh dianggap sebagai "aksesori", manakala set gen "teras" mungkin penting untuk ciri umum biologi spesies patogen, termasuk virulensi pada semua genotip perumah. Kulat gandum-patogen Zymoseptoria tritici mewakili salah satu ancaman yang paling pesat berkembang kepada keselamatan makanan global dan menjadi tumpuan kajian ini.
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity
【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Keputusan
Kami membina pangenome daripada 18 pencilan medan Eropah, dengan 12 juga tertakluk kepada profil transkripsi RNAseq semasa jangkitan. Menggabungkan data ini, kami meramalkan set gen "teras" yang terdiri daripada 9807 jujukan yang (1) hadir dalam semua isolat, (2) kekurangan polimorfisme yang tidak aktif, dan (3) dinyatakan oleh semua isolat. Genom aksesori besar, yang terdiri daripada 45% daripada jumlah gen, juga ditakrifkan. Kami mengklasifikasikan polimorfisme genetik dan genomik pada kedua-dua skala gen kromosom dan individu. Protein yang diperlukan untuk fungsi penting termasuk virulensi mempunyai kebolehubahan jujukan yang lebih rendah daripada purata di kalangan gen teras. Kedua-dua genom teras dan aksesori mengekodkan banyak protein pengesan calon kecil yang dirembeskan yang mungkin berinteraksi dengan imuniti tumbuhan. Transien pengantara vektor virus dalam ekspresi berlebihan planta sebanyak 88 calon gagal mengenal pasti mana-mana yang menyebabkan ciri nekrosis daun bagi penyakit itu. Walau bagaimanapun, pelengkap fungsi mutan penghapusan bukan patogen yang tidak mempunyai lima gen teras menunjukkan bahawa virulensi penuh telah dipulihkan dengan pengenalan semula gen tunggal yang mempamerkan polimorfisme jujukan paling sedikit dan ekspresi tertinggi.
Kesimpulan
Data ini menyokong penggunaan gabungan pangenomics dan transkriptomics untuk menentukan gen yang mewakili teras, dan berpotensi untuk dieksploitasi, kelemahan dalam patogen yang berkembang pesat.
Kata kunci
Virus mozek Foxtail, Septoria tritici, Efektor Necrotrophic, Gen penting, Kromosom aksesori, Dothideomycetes,Ketidakstabilan kromosom, Mycosphaerella spp
Latar belakang
Kawalan mampan penyakit berjangkit yang menjejaskan haiwan dan tumbuhan dicabar oleh evolusi mikro-organisma penyebab [1, 2]. Penyakit yang paling sukar dikawal adalah yang disebabkan oleh spesies yang paling pesat berkembang, yang boleh bertindak balas dengan cepat kepada tekanan terpilih, termasuk imuniti perumah semulajadi, keadaan persekitaran yang buruk, dan/atau ubat anti-jangkitan [1, 3]. Potensi untuk patogen mikrob berkembang pesat ditentukan oleh beberapa ciri, termasuk antara lain; (1) kitaran hayat pantas dan (2) mekanisme yang menggalakkan pembiakan seksual [4]. Yang terakhir ini boleh membawa kepada tahap besar variasi genetik yang wujud dalam populasi patogen yang boleh dikekalkan dan diperkuatkan dalam menghadapi tekanan terpilih luaran. Walaupun gen tertentu berkemungkinan mempamerkan variasi urutan genetik semula jadi, memacu evolusinya, yang lain tidak boleh hilang (atau dinyahaktifkan oleh mutasi) tanpa menjejaskan kecergasan patogen. Bagi patogen tumbuhan eukariotik dan prokariotik, perbezaan tahap polimorfisme antara gen ini telah membawa kepada realisasi "genom dua kelajuan" [5], yang terdiri daripada beberapa komponen yang berkembang pesat dan dianggap bertindak balas kepada pemacu luaran (julat perumah dan imuniti, dsb.), manakala set yang lebih perlahan berkembang mengandungi gen dengan pengemasan teras dan fungsi penting lain. Bahagian aksesori dan teras genom patogen boleh dipasang menjadi "pangenome" yang sepatutnya mewakili hampir set lengkap gen yang terdapat dalam spesies [6]. Saiz bahagian teras dan aksesori pangenome berbeza-beza dalam spesies bakteria, kulat, dan oomycetes [7-13] dan mungkin memberi petunjuk tentang potensi populasi mikrob untuk berkembang pesat kepada tekanan terpilih. Dapat dibayangkan bahawa lebih besar pangenome aksesori adalah relatif kepada teras, lebih mampu populasi ini berkembang pesat. Patogen kulat ascomycete gandum, Zymoseptoria tritici, adalah agen penyebab Septoria tritici blotch (STB), penyakit penting di peringkat global yang mengancam keselamatan makanan [14]. Patogen juga telah lama dianggap sebagai sistem model untuk kajian tentang biologi populasi dan evolusi [15-18]. Ini kerana Z. tritici mempunyai kadar penggabungan semula seksual yang tinggi yang mengekalkan sejumlah besar kepelbagaian genetik dalam populasinya dan membolehkan penyesuaian pantas pada skala global dan tempatan [17, 19-24]. Akibatnya, gen gandum utama yang memberikan rintangan kepada Z. tritici diatasi dengan cepat [25]. Di samping itu, kebanyakan racun kulat komersial yang digunakan secara meluas kehilangan keberkesanannya dari masa ke masa [3]. Gabungan kedua-dua faktor ini menimbulkan ancaman kepada pengeluaran gandum global yang perlu ditangani segera. Z. tritici juga baru-baru ini muncul sebagai model baru untuk genomik patogen dengan banyak rujukan genom berkualiti tinggi kini tersedia [26] sebagai tambahan kepada pangenome yang dibina daripada sejumlah besar genom terpencil individu [27, 28]. Mungkin salah satu ciri yang paling menarik bagi genom Z. tritici ialah kehadiran 13 kromosom teras (1-13) yang terdapat dalam semua pencilan tetapi kemudian sehingga 8 lagi kromosom aksesori yang lebih kecil (14-21) yang menunjukkan kehadiran/ketiadaan dan polimorfisme struktur antara pencilan [26, 29]. Nasib baik, salah satu pengasingan rujukan komuniti, dan yang pertama dijujukan sepenuhnya, pengasingan medan Belanda IPO323 yang dikumpul pada tahun 1980-an, membawa 21 kromosom, bilangan terbesar yang diperhatikan setakat ini. Oleh itu, IPO323 berfungsi sebagai penanda aras yang sangat baik untuk mengkaji variasi dalam pencilan lain dan sebagai perancah untuk membina pangenom.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Kitaran jangkitan aseksual Z. tritici adalah tipikal bagi banyak patogen tumbuhan berkaitan yang menjejaskan banyak tanaman makanan [30]. Kulat ini, kepunyaan keluarga Mycosphaerellaceae dari ordo Dothideomycetes, biasanya menyerang tisu tumbuhan melalui stomata [30, 31]. Selepas itu, tempoh pertumbuhan tanpa gejala yang lama di antara sel tumbuhan, berlangsung sekurang-kurangnya 8 hari, yang berakhir secara tiba-tiba dengan pembentukan lesi daun nekrotik, keadaan yang bagi Z. tritici, nampaknya berlaku akibat daripada "hiperaktivasi" tumbuhan. imuniti [32–34]. Kematian sel tumbuhan kemudiannya dikaitkan dengan pembentukan struktur sporulasi baru, pycnidia, dalam rongga sub-stomata dan penyemperitan seterusnya dan penyebaran pycnidiospores yang baru terbentuk semasa tempoh hujan percikan. Kulat Dothideomycetes yang lain telah terbukti menimbulkan hiperaktivasi imuniti tumbuhan melalui rembesan "efektor" protein yang diiktiraf dalam tumbuhan sensitif, mengakibatkan kematian sel dan tisu (nekrosis atau kematian sel terprogram). Kulat nekrotropik ini mendapat manfaat daripada tindak balas ini dan protein effector yang terlibat kini dirujuk sebagai effector necrotrophic [35, 36]. Walaupun terdapat beberapa bukti awal bahawa Z. tritici mungkin juga menggunakan efektor nekrotropik pada peralihan kepada pertumbuhan bergejala [37], yang menimbulkan lesi daun, hipotesis ini belum diuji dengan kukuh sehingga kini. Dua laluan yang saling tidak eksklusif untuk melindungi pengeluaran gandum masa depan daripada kesan STB adalah untuk (1) meningkatkan daya tahan penyakit tumbuhan semula jadi dan (2) mengenal pasti sasaran molekul baharu yang mungkin dieksploitasi untuk kawalan penyakit. Sebaik-baiknya, ini akan membolehkan kawalan terpilih terhadap patogen sambil mengehadkan kesan alam sekitar dan ekologi yang lain pada tahap minimum. Genomik patogen dan khususnya pangenomics menawarkan potensi untuk menambah kedua-dua strategi. Walaupun protein dikodkan oleh aksesori, bahagian pangenome yang berkembang pesat mungkin mengandungi banyak gen yang berinteraksi dengan imuniti tumbuhan (cth effectors), genom teras mungkin menunjukkan sasaran yang kurang mudah bermutasi kerana memberikan penalti kecergasan negatif (dan virulensi). Atas sebab ini, racun kulat pertanian biasanya menyasarkan proses teras, yang mungkin dianggap kurang boleh berubah. Walau bagaimanapun, seperti yang dinyatakan sebelum ini, walaupun sasaran ini boleh berkembang sedikit sebanyak untuk mengelakkan perencatan kimia, seperti yang diterangkan untuk banyak protein sasaran racun kulat semasa [3, 14]. Kebanyakan racun kulat yang digunakan setakat ini telah menyasarkan set proses molekul yang agak sempit (cth, biosintesis sterol, respirasi, dll.) [3]. Terdapat berpotensi banyak sasaran lain yang boleh digunakan untuk mengawal patogen kulat secara selektif yang sepatutnya timbul daripada menggabungkan dan menganalisis beberapa set data omik. Potensi tinggi untuk penemuan ditekankan oleh fakta bahawa biasanya sehingga 40% daripada semua gen yang dikenal pasti dalam jujukan genom kulat patogen (dan kulat secara amnya) masih tidak diketahui fungsinya. Mereka yang ada dan mungkin terpelihara dalam genom teras kulat patogen mungkin mempunyai kaitan tertentu.