Pengklonan, Pengenalpastian Fungsian Dan Analisis Ekspresi Chalcone Synthase Daripada Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Keputusan dan analisis

3.1 Pengklonan gen CtCHS

Empat jujukan yang dianotasi sebagai "chalcone synthase" telah disaring menggunakan data transkrip bunga Cistanches tubulosa. Melalui perbandingan Blast NCBI, didapati hanya satu jujukan yang mempunyai panjang penuh gen CHS dan mempunyai FPKM lebih daripada 10. Primer khusus direka berdasarkan jujukan ini, dan serpihan kira-kira 1200 bp diperoleh melalui penguatan PCR menggunakan CDNA bunga cistanches tubulosa sebagai templat (Rajah 1). Produk PCR telah diperoleh semula dan disambungkan kepada vektor pCE2TA/Blunt-Zero. Keputusan penjujukan adalah konsisten dengan analisis transkrip. Gen itu dinamakan CtCHS. Panjang jujukan ialah 1173 bp dan mengekod 390 asid amino.

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Analisis bioinformatik CtCHS

3.2.1 CtCHS sifat fizikal dan kimia dan analisis domain transmembran

Perisian dalam talian ProtParam digunakan untuk menganalisis sifat fizikal dan kimia protein yang dikodkan oleh gen CtCHS. CtCHS mengekod 390 asid amino, formula molekul ialah C1908H3041N511O562S22, jisim molekul relatif ialah 42 836.54, titik isoelektrik teori ialah 5.85, dan ia tidak stabil. Pekali II ialah 43.24, yang merupakan protein yang tidak stabil, dan keseluruhan hidrofilik purata (GRAVY) ialah -0.052, yang merupakan protein hidrofilik. Alat dalam talian Skala Prot selanjutnya digunakan untuk menganalisis hidrofilik/hidrofobisiti protein. Keputusan analisis menunjukkan bahawa nilai maksimum hidrofilik/hidrofobik protein CtCHS ialah 2.422 (342) dan nilai minimum ialah -2.489 (119). Rantaian peptida asid amino yang dikodkan oleh gen CtCHS mempunyai lebih banyak sisa asid amino hidrofilik daripada residu asid amino hidrofobik, jadi ia adalah protein hidrofilik. Perisian dalam talian TMHMM digunakan untuk meramalkan struktur transmembran protein. Protein CtCHS tidak mempunyai domain transmembran.

Rajah 1 amplifikasi PCR gen CtCHS

3.2.2 Ramalan struktur sekunder dan struktur tertier protein CtCHS

Alat dalam talian SOPMA digunakan untuk meramalkan struktur sekunder protein. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 2-A. 44.87% -heliks, 31.03% gegelung rawak, 15.64% rantai lanjutan dan 8.46% -lembaran membentuk struktur sekunder protein CtCHS. struktur aras. Perisian analisis dalam talian SWISS-MODEL digunakan untuk meramalkan struktur tertier protein, dan struktur kristal beras CHS1 digunakan sebagai templat untuk meramalkan struktur tiga dimensi protein CtCHS. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 2-B. Konsistensi antara Cistanche tubulosa CtCHS dan beras CHS1 ialah 83.55%.

3.2.3 Perbandingan jujukan dan analisis dan aplikasi pokok filogenetik

Perisian DNAMAN melakukan perbandingan homologi antara CtCHS dan jujukan asid amino CHS spesies lain. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 3-C. Urutan asid amino CtCHS adalah konsisten dengan Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) dan Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) dan Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). Urutan asid amino CHS sangat serupa, dengan persamaan ialah 90.93%, 90.68%, 90.18%, 89.42%, 89.42%, dan 81.61%.

EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 30% ECHINACOSIDE DAN 12% ACTEOSIDE

Di samping itu, penjajaran jujukan berbilang juga menunjukkan bahawa CtCHS telah memulihara sisa pemangkin Cys164, His303, dan Asn336. Untuk memahami lebih lanjut kedudukan evolusi Cistanche tubulosa CtCHS dalam keluarga CHS tumbuhan, perisian MEGA-X telah digunakan untuk membina pokok filogenetik antara protein CtCHS dan CHS tumbuhan lain. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS berkait rapat.

3.3 Ekspresi dan penulenan prokariotik CtCHS

Plasmid pET-28a-CtCHS telah diubah menjadi strain ekspresi E. coli BL21 (DE3), dan ekspresi protein diinduksi oleh IPTG pada suhu rendah. Protein telah disucikan menggunakan lajur kromatografi pertalian ion nikel, dan protein yang telah disucikan telah dikesan oleh 10% SDSPAGE. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 3. Jalur protein CtCHS muncul berhampiran 40,000, yang konsisten dengan jisim molekul relatif protein CtCHS sebanyak 42,800.