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% gen dianotasi sebagai teras [10]. Walau bagaimanapun, analisis lain mengenai kulat flamen yang berkaitan dengan tumbuhan telah meramalkan komponen gen aksesori yang lebih besar termasuk ~ 38% untuk patogen Claviceps purpurea [38] dan ~ 44% dalam Pyrenophora tritici-repentis [39]. Kajian pan-genomik yang komprehensif sebelum ini mengenai Z. tritici telah menggunakan populasi global dan sejarah yang melibatkan nombor terpencil yang besar, yang telah dijujukan pada kedua-dua skala genom berpecah dan lengkap [27, 28]. Kajian ini mengenal pasti set gen aksesori yang besar (~40% daripada semua gen) untuk spesies ini. Di samping itu, ini dikaitkan dengan kehadiran/ketiadaan yang meluas dan polimorfisme struktur kromosom, juga membabitkan unsur berulang dinamik (termasuk unsur transposable). Analisis lanjut juga mencadangkan bahawa banyak gen aksesori juga lebih rendah dinyatakan (secara purata) daripada gen teras. Kajian-kajian ini mewakili "standard emas" untuk struktur pangenome spesies Z. tritici dan paling komprehensif setakat ini untuk sebarang kulat berfilamen. Walau bagaimanapun, persoalan kekal untuk ini, dan spesies lain, sejauh mana pangenomik boleh digunakan untuk mengenal pasti gen dan proses virulensi teras. Dan dalam set gen teras, sama ada tahap polimorfisme seluruh populasi yang mempengaruhi perubahan asid amino, serta tahap ekspresi gen, mengkhianati identiti gen virulensi patogen utama?
Dalam kajian ini, kami telah menggabungkan penjujukan genom dan pendekatan transkriptik berasaskan RNAseq untuk menghasilkan pangenome daripada koleksi Eropah baru-baru ini bagi pencilan Z. tritici. Objektif utama kami adalah untuk menguji sama ada gen hadir dalam protein pengekodan genom teras dengan kadar polimorfisme asid amino yang rendah (iaitu dalam urutan pengekodan) antara pencilan, membawa fungsi penting, termasuk peranan utama dalam proses jangkitan teras pada gandum. Dalam persetujuan dengan kajian terdahulu [27, 28], kami menunjukkan bahawa Z. tritici mempunyai genom aksesori yang sangat besar (~ 45% daripada semua gen) yang menyokong statusnya yang berkembang pesat. Tambahan pula, kami menyediakan data biologi yang jelas menyokong kegunaan gabungan penggunaan kedua-dua kaedah omics untuk mengenal pasti gen virulensi teras baru. Sebaliknya, skrin overexpression protein berfungsi melalui pengantaraan virus tinggi gagal untuk mengenal pasti mana-mana calon efectors nekrotropik yang bertanggungjawab untuk menimbulkan lesi penyakit dalam daun gandum, sama ada daripada teras atau pangenome aksesori.
sistem imun yang meningkatkan tumbuhan cistanche
Keputusan
Skrin virulensi pada koleksi Z. tritici Eropah mengenal pasti strain yang sama agresif dari lokasi yang tidak dipaut secara geografi
Kami menguji 43 Z. tritici pencilan untuk virulensi pada 21 kultivar gandum roti Eropah yang mudah terdedah untuk memberikan sejumlah 2709 titik data (termasuk tiga ulangan). Maklumat asing (kod dan negara asal) dibentangkan dalam Fail tambahan 1: Jadual S1. Setiap interaksi dinilai secara kuantitatif untuk parameter berikut: (1) panjang tempoh inkubasi, (2) masa yang diambil untuk mencapai nekrosis lengkap (apabila ia berlaku), dan (3) tahap sporulasi aseksual (Rajah 1A). Berdasarkan kedua-dua pemarkahan penyakit pengiraan dan visual (lihat Kaedah dan Fail Tambahan 2: Rajah S1), semua pencilan kemudiannya dikumpulkan berdasarkan profil virulensi mereka pada panel kultivar yang diuji (Rajah 1B). Pengasingan kawalan positif IPO323, yang berfungsi sebagai rujukan global [26] dengan genom terjujukan sepenuhnya, adalah kurang agresif berbanding majoriti pencilan yang diuji terhadap hampir semua kultivar. Pengasingan ini dikumpul pada ~1984 dan telah disimpan dalam simpanan sejak itu, dengan sekali-sekala melalui daun gandum; oleh itu, pada masa ini tidak jelas sama ada pemerhatian ini boleh (sekurang-kurangnya sebahagiannya) telah timbul daripada penyimpanan sampel dari semasa ke semasa. Kami mengenal pasti tujuh pencilan yang tidak dapat menghasilkan gejala penyakit pada mana-mana kultivar gandum (Rajah 1B). Memandangkan semua pencilan ini berasal dari Sepanyol atau Itali, di mana gandum tetraploid (durum/pasta) (Triticum durum L.) lebih kerap ditanam, kemungkinan pencilan ini adalah khusus gandum durum [40, 41]. Secara ketara, pencilan dengan profil virulensi yang serupa tidak berkumpul di lokasi pengumpulannya, dengan pencilan yang berasal dari timur sejauh Slovakia hingga ke barat sejauh Ireland semuanya berkumpul bersama (Rajah 1B). Pemerhatian ini bersetuju dengan tahap variasi genetik yang tinggi yang wujud antara pencilan dan kajian terdahulu yang telah menunjukkan ini adalah sama tinggi pada skala lesi daun gandum tunggal, seperti di seluruh benua [42]. Kebanyakan pencilan yang lebih agresif dengan profil virulensi yang berbeza kemudiannya dipilih untuk penjujukan genomik (diserlahkan dengan "#" dalam Rajah 1B) dan analisis RNAseq (diserlahkan dengan "+" dalam Rajah 1B).
Rajah 1 Penilaian virulensi koleksi terpencil Eropah terhadap pelbagai kultivar gandum heksaploid (roti). Kursus masa perkembangan penyakit biasa yang menggambarkan parameter yang dinilai dalam skrin, termasuk masa yang diambil untuk kemunculan gejala pertama yang kelihatan dan nekrosis daun penuh muncul di kawasan yang disuntik. Rajah menunjukkan jangkitan kultivar gandum Riband oleh Z. tritici mengasingkan IPO323. B Profil virulensi pencilan vs panel kultivar berdasarkan tahap nekrosis daun dan klorosis. Pengukuran telah diambil oleh kedua-dua penilaian visual dan dengan menggunakan perisian analisis imej LemnaTec dan LemnaGrid dengan hasil akhir yang setanding. Pengasingan disusun dan dikelompokkan berdasarkan data virulensi. Pengasingan Z. tritici yang diserlahkan oleh # adalah urutan genom untuk membina pangenome. Pengasingan yang diserlahkan oleh + juga dianalisis oleh transkriptomi RNAseq. Panorama kultivar gandum (diserlahkan oleh X) telah ditentukan untuk sama rata dan terdedah sepenuhnya kepada kebanyakan pencilan dan dipilih sebagai genotip perumah untuk jangkitan daun RNAseq. Perhatikan data virulensi yang rendah untuk kumpulan luar tujuh pencilan terhadap semua kultivar mungkin terhasil daripada pencilan ini disesuaikan untuk menyebabkan penyakit pada gandum tetraploid (Durum atau Pasta). Semua data mewakili tiga daun yang dijangkiti yang dianalisis/diinteraksikan daripada dua eksperimen replika biologi (6 daun secara keseluruhan). C SplitsTree analisis filogeni molekul pencilan yang dipilih untuk penjujukan genomik. Negara asal pencilan ditunjukkan dalam singkatan (Pl=Poland; GB=Great Britain; Be=Belgium; Cz=Czech Republic; Ge {{8 }} Jerman; Sw=Sweden; Fr=Perancis; Sl=Slovakia; Ir=Ireland). Pengasingan rujukan, IPO323 yang dikumpul ~1984 dari Belanda (Ne) juga diwakili
Jujukan genom dan analisis filogenetik pada tujuh belas pencilan Eropah mendedahkan tahap kepelbagaian genetik yang tinggi
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% dalam semua kes menunjukkan pemasangan ruang gen yang baik (kawasan pengekodan) untuk semua pencilan. Beberapa gen BUSCO terpilih telah hilang daripada semua perhimpunan yang menunjukkan bahawa Z. tritici mungkin tidak mempunyai ortolog gen ini. Untuk menentukan jumlah variasi genetik yang mempengaruhi kawasan pengekodan yang diramalkan, kami kemudian menjalankan analisis SNPEf untuk setiap strain terhadap pangenom yang dibina di atas genom lengkap pengasingan rujukan IPO323 (Jadual 2). Analisis ini menunjukkan bahawa setiap strain baharu mempunyai lebih daripada 160,000 SNP terhadap pangenome yang diperolehi. Antaranya ialah lebih daripada 65,000 yang sama ada menyebabkan potensi kehilangan fungsi protein (kesan tinggi, anjakan bingkai, kehilangan permulaan, kodon henti pramatang) atau menyebabkan perubahan asid amino dalam protein yang diramalkan (Sederhana). Data ini menunjukkan kepelbagaian genetik yang wujud antara pengasingan Z. tritici.
Analisis pokok pecahan telah dilakukan pada 17 strain yang baru dijujukan dan IPO323 untuk menentukan sama ada pencilan dengan corak jangkitan kultivar yang serupa mempunyai sebarang hubungan filogenetik dan sama ada ini dikaitkan dengan negara asal. Filogeni ditentukan menggunakan gabungan enam urutan pengekodan dan bukan pengekodan (lihat Kaedah dan Fail Tambahan 3: Data S1). Pokok (Rajah 1C) menggambarkan sekali lagi bahawa tiada kaitan yang jelas antara profil virulensi dan lokasi pensampelan untuk pencilan yang dijujukan, dengan profil virulensi yang berkait rapat (berbanding dengan Rajah 1B) dilihat untuk pencilan yang dikumpul dari negara Eropah yang berbeza yang bagaimanapun filogenetik berkait rapat.
Pembinaan dan analisis Pangenome meramalkan 9807 gen "teras" dan 8083 "aksesori"
Sebagai tambahan kepada jujukan genom, kami memilih 12 pencilan untuk pemprofilan transkripsi berasaskan RNAseq (ditunjukkan oleh + dalam Rajah 1B). Setiap pengasingan diprofilkan dalam tiga kali ganda semasa pertumbuhan axenic dalam sup YPD dan juga pada dua peringkat bebas jangkitan daun; 6 hari selepas inokulasi (dpi) mewakili fasa pertengahan tanpa gejala dan 9 dpi, pada fasa peralihan perkembangan gejala awal. Panorama kultivar gandum yang mudah terdedah secara universal digunakan untuk ujian jangkitan, yang semua pencilan dapat menjangkiti sepenuhnya dengan kinetik yang tidak dapat dibezakan. Menggunakan data transkrip ini digabungkan dengan himpunan genom baharu, dan jujukan rujukan asal IPO323 sebagai perancah, kami menentukan pangenome untuk isolat Eropah yang turut menggabungkan jujukan yang terdapat dalam isolat lain yang tidak dikesan dalam IPO323. Langkah-langkah dalam pembinaan pangenome dan kriteria kami untuk mengkategorikan gen sebagai "teras" atau "aksesori" ditunjukkan dalam Rajah 2. Yang penting, ketidakaktifan (kesan tinggi, kehilangan fungsi-LoF) polimorfisme jujukan, dan kehadiran dan ketiadaan, pertimbangan juga disokong oleh bukti ekspresi gen. Oleh itu gen harus hadir dalam bentuk berfungsi dan dinyatakan oleh semua pencilan, untuk diberikan kepada kategori "teras". Pendekatan keseluruhan kami (Rajah 2) mentakrifkan jumlah pangenome sebanyak 17,890 gen termasuk 2017 yang tidak terdapat dalam IPO323. Langkah penapisan seterusnya mengkategorikan 9807 untuk berada dalam genom teras, dengan hanya nombor yang lebih kecil, 8083, dalam set aksesori. Yang terakhir mewakili ~45% daripada jumlah pangenome, sedikit peningkatan pada yang diterangkan sebelum ini [28]. Walaupun angka-angka ini umumnya bersetuju dengan baik, anggaran gen aksesori lebih subjektif kepada berat sebelah disebabkan kaedah yang digunakan (Panseq, dll), dan kami tidak boleh menganggap bahawa analisis masa depan tambahan mungkin tidak mengurangkan nombor gen aksesori menggunakan, sebagai contoh, berasaskan ortologi. pendekatan. Semua pangenes dianalisis untuk pelbagai ciri (ramalan rembesan, persatuan membran, penyetempatan, dan kandungan sistein) dan fungsi yang diramalkan (anotasi BLAST, GO, dan Interpro). Jadual yang menyediakan semua maklumat yang tersedia tentang semua gen disediakan (Fail tambahan 4: Jadual S2). Jadual juga memaparkan purata tahap ekspresi gen terbitan RNAseq relatif yang ditentukan untuk semua gen untuk semua 12 pencilan di bawah tiga keadaan yang diuji. Secara kolektif, apabila juga dibandingkan dengan kajian pan-genomik sebelumnya ke atas organisma ini [27, 28], adalah jelas bahawa Z. tritici mempunyai salah satu bilangan terbesar komponen genetik aksesori kulat yang dikaji setakat ini, yang mungkin mencerminkan perkembangan pesatnya. alam semula jadi.
Jadual 1 Analisis BUSCO tentang genom baharu
Jadual 2 Ringkasan impak kesan SNP untuk setiap genom baharu berbanding model gen rujukan IPO323
Rajah 2 Ringkasan langkah yang digunakan untuk menjana panggilan dan nombor gen "teras" dan "aksesori" untuk Z. tritici pangenome Eropah yang baru dibina. Nombor tersebut mewakili bilangan gen yang dikenal pasti pada setiap peringkat dalam perancangan
Ciri-ciri struktur variasi dalam Z. tritici pangenome Eropah
Matlamat kajian ini adalah untuk menguji hipotesis bahawa pangenomics boleh dieksploitasi untuk mengenal pasti gen baharu yang penting, sama ada penting untuk kehidupan atau untuk virulensi dalam organisma patogen. Kami membuat hipotesis bahawa ini akan menjadi gen yang hadir dan berfungsi dalam, dan dinyatakan oleh, setiap strain patogen. Kami selanjutnya membuat spekulasi bahawa gen ini akan mempunyai tahap mutasi SNP kesan tinggi dan sederhana yang lebih rendah yang mempengaruhi urutan pengekodan (kurang polimorfik) dan bahawa mereka mungkin berkumpul di kawasan pada kromosom tertentu.
Kami menggunakan data variasi SNP (tinggi, sederhana dan pengubah-lihat Fail tambahan 4: Jadual S2), serta data ekspresi min untuk semua gen, untuk menyiasat tahap purata polimorfisme pengekodan dan ekspresi berdasarkan kromosom, menggunakan 21 kromosom. IPO323 sebagai perancah. SNP pengubah suai mewakili perubahan nukleotida yang tidak menyebabkan perubahan asid amino. Rajah 3A menunjukkan bahawa tidak wujud kecenderungan tertentu untuk kekerapan mutasi apabila SNP tinggi, sederhana dan pengubah terkumpul dinyatakan sebagai ciri purata panjang protein bagi setiap kromosom keseluruhan. Walau bagaimanapun, apabila mutasi pengubah suai, iaitu yang tidak menyebabkan perubahan asid amino, telah ditinggalkan, adalah jelas bahawa 8 kromosom terkecil mempunyai gen dengan bilangan mutasi SNP tinggi dan sederhana yang lebih tinggi (Rajah 3B). Kesan ini lebih ditekankan apabila hanya SNP kesan tinggi dianalisis (Rajah 3C). Berbeza dengan tahap yang jelas pada kromosom teras 1–13 (~20%), sehingga 90% daripada gen yang berada pada lapan kromosom 14–21 terkecil tertakluk kepada kesan yang tinggi, kemungkinan mutasi kehilangan fungsi dalam sekurang-kurangnya satu. mengasingkan (Gamb. 3C). Data transkripsi kumulatif daripada kesemua 12 pencilan baharu juga menunjukkan ekspresi purata gen yang agak rendah pada kromosom 14–21 (Rajah 3D), seperti yang telah diperhatikan sebelum ini untuk IPO323 [32, 43, 44]. Diambil bersama, data ini menunjukkan petak genomik yang jelas, dengan lapan kromosom aksesori terkecil mempunyai jujukan yang sangat polimorfik, aksesori, dan secara umumnya kurang dinyatakan.
Membandingkan semua gen sama ada dalam teras atau genom aksesori mendedahkan bahawa ~ 60% daripada semua gen dalam yang terakhir ditemui dalam sekurang-kurangnya satu strain dengan mutasi kesan tinggi (kehilangan fungsi (LoF)) dan 47% juga tidak hadir pada sekurang-kurangnya satu ketegangan (Fail tambahan 4: Jadual S2). Sama seperti analisis pada kromosom aksesori, gen aksesori individu juga dinyatakan dengan sangat lemah secara keseluruhan merentas pencilan yang diuji (Fail tambahan 4: Jadual S2) dan mempunyai bilangan jujukan yang jauh lebih tinggi dengan fungsi yang tidak diketahui (lebih kurang 80%). Pemerhatian ini membandingkan dengan baik dengan kajian genomik pan sebelumnya yang dilakukan pada koleksi global Z. tritici yang dikumpul beberapa dekad selain [27, 28].
Kami juga melakukan analisis kehadiran dan variasi ketiadaan gen-demi-gen (PAV) untuk semua gen yang diramalkan dalam pengasingan rujukan IPO323, untuk 17 pencilan berjujukan yang lain. Data kehadiran/ketiadaan ini diplot secara kedudukan untuk setiap gen merentasi setiap 21 kromosom yang terdapat dalam IPO323. Rajah 3E dan F menunjukkan data daripada kromosom teras wakil (1 dan 7), manakala Rajah 3G dan H menunjukkan data untuk kromosom aksesori wakil (13 dan 14). Data untuk baki kromosom ditunjukkan dalam Fail tambahan 2: Rajah S2. Analisis ini mengenal pasti banyak gen yang terdapat dalam IPO323 yang hilang dalam beberapa pencilan yang dijujukan semula dan dengan jelas menunjukkan perbezaan dalam keseluruhan kehadiran/ketiadaan gen antara kromosom "teras" IPO323 (yang terdapat dalam setiap strain Z. tritici) berbanding dengan 8 kromosom "aksesori" terkecil. Data ini juga menyerlahkan rantau pada kromosom 7 khususnya, antara 1.7 Mb dan 2.5 Mb, yang memaparkan frekuensi tinggi ketiadaan gen dalam pencilan baharu (Rajah 3F). Menariknya, rantau ini sepadan dengan lokasi genom yang sebelum ini dilihat mempunyai ekspresi gen minimum atau tiada dalam IPO323 sama ada semasa pertumbuhan dalam budaya atau semasa mana-mana fasa jangkitan tumbuhan [32, 43]. Rantau ini juga sepadan dengan penghapusan kromosom, yang diperhatikan dalam pengasingan Yaman dalam kajian pangenome sebelumnya [28]. Bersama-sama, data ini mengukuhkan tanggapan bahawa Z. tritici mewakili organisma yang berkembang pesat dengan tahap tinggi, dan jenis yang berbeza, kepelbagaian genetik dan genomik dalam populasinya.
Ramalan penyetempatan protein mendedahkan gen dalam pangenome aksesori yang mungkin berfungsi dalam penyesuaian kepada persekitaran yang berubah-ubah
Ramalan penyetempatan protein WolfPsort dijalankan pada semua protein yang dikodkan oleh pangenome. Kami kemudiannya mengira peratusan relatif protein yang diramalkan untuk disetempatkan ke setiap kawasan sub-selular sebagai ciri jumlah bilangan protein untuk teras atau pangenome aksesori (Rajah 4). Beberapa kategori penyetempatan telah diperkayakan dalam genom teras termasuk "sitoplasma", "ekstraselular" dan "membran plasma", yang terakhir mengandungi banyak fungsi pengangkutan utama (Rajah 4). Sebaliknya, lokasi "nukleus" dan "mitokondria" dikaitkan dengan peratusan gen yang lebih tinggi dalam genom aksesori (Rajah 4). Genom aksesori telah diperkaya untuk domain pengikat zink tertentu yang mungkin menyediakan fleksibiliti transkripsi. Pengayaan kategori ini juga dilaporkan dalam kajian pangenome sebelumnya yang menekankan bahawa saluran paip keseluruhan kami menghasilkan hasil yang setanding [27, 28]. Pengayaan "mitokondria" adalah menarik kerana terdapat pseudogenes dan paralog protein mitokondria bonafide yang disasarkan oleh kimia antikulat. Satu contoh yang jelas dalam pangenome aksesori ialah paralog subunit suksinat dehidrogenase C (SDHC3) yang telah ditunjukkan sebagai pengantara rintangan berdiri terhadap subkelas racun kulat SDHI (succinate dehydrogenase inhibitor) dalam Z. tritici [45]. Kami mengenal pasti urutan lengkap gen ini hanya dalam tiga daripada tujuh belas pencilan berjujukan, dan kami mengesan tahap ekspresi gen yang tinggi dalam hanya satu daripada 12 yang kemudiannya dikaji oleh RNAseq (Rajah 5B). Walau bagaimanapun, kajian terdahulu, dan analisis semasa kami, menekankan bahawa memang terdapat fungsi penting dalam genom aksesori tetapi ini mungkin lebih penting untuk penyesuaian kepada persekitaran yang berubah-ubah daripada gaya hidup teras.
Rajah 3 Ciri struktur Pangenome dan polimorfisme kehadiran/ketiadaan merentas 21 kromosom rujukan mengasingkan IPO323. Jumlah bilangan mutasi SNP terkumpul yang memberikan perubahan impak pengubah, sederhana (M) dan tinggi (H-hilang fungsi-LoF) dinyatakan sebagai ciri purata panjang protein (aa) setiap kromosom. B Jumlah bilangan mutasi SNP terkumpul yang memberikan perubahan impak sederhana dan tinggi yang dinyatakan sebagai ciri purata panjang protein bagi setiap kromosom. C Jumlah bilangan mutasi SNP terkumpul yang memberikan perubahan kesan tinggi dinyatakan sebagai ciri purata panjang protein bagi setiap kromosom. D Purata ekspresi semua gen yang terdapat pada setiap 21 kromosom merentas semua pencilan. E Polimorfisme kehadiran dan ketiadaan (PaV) gen yang diramalkan pada kromosom teras 1 bagi IPO323 terpencil dalam 17 pencilan yang baru dijujukan. F PaV untuk gen pada kromosom teras 7. G PaV untuk gen pada kromosom aksesori 15. G–F PaV untuk gen pada kromosom aksesori 15. Data menyerlahkan variasi serantau yang meluas dan menandakan perbezaan yang jelas antara tahap polimorfisme jujukan keseluruhan dan kehadiran/ ketiadaan jelas pada kromosom teras dan aksesori
Rajah 4 Penyetempatan yang diramalkan bagi protein yang dikodkan oleh gen teras dan aksesori. Ringkasan peratusan ramalan penyetempatan protein yang ditentukan oleh WolfPsort untuk kategori yang ditunjukkan secara relatif kepada jumlah protein yang terdapat dalam teras dan pangenome aksesori
Protein efektor dalam genom aksesori memaparkan lebih banyak kebolehubahan antara terikan dalam ekspresi daripada dalam teras
Lebih lapan peratus daripada gen dalam genom teras mengekodkan protein rembesan putatif, jumlah yang lebih tinggi daripada itu untuk genom aksesori (~5%). Walau bagaimanapun, gen dalam pengekodan genom aksesori protein yang dirembeskan lebih kerap mempunyai fungsi yang tidak diketahui, tidak mempunyai domain yang boleh dikenali atau kawasan pemangkin. Protein yang tidak diketahui fungsi ini berjumlah ~75% daripada jumlah rembesan aksesori berbanding 42% untuk rembesan teras. Kebanyakan calon (dan dalam beberapa kes disahkan) efectors yang terdapat dalam genom teras dinyatakan dalam corak yang sama, dan ke tahap yang setanding, dalam semua dua belas isolat yang dianalisis oleh RNASeq. Sebagai contoh, tiga efectors yang mengandungi domain LysM (Lysin), 3LysM, 1LysM dan xLysM, telah dinyatakan kepada tahap yang hampir sama, dan dalam corak yang sama, oleh setiap strain (Rajah 5C–E). Efektor Te 3LysM kekal sebagai satu-satunya penentu virulensi yang dirembeskan utama Z. tritici, di mana protein ini berfungsi untuk menyekat imuniti tumbuhan yang dicetuskan oleh kitin semasa jangkitan awal [46, 47]. Walau bagaimanapun, ketiga-tiga efector LysM diketahui bekerjasama untuk tujuan ini [48]. Oleh itu, perlu diperhatikan bahawa terdapat sedikit variasi ekspresi untuk gen ini antara pencilan, menguatkuasakan semula cadangan bahawa penindasan pertahanan ini adalah komponen teras jangkitan. Sebaliknya, pengesan calon yang terdapat dalam genom aksesori memaparkan kedua-dua variasi kehadiran dan ketiadaan dan ungkapan yang sangat berubah-ubah antara pencilan (Rajah 5F–H). Sebagai contoh, AvrStb6, pengesan avirulensi pertama yang dikenal pasti dalam Z. tritici, [49, 50] memaparkan variasi ekspresi yang banyak (Rajah 5F), walaupun terdapat dalam semua pencilan. Pembolehubah jujukan ini, protein kecil yang dirembeskan, diiktiraf oleh kultivar gandum yang mengandungi alel berfungsi kinase seperti reseptor Stb6 [25, 51]. Pengiktirafan ini memberikan ketahanan penyakit terhadap semua pencilan yang mempunyai alel tertentu bagi effector ini. Terdapat variasi ekspresi AvrStb6 yang ketara antara pencilan dan kami mengenal pasti satu pencilan (Zt118) di mana kami gagal mengesan sebarang ungkapan sama sekali, dalam mana-mana tiga keadaan yang diuji. Atas sebab ini, dalam saluran paip ramalan kami, AvrStb6 diklasifikasikan ke dalam genom aksesori. Banyak pengesan calon lain bagi fungsi yang tidak diketahui pada masa ini menunjukkan kehadiran/ketiadaan dan/atau variasi ekspresi yang ketara dalam genom aksesori (Rajah 5G dan H).
Rajah 5 Variasi ekspresi gen dalam pangenome teras dan aksesori dan penubuhan sistem overexpression virus sementara yang digunakan untuk skrin efektor nekrotropik. Kunci untuk mentafsir data ditunjukkan dalam angka. B Kehadiran/ketiadaan dan variasi ekspresi gen untuk paralog subunit C Succinate dehydrogenase yang terdapat dalam genom aksesori. Profil Ekspresi C–E bagi ZtLysM efectors, 3LysM, 1LysM dan xLysM, semuanya terdapat dalam pangenome teras. F Ungkapan prof avirulence effector AvrStb6. Kekurangan sebarang ungkapan dalam isolate 118 mengklasifikasikan effector ke dalam pangenome aksesori. G dan H Mewakili contoh efektor calon tambahan dalam pangenome aksesori.
Skrin berfungsi tidak memberikan bukti untuk aktiviti efektor nekrotropik sama ada dalam teras atau pangenome aksesori
Kami mengguna pakai sistem ekspresi sementara protein pengantara vektor virus yang baru dibangunkan untuk gandum (dan tanaman bijirin dan bukan bijirin lain), menggunakan virus Foxtail Mosaic (FoMV), untuk melaksanakan skrin daya pemprosesan sederhana hingga tinggi bagi calon Z. tritici efectors daripada pangenome. Kami secara khusus bertujuan untuk menguji sama ada ada yang mempunyai keupayaan untuk mendorong nekrosis pada panel kecil kultivar gandum, yang mungkin membayangkan fungsi mereka pada peralihan kepada gejala penyakit sebagai "pengefektor nekrotropik" [36, 52]. Untuk kajian ini, kami membuat beberapa pengubahsuaian kepada sistem yang diterbitkan sebelum ini [53]. Untuk memacu rembesan protein ekstraselular dalam gandum, kami menggunakan urutan peptida isyarat protein 1 (TaPR1) yang berkaitan dengan patogenesis gandum, dioptimumkan kodon kepada Arabidopsis thaliana, yang kemudiannya disatukan dalam bingkai dengan setiap jujukan pengesan kulat calon oleh sintesis gen (Rajah 1). 5I). Keberkesanan peptida isyarat TaPR1 untuk merembeskan protein ekstraselular Z. tritici yang berfungsi telah ditubuhkan oleh keupayaannya untuk mendorong nekrosis daun dalam tembakau apabila diletakkan di hadapan nekrosis Z. tritici dan protein seperti inducing etilena (ZtNLP), yang berfungsi sahaja apabila disasarkan untuk rembesan ekstraselular (Rajah 5 Jl) [54]. Kami kemudian mengesahkan bahawa vektor boleh mengekspresikan protein secara sama rata merentas pelbagai kultivar gandum dengan menggambarkan ekspresi tempatan dan sistemik protein pendarfluor hijau (GFP) di seluruh daun kultivar gandum yang berbeza (Fail tambahan 2: Rajah S3). Akhirnya, kami kemudiannya menguji keupayaan efektor nekrotropik yang dicirikan dengan baik SnToxA, daripada patogen gandum yang berkaitan Parastagonospora nodorum, untuk mendorong nekrosis dalam daun gandum genotip yang mempunyai gen sensitiviti Tsn1 [55]. Seperti yang dijangkakan, ekspresi berlebihan SnToxA yang dimediasi oleh FoMV, dengan peptida isyarat TaPR1, menyebabkan nekrosis hanya pada kultivar gandum yang mempunyai Tsn1 (cv Halberd dalam Rajah 5K) tanpa gejala yang diperhatikan pada kultivar yang tidak mempunyai gen kerentanan ini (cv Riband dalam Rajah 5K). ). Data tese mengesahkan bahawa sistem ekspresi berlebihan pengantara vektor virus adalah sesuai untuk saringan skala yang lebih besar bagi pengesan Z. tritici calon untuk mengenal pasti mana-mana yang mempunyai aktiviti efektor nekrotropik. Sebanyak 88 calon telah dipilih dan disaring terhadap lima kultivar gandum (Fail tambahan 5: Jadual S3). Ini merangkumi 66 protein yang berada dalam pangenome teras dan 22 daripada aksesori. Gen yang dipilih (Fail tambahan 5: Jadual S3) terdiri daripada gen teras tanpa polimorfisme khusus terikan (monomorfik) dan ekspresi planta yang tinggi, kepada gen dalam genom aksesori yang mempamerkan kehadiran/ketiadaan dan/atau polimorfisme ekspresi substansial. Dalam semua eksperimen, kawalan teknikal ToxA vs cv Halberd dan cv Riband selari telah dijalankan, dan ini sentiasa menghasilkan keputusan yang dijangkakan. Sebaliknya, tiada satu pun daripada 88 protein teruji Z. tritici yang diuji berlebihan menyebabkan sebarang nekrosis daun pada mana-mana kultivar gandum. Ringkasnya, keputusan ini tidak memberikan sebarang bukti untuk efectors necrotrophic, dan oleh itu, tiada sokongan untuk mana-mana calon yang diuji dalam mendorong peralihan kepada pertumbuhan necrotrophic semasa jangkitan.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun
Gen teras yang mengekod protein dengan yang ditunjukkan, atau diramalkan, penting-untuk-hidup atau fungsi virulensi utama mempunyai tahap keseluruhan polimorfisme asid amino yang lebih rendah
Kami melakukan carian literatur untuk mengenal pasti semua gen Z. tritici yang telah tertakluk kepada pencirian fungsi, sama ada dalam virulensi atau sebagai gen penting yang bertarikh sehingga 2018. Ini menghasilkan senarai 28 jujukan protein (Fail tambahan 6: Jadual S4). Begitu juga, kami mengenal pasti senarai 26 protein yang juga telah dicirikan secara fungsional tetapi telah ditunjukkan tidak memainkan peranan utama dalam virulensi atau penting (Fail tambahan 6: Jadual S4). Kami kemudian menyiasat tahap mutasi tinggi dan sederhana berlebihan kumulatif dalam gen ini dan menyatakan nilainya sebagai ciri setiap panjang protein dan kemudian menentukan nilai purata untuk set. Rajah 6 menyerlahkan bahawa gen yang diterbitkan yang mempengaruhi virulensi mempunyai kekerapan mutasi (p=0} yang ketara secara statistik (p=0.007) (polimorfisme) berbanding gen yang telah terbukti tidak berfungsi secara berlebihan.
Kajian yang bertujuan untuk menentukan gen penting untuk kehidupan (penting) dalam kulat berfilamen (tidak termasuk yis) adalah sedikit, dan sehingga kini, hanya satu wakil wujud dalam pangkalan data gen penting (DEG), iaitu daripada patogen manusia oportunis Aspergillus fumigatus [56–58]. Kami mengenal pasti ortolog Z. tritici bagi kesemua 28 gen yang ditunjukkan secara eksperimen adalah penting untuk kehidupan dalam A. fumigatus dan sekali lagi mengira kadar mutasi relatif setiap relatif kepada panjang jujukan (Fail tambahan 7 Jadual S5). Sekali lagi, kami mendapati pengurangan ketara secara statistik yang jelas (p=0.0148) dalam kekerapan mutasi SNP tinggi dan sederhana dalam gen penting calon ini, kemudian diperhatikan untuk gen yang ditunjukkan tidak penting untuk sama ada virulensi atau kehidupan ( Rajah 6). Sebaliknya, tiada perbezaan yang ketara (p=0.2128) antara kadar mutasi untuk gen virulens yang disahkan secara eksperimen dan gen penting yang diramalkan (Rajah 6). Data ujian bersama-sama menyokong konsep bahawa tahap polimorfisme asid amino dalam populasi boleh digunakan untuk meramalkan kepentingan relatif gen untuk gaya hidup teras organisma.
Rajah 6 Analisis set gen teras patogenikiti yang disahkan secara eksperimen dan/atau gen penting untuk kehidupan yang diramalkan mendedahkan kadar mutasi yang lebih rendah daripada yang dilihat dalam gen tidak penting. Purata kadar mutasi tinggi dan sederhana (H/M) dinyatakan sebagai ciri panjang protein (aa) untuk menyenaraikan gen pengekodan protein yang telah; 1- secara eksperimen bertekad untuk tidak memainkan peranan (atau sangat kecil) dalam virulensi kulat; 2-bertekad secara eksperimen untuk memainkan peranan penting dalam virulensi dan; 3-diramalkan untuk mengekodkan gen penting-untuk-hidup yang diduga melalui ortologi kepada protein yang dicirikan secara eksperimen dalam Aspergillus fumigatus. Simbol asterisk (*) menunjukkan perbezaan yang signifikan secara statistik antara kadar mutasi antara set gen yang ditunjukkan. Senarai gen dan data polimorfisme yang berkaitan ditunjukkan dalam Fail tambahan 6: Jadual S4
Utiliti pendekatan ramalan gabungan untuk mendedahkan kelemahan patogen disokong melalui kajian pelengkap genetik pada lima mutan penghapusan gen "teras"
Z. tritici boleh memajukan skrin genetik berdasarkan penyepaduan rawak T-DNA melalui transformasi kulat (AMT) yang dimediasi Agrobacterium. Kerja kami sebelum ini telah menghasilkan satu mutan Z. tritici T-DNA khususnya yang tidak dapat menyebabkan penyakit penuh pada daun gandum yang dijangkiti (Rajah 7A). Mutan ini, yang dipanggil 23-21 (pusingan transformasi ke-23 dan koloni ke-21 dipetik), boleh tumbuh secara normal sebagai jenis liar pada medium agar yang kaya nutrien (YPD) tetapi gagal memanjangkan tahap hifa kulat yang setanding apabila ditanam pada medium kekurangan nutrien, termasuk agar air (Rajah 7A). Kami menggunakan penjujukan semula berasaskan Illumina keseluruhan genom 23-21 untuk mendedahkan kedudukan sisipan T-DNA yang berpotensi menjadi penyebab. Analisis ini mendedahkan integrasi T-DNA tunggal antara kedudukan 899878 dan 912699 pada kromosom 8, menyebabkan pemadaman/gangguan lima jujukan pengekodan yang diramalkan (Rajah 7B). Analisis SNP dan indel tidak mendedahkan mutasi tidak berteg tambahan dalam ketegangan 23-21 berbanding jujukan genom jenis liar IPO323. 23-21 Pemadaman T-DNA telah mengalih keluar lima gen secara berkesan, kesemuanya berada dalam genom teras dan dengan ramalan berfungsi (Interpro) berikut; gen 1=Cytochrome P450; gen 2=S-adenosyl methionine methyltransferase; gen 3=Zink (2) protein pengikat DNA jenis C6; gen 4=Nukleosida difosfat kinase (NDK) dan gen 5=Glikosil hidrolase 31 (Rajah 7B). Kami menyiasat bilangan relatif mutasi tinggi dan sederhana dalam setiap protein sebagai ciri panjang protein, yang mendedahkan bahawa protein 4 (NDK) mempunyai mutasi yang jauh lebih sedikit yang mempengaruhi perubahan jujukan asid amino daripada empat jujukan yang dianalisis yang lain merentasi set terpencil (Rajah 1). 7C dan Fail tambahan 2: Rajah S4). Kami kemudian menyiasat ungkapan relatif purata bagi semua lima gen merentasi semua isolat yang diuji. Ia juga mendedahkan bahawa gen 4 (pengekodan NDK) adalah jauh lebih tinggi dinyatakan daripada semua calon lain (Rajah 7D dan Fail Tambahan 2: Rajah S5). Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa kehilangan gen yang paling kurang polimorfik dan paling tinggi, gen 4, NDK, bertanggungjawab untuk kehilangan virulensi, dan kecacatan yang berkaitan dalam memanjangkan flamen hifa. Untuk menguji ini, kami menukar setiap satu daripada lima gen calon kembali secara individu kepada 23-21 strain mutan Z. tritici, setiap satu didorong oleh promoter endogennya sendiri. Berbilang transforman telah diperolehi daripada setiap satu dan diuji semula untuk virulensi pada daun gandum dan keupayaan untuk memanjangkan hifa berfilamen pada agar air. Ini menunjukkan bahawa pengenalan semula gen NDK sahaja (gen 4) memulihkan sepenuhnya kedua-dua virulensi dan pertumbuhan hifa kepada tahap jenis liar (Rajah 7E dan Fail Tambahan 2: Rajah S6). Pengenalan semula setiap empat calon lain tidak menyebabkan sebarang perubahan dalam fenotip daripada strain mutan asal 23-21 (Rajah 7E). Untuk memastikan semua gen yang diperkenalkan semula dinyatakan dalam ketegangan pelengkap masing-masing, RT-PCR dilakukan pada setiap transforman dan mutan 23-21 asal. Ini mengesahkan kekurangan yang dijangkakan bagi setiap transkrip dalam mutan 23-21 dan menunjukkan ekspresi yang betul bagi setiap gen sasaran dalam isolat yang dilengkapkan (Rajah 7F). Tus, pengenalan semula gen tunggal dengan polimorfisme peringkat populasi paling sedikit daripada lima calon, dan ekspresi relatif tertinggi, memulihkan fenotip yang rosak dalam patogen gandum ini. Pemerhatian eksperimen ini menyokong utiliti menggabungkan pangenomics dan transkriptomics untuk meramalkan gen yang berpotensi penting untuk ciri kehidupan berfungsi utama.
Rajah 7 Ujian pelengkap fungsi pada penghapusan lima gen bukan patogen Z. mutan tritici menyokong penggunaan gabungan kadar mutasi terbitan pangenome dan analisis tahap ekspresi sebagai peramal bagi gen gaya hidup teras yang penting. A Ciri-ciri pertumbuhan dan jangkitan mutan sisipan T-DNA rawak Z. tritici "23-21". Strain tumbuh secara normal pada agar kaya nutrien tetapi rosak dalam pertumbuhan berfilamen pada agar nutrien yang lemah dan terjejas teruk dalam aktiviti penyebab penyakit daun gandum. Bar skala mewakili 1 cm. B Penjujukan semula genom keseluruhan terikan 23-21 mendedahkan pemadaman pengantara T-DNA bagi rantau genom 13 kb yang mengganggu atau memadamkan lima gen yang diramalkan daripada pangenome teras. C Memaparkan purata peristiwa mutasi Tinggi dan Sederhana untuk setiap gen (berlabel 1-5) daripada pangenome relatif kepada panjang protein yang dikodkan (aa)
Perbincangan
Gabungan pangenomics dan transcriptomics boleh digunakan sebagai senjata melawan patogen yang berkembang pesat
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% daripada jumlah gen) genom aksesori daripada spesies ini. Mengapa dan bagaimana Z. tritici dan kulat patogen tumbuhan lain yang berpotensi mengekalkan komponen aksesori yang begitu besar adalah tidak jelas. Sebagai contoh, lapan kromosom terkecil yang dikenal pasti dalam IPO323 tidak mempunyai sebarang kesan besar yang jelas terhadap virulensi, atau mana-mana proses lain, dengan hanya satu kajian pada masa ini mencadangkan kromosom 14, 16, 18, 19, dan 21 sebagai memainkan peranan halus dalam virulensi pada kultivar gandum terpilih [59]. Namun begitu, gabungan kromosom kecil ini dikekalkan dalam populasi. Telah dicadangkan bahawa mereka menyediakan peristiwa penggabungan semula yang mungkin mendasari keupayaan kulat untuk berkembang pesat untuk menyesuaikan diri dengan tekanan persekitaran, yang berpotensi digabungkan dengan kadar aktiviti unsur transposable yang tinggi [60-62]. Kes yang sama boleh dipertikaikan untuk genom aksesori yang besar. Sokongan untuk ini disediakan oleh kepentingan fungsi dua komponen genom aksesori yang dirujuk dalam kajian ini, paralog subunit C SDH dan AvrStb6, yang kedua-duanya mempunyai peranan penting dalam berinteraksi dengan unsur pembolehubah persekitaran luaran (aplikasi racun kulat dan kultivar dengan padanan. gen rintangan penyakit, masing-masing) [25, 45]. Proses biologi lain telah diterangkan yang juga boleh hilang dalam pengasingan Z. tritici individu tanpa kecacatan kecergasan yang jelas termasuk kawalan melanisasi (pigmentasi) [63]. Kajian kami telah menyerlahkan bahawa aksesori, genom Z. tritici yang berkembang pesat berpotensi digunakan terhadapnya apabila tumpuan diletakkan pada perkara yang tidak boleh hilang atau mempunyai polimorfisme terhad. Kajian ini telah berusaha untuk melakukan ini, dengan mempertimbangkan gen teras sebagai bukan sahaja hadir dan berfungsi dalam semua pencilan tetapi juga dinyatakan oleh semua pencilan. Kami juga mengambil pendekatan untuk mencuba meletakkan set gen dalam genom teras, berdasarkan tahap kebolehubahan jujukan asid amino. Sudah tentu terdapat beberapa kaveat dengan kaedah yang telah kami gunakan, terutamanya dalam mutasi berlebihan (jenis dan kedudukan yang sama) tidak boleh dipisahkan dengan mudah daripada bilangan mutasi yang serupa yang mungkin berlaku pada kedudukan unik dalam setiap pencilan (mutasi tidak berlebihan). Oleh itu, kaedah kami tidak sesuai untuk menentukan kedudukan gen yang berkembang pesat. Namun begitu, kaedah tersebut membolehkan gen tanpa, dan kebolehubahan rendah, dikenal pasti dengan mudah berdasarkan kadar polimorfisme rendah yang mempengaruhi perubahan asid amino. Pendekatan ini menunjukkan bahawa gen penting untuk kehidupan atau gen virulensi yang disahkan dan diramalkan secara eksperimen mempunyai kurang polimorfisme jenis ini antara pencilan, berbanding gen yang fungsinya boleh diketepikan untuk proses ini. Akhir sekali, kami memperluaskan pendekatan ini untuk mengenal pasti fungsi virulensi baharu bagi kinase difosfat nukleosida (NDK), yang mempamerkan variasi paling sedikit bagi semua gen dalam 5-pemadaman gen T-DNA. Berdasarkan penemuan ini, kami mencadangkan bahawa tahap polimorfisme dalam gen teras yang dikenal pasti dalam pangenomics boleh digunakan untuk membuat kesimpulan fungsi penting untuk protein yang dikodkan dan dengan itu mengutamakan gen untuk analisis fungsi untuk mengenal pasti sasaran baharu untuk perlindungan tanaman dan kesihatan haiwan yang berpotensi.
Kelemahan yang muncul dalam biologi jangkitan Z. tritici dan patogen yang berkaitan?
Kajian ini juga memberikan pandangan khusus lanjut tentang biologi jangkitan patogen gandum yang penting ini. Pertama, tiada bukti diperolehi menyokong kehadiran aktiviti effector nekrotropik utama untuk 88 protein yang dirembeskan yang dipilih daripada kedua-dua genom teras dan aksesori. Kami tidak boleh membuang kemungkinan bahawa kami tidak memilih protein yang betul atau berbilang pengesan boleh bekerjasama untuk memanggil kematian sel tumbuhan (juga dicadangkan oleh profil ekspresi yang serupa). Jika yang kedua adalah kesnya, ini akan berbeza daripada kepentingan jelas pengesan necrotrophic tunggal dalam kulat yang menjangkiti gandum yang berkaitan, terutamanya spesies Parastagonospora nodorum dan Pyrenophora [35]. Terdapat juga kemungkinan bahawa tahap ekspresi yang kami peroleh daripada sistem FoMV sementara adalah lebih rendah daripada yang diperlukan untuk pengesan yang pengecamannya kurang jelas daripada SnToxA. Walau bagaimanapun, data yang dibentangkan di sini tidak memberikan sokongan untuk idea bahawa peralihan kepada pertumbuhan gejala, dan kematian sel tumbuhan ditimbulkan oleh pengiktirafan utama (tunggal) necrotrophic Z. tritici efectors. Oleh itu, adalah mungkin bahawa pengeluaran besar-besaran protein ini pada permulaan simptom sebaliknya boleh berfungsi untuk melindungi hifa kulat daripada hiperaktivasi ketara kematian sel dan tindak balas tumbuhan. Selaras dengan ini, efektor yang dirembeskan daripada kulat ini dan lain-lain telah terbukti mempunyai keupayaan untuk menghalang protease yang berasal dari tumbuhan, kitinase, dan enzim penyerang dinding sel lain yang sendiri diinduksi oleh tumbuhan semasa tindak balas pertahanan [46, 48, 64, 65]. ]. Baru-baru ini, pengesan kulat juga telah ditunjukkan untuk memanipulasi dan mengubah suai mikro dan mikrobiom [66, 67].
manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun
Pengenalpastian peranan utama dalam virulensi untuk NDK bagaimanapun penting. Protein ini telah dikaitkan dengan pelbagai fungsi daripada organisma prokariotik dan eukariotik yang berbeza. Dalam kulat, terdapat satu laporan yang mengaitkan peranan kepada modulasi imuniti tumbuhan [68], manakala, dalam spesies lain (A. fumigatus), fungsi penting untuk kehidupan telah ditunjukkan [69]. Walau bagaimanapun, fungsi utama dan terpelihara protein ini adalah untuk memfosforilasi nukleosida difosfat, biasanya menggunakan ATP sebagai substrat, untuk menghasilkan nukleosida trifosfat (NTP) lain yang diperlukan untuk membantu menjana pelbagai proses selular [70, 71]. Ini amat penting apabila sumber yang terhad menjadikan penjanaan NTP tertentu dengan cara lain lebih sukar. Tus, NDK membentangkan aktiviti laluan penyelamat utama untuk penjanaan semula NTP yang paling penting apabila sumber ekstraselular terhad. Peranan penting untuk beberapa laluan penyelamat lain, dan khususnya laluan biosintetik, baru-baru ini muncul daripada kajian fungsi gen lain pada Z. tritici. Sebagai contoh, biosintesis lisin adalah penting untuk jangkitan dan pertumbuhan hifa pada nutrien yang lemah [72], seperti biosintesis purin [73]. Fungsi ini adalah berlebihan untuk pertumbuhan pada media yang lengkap. Data transkrip sebelumnya pada peringkat awal kolonisasi permukaan daun telah menunjukkan bahawa kulat berada dalam persekitaran yang kekurangan nutrien dan bergantung pada penggunaan simpanan intraselular [33]. Diambil bersama dengan kajian fungsi sebelumnya, dan peranan utama ditunjukkan untuk NDK, adalah jelas bahawa Z. tritici sangat terdedah kepada perencatan laluan biosintetik dan penyelamat utama apabila berada di permukaan daun semasa penjajahan awal, dan berpotensi melalui induksi kematian sel tumbuhan kira-kira 7–10 hari kemudian. Oleh itu, produk atau strategi perlindungan tanaman baharu boleh diarahkan ke arah perencatan proses ini, yang mungkin mewakili kelemahan Z. tritici, dan berpotensi untuk pelbagai jenis kulat lain yang berkaitan dengan cara jangkitan yang serupa.
Kesimpulan
Kajian ini menyediakan sokongan awal untuk penggunaan gabungan pangenomics dan transkriptomics untuk menentukan gen yang mewakili teras, dan berpotensi untuk dieksploitasi, kelemahan dalam patogen yang berkembang pesat. Walau bagaimanapun, pada dasarnya, pendekatan boleh digunakan untuk keutamaan gen dalam mana-mana sistem biologi di mana pelbagai genom dan transkrip tersedia. Kami menjangkakan bahawa pendekatan ini boleh memajukan saluran paip penemuan proses biologi teras dalam banyak sistem biologi yang pelbagai.
Rujukan
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Kemunculan penentangan terhadap ubat antikulat di seluruh dunia mencabar kesihatan manusia dan keselamatan makanan. Sains. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. Ancaman kulat yang muncul kepada kesihatan haiwan, tumbuhan dan ekosistem. alam semula jadi. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. Evolusi rintangan racun kulat. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Pembiakan seksual dan evolusi patogen mikrob. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Genom dua kelajuan patogen berfilamen: waltz dengan tumbuhan. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. Analisis genom bagi pelbagai isolat patogenik Streptococcus aga-lactiae: implikasi untuk "pan-genom" mikrob. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. Evolusi teras dan pan-genom strep‑ kepada coccus: pemilihan positif, penggabungan semula, dan komposisi genom. Genome Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF, et al. Genomik perbandingan kacang soya bernodul rhizobia mencadangkan pengambilan gen khusus keturunan secara meluas dalam penyesuaian. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP, et al. Panparastagonospora analisis genom perbandingan-ramalan kesan dan evolusi genom. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/ gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Analisis pan-genom spesies kulat model. Mikrob. Genomik. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y, et al. Analisis pan-genom untuk mengenal pasti gen teras dan gen penting Brucella spp. Mol Gen Genomics. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G, et al. Analisis pan-genom Aspergillus‑ lus fumigatus mengenal pasti varian genetik yang dikaitkan dengan jangkitan manusia. Nat Microbiol. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et al. Penjujukan semula genom keseluruhan mendedahkan variasi semula jadi dan evolusi penyesuaian Phytophthora sojae. Mikrobiol hadapan. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: ancaman utama kepada pengeluaran gandum, pendekatan bersepadu untuk mengawal. Biol Genet Kulat. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Mengukur imigresen dan pembiakan seksual dalam populasi lapangan Mycosphaerella graminicola. Fito-patologi. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Taburan alel jenis mengawan dalam patogen gandum Mycosphaerella graminicola ke atas skala spatial daripada lesi ke benua. Biol Genet Kulat. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. Asal dan pembiakan patogen gandum kulat Mycosphaerella gramini‑ cola melalui spesiasi simpatrik. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Struktur populasi Mycosphaere‑ lla graminicola: daripada lesi ke benua. Fitopatologi. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. Asas genetik penyesuaian tempatan untuk kulat patogen dalam ekosistem pertanian. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Kesan titik panas penggabungan semula pada evolusi genom patogen tumbuhan kulat. Genetik. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Pengekalan variasi dalam virulensi dan pembiakan dalam populasi patogen tumbuhan pertanian. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Pertukaran gen interspesifik memperkenalkan kebolehubahan genetik yang tinggi dalam patogen tanaman. Genome Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Patogen gandum kulat mengembangkan pengkhususan perumah melalui penyusunan semula kromosom yang meluas. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Meiosis membawa kepada variasi nombor salinan yang berleluasa dan pewarisan herotan aksesori kromo‑ sebahagian daripada patogen gandum Zymoseptoria tritici. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. Perubahan terbaru yang luar biasa dalam kepelbagaian genetik gen avirulensi AvrStb6 dalam populasi global patogen gandum Zymoseptoria tritici. Pathol Tumbuhan Mol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Kren CF, Hane JK, et al. Genom siap patogen gandum kulat Mycosphaerella graminicola mendedahkan struktur dispens, keplastikan kromosom, dan patogenesis stealth. Genet PLoS. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. A 19-mengasingkan pangenome global berkualiti rujukan untuk patogen gandum kulat Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Analisis Pangenome bagi patogen gandum Zymoseptoria tritici mendedahkan asas struktur genom eukariotik yang sangat plastik. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. Meiosis memacu keplastikan genom yang luar biasa dalam patogen tumbuhan kulat haploid Mycosphaerella graminicola. PLoS One. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. Biologi sel Zymoseptoria tritici: organisasi sel patogen dan jangkitan gandum. Biol Genet Kulat. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Histologi patogenesis Mycosphaerella graminicola dalam gandum. Fitopatologi. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J, et al. Pemprofilan transkriptom dan metabolit bagi kitaran jangkitan Zymoseptoria tritici pada gandum mendedahkan interaksi dwifasa dengan imuniti tumbuhan yang melibatkan sumbangan kromosom patogen berbeza dan variasi pada definisi gaya hidup hemibiotropik. Fisiol Tumbuhan. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM, et al. Penyesuaian transkrip Mycosphaerella graminicola kepada kematian sel terprogram (PCD) perumah gandumnya yang mudah terdedah. Mol Tumbuhan-Mikrob Berinteraksi. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. Kinase protein yang diaktifkan mitogen gandum TaMPK3 dan TaMPK6 dikawal secara berbeza pada pelbagai peringkat semasa interaksi penyakit yang serasi dengan Mycosphaerella graminicola. Fisiol Tumbuhan. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Pencirian interaksi kesan-sasaran dalam pathosystem nekrotropik mendedahkan trend dan variasi dalam manipulasi perumah. Annu Rev Fitopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Toksin khusus hos: pengesan patogenik necrotrophic. Mikrobiol Sel. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A, et al. FPLC dan spektrometri jisim kromatografi cecair mengenal pasti calon protein yang mendorong nekrosis daripada penapisan kultur patogen gandum kulat Zymoseptoria tritici. Biol Genet Kulat. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Genom aksesori yang besar dan kadar penggabungan semula yang tinggi boleh mempengaruhi taburan global dan julat perumah yang luas bagi patogen tumbuhan kulat Claviceps purpurea. PLoS One. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, Lihat PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Pangenome global untuk patogen kulat gandum Pyrenophora triticirepentis dan ramalan homologi struktur protein effector. Mikrob. Genomik. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Variasi genetik untuk virulensi dan rintangan dalam sistem laluan gandum-Mycosphaerella graminicola II. Analisis interaksi antara pengasingan patogen dan kultivar perumah. Fitopatologi. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Variasi genetik untuk virulensi dan rintangan dalam gandum Mycosphaerella graminicola pathosystem I. interaksi antara isolat patogen dan kultivar perumah. Fitopatologi. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Struktur genetik global patogen gandum Mycosphaerella graminicola dicirikan oleh kepelbagaian nuklear yang tinggi, kepelbagaian mitokondria yang rendah, penggabungan semula biasa, dan aliran gen. Biol Genet Kulat. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ, et al. Analisis transkriptik perbandingan strain Zymoseptoria tritici menunjukkan peralihan gaya hidup yang kompleks dan kebolehubahan intraspesifik dalam profil transkripsi. Mol. Tumbuhan Pathol. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Pemprofilan ekspresi patogen gandum Zymoseptoria tritici mendedahkan corak genomik transkripsi dan program pengawalseliaan khusus hos. Genome Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D, et al. Paralog boleh dibuang subunit C suksinat dehidrogenase mengantara rintangan berdiri terhadap subkelas racun kulat SDHI dalam Zymosep‑ toria tritici. Pathog PLoS. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE, et al. Analisis dua homolog efektor LysM yang diekspresikan planta daripada kulat Mycosphaerella graminicola mendedahkan ciri-ciri fungsi baru dan sumbangan yang berbeza-beza kepada virulensi dalam gandum. Fisiol Tumbuhan. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola menyenaraikan patogenesis stealth yang dimediasi efektor menumbangkan pengiktirafan melalui homolog cerk1 dan cebip dalam gandum. Mol Tumbuhan-Mikrob Berinteraksi. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ, et al. Tiga efektor LysM Zymoseptoria tritici secara kolektif melucutkan senjata imuniti tumbuhan yang dicetuskan oleh kitin. Pathol Tumbuhan Mol. 2021;22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. Protein kecil yang dirembes dalam Zymoseptoria tritici bertanggungjawab untuk avirulensi pada kultivar gandum yang membawa gen rintangan Stb6. Phytol baru. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. Tekanan dan pembiakan seksual menjejaskan kedinamikan pengesan patogen haba AvrStb6 dan rintangan strobilurin. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. Protein seperti reseptor kinase gandum Stb6 mengawal rintangan gen-untuk-gen terhadap patogen kulat Zymoseptoria tritici. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. Efectors necrotrophic protein dalam virulensi kulat. Biol Tumbuhan Berfungsi. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. Virus mozek Foxtail: vektor virus untuk ekspresi protein dalam bijirin. Fisiol Tumbuhan. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürn‑ berger T, et al. Pencirian molekul dan analisis fungsi MgNLP, satu-satunya protein yang mengandungi domain NPP1, daripada patogen daun gandum kulat mycosphaerella graminicola. Mol Tumbuhan-Mikrob Berinteraksi. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et al. Gen seperti rintangan penyakit gandum yang unik mengawal kerentanan yang dicetuskan oleh effector kepada patogen nekrotropik. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Meramalkan gen penting untuk mengenal pasti sasaran dadah yang berpotensi dalam Aspergillus fumigatus. Kimia Biol Komputasi. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Pengenalpastian dan analisis gen Aspergillus nidulans penting menggunakan teknik menyelamat heterokaryon. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A, et al. Pengenalpastian gen penting dan keutamaan sasaran dadah dalam Aspergillus fumigatus. Pathog PLoS. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Pendekatan genetik ke hadapan mendedahkan kepentingan genotip perumah yang bergantung kepada kromosom aksesori dalam patogen gandum kulat Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Dinamik penyahtindasan unsur transposable didorong tekanan dan evolusi virulensi dalam patogen kulat. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Ketidakstabilan genom yang luar biasa dan penyusunan semula kromosom yang meluas semasa pertumbuhan vegetatif. Genetik. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Aksesori membuat pakaian: kromosom aksesori dan kawasan DNA terbuang lain dalam kulat patogen tumbuhan. Mol Tumbuhan-Mikrob Berinteraksi. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et al. Sisipan unsur boleh alih membentuk peraturan gen dan penghasilan melanin dalam patogen kulat gandum. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, DJ Valkenburg, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. Efector LysM yang dirembeskan melindungi hifa kulat melalui pempolimeran homodimer yang bergantung kepada kitin. Pathog PLoS. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Protein PR{1}} gandum disasarkan oleh protein efektor patogen nekrotropik. Loji J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Protein antimikrob kuno yang dipilih bersama oleh patogen tumbuhan kulat untuk manipulasi planta mycobiome. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA, et al. Manipulasi mikrobiom oleh patogen tumbuhan kulat bawaan tanah menggunakan protein efektor. Tumbuhan Nat. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. Magnaporthe oryzae nucleoside diphosphate kinase diperlukan untuk homeostasis metabolik dan penindasan imuniti semula jadi hos pengantara redoks. Mikrobiol Mol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580