3.4 Analisis aktiviti enzim CtCHS

Untuk mengenal pasti fungsi CtCHS, protein CtCHS yang telah disucikan telah diinkubasi dengan malonyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA dan produk telah dikesan menggunakan HPLC dan MS. Di bawah keadaan semula jadi, naringenin-chalcone tidak stabil dalam larutan dan mudah dikitar menjadi naringenin. Oleh itu, naringenin-chalcone dan naringenin telah dipilih sebagai kawalan standard.

Keputusan ujian HPLC ditunjukkan dalam Rajah 4-A dan B. Masa pengekalan produk tindak balas enzim adalah serupa dengan piawaian naringenin. Kedua-duanya mempunyai penyerapan maksimum pada 289 nm dalam spektrum penyerapan UV, yang berbeza daripada masa pengekalan naringenin-chalcone. Spektrum masa dan penyerapan UV adalah berbeza, tetapi sebagai kawalan negatif, produk selepas pengeraman protein CtCHS yang tidak diaktifkan suhu tinggi dengan substrat tidak mengandungi naringenin, chalcone dan naringenin. Pengesanan lanjut melalui spektrometri jisim, spektrum jisim peringkat pertama (Rajah 4-C, D) menunjukkan bahawa produk tindak balas enzim mempunyai [MH]-puncak m/z271.060 97, manakala naringenin mempunyai [MH ]-puncak m/z 271.060 91.

Membandingkan spektrum MS2 (Rajah 5-E, F), produk tindak balas enzim CtCHS dan naringenin kedua-duanya mempunyai puncak serpihan ciri pada m/z 107, 151, dan 177, yang konsisten dengan laporan literatur [19], menunjukkan bahawa CtCHS mempunyai kompleks chalcone. Aktiviti enzimatik, ia boleh memangkinkan tindak balas malonyl-CoA dan 4-coumaroyl-CoA kepada naringenin-chalcone.

3.5 Analisis penyetempatan subselular

Untuk mengkaji peranan protein CtCHS dalam sel, plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS telah dibina dan diubah menjadi protoplas Arabidopsis thaliana untuk memerhatikan penyetempatan subselularnya. Keputusan ditunjukkan dalam Rajah 5. Sebagai kawalan, protein pCAMBIA1300-35S-GFP diagihkan dalam nukleus dan sitoplasma, manakala protein gabungan pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS diedarkan terutamanya dalam sitoplasma, menunjukkan bahawa protein CtCHS mungkin berfungsi dalam sitoplasma sel tumbuhan. Fungsi.

3.6 Analisis corak ekspresi CtCHS

qRT-PCR digunakan untuk mengesan ekspresi relatif CtCHS dalam bunga Cistanche deserticola dengan tiga warna: putih, ungu dan merah. Hasilnya ditunjukkan dalam Rajah 6. Ekspresi CtCHS dalam bunga ungu dan merah adalah lebih tinggi daripada bunga putih. kuantiti. Berbanding dengan bunga putih, tahap ekspresi CtCHS dalam bunga ungu adalah 8.44 kali lebih tinggi, dan tahap ekspresi CtCHS dalam bunga merah adalah 3.21 kali lebih tinggi. Keputusan ini menunjukkan bahawa perubahan dalam tahap ekspresi CtCHS mungkin berkaitan dengan perbezaan warna bunga Cistanche deserticola. Semakin tinggi tahap ekspresi, semakin gelap warna bunga. , semakin rendah tahap ekspresi, semakin cerah warna bunga.

****P＜0.000 1Gamb. 6 Tahap ekspresi relatif CtCHS dalam bunga dengan warna yang berbeza

4. Perbincangan

CHS ialah aenzim utama dalam laluan biosintetik flavonoiddan berkaitan dengan kee peraturan warna bungadalam banyak tumbuhan. Contohnya, warna bungaDianthus chinensisL.[20] dan Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] semuanya dipengaruhi oleh CHS. kawalan.Cistanches tubulosaterutamanya mempunyai tiga warna bunga: putih, merah, dan ungu, tetapi mekanisme peraturan warna bunganya masih belum dilaporkan. Dalam kajian ini, gen CtCHS telah diklon menggunakan RT-PCR melaluianalisis data transkrip bunga Cistanches tubulosa, dan yang

Analisis bioinformatiktelah dijalankan, dan keputusan menunjukkan bahawa CtCHS mempunyai persamaan yang tinggi dan hubungan genetik yang rapat dengan urutan asid amino ElCHS Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS ialah jenis III polyketide synthase (PKSIII), dan kajian mendapati bahawa CHS mempunyai triad pemangkin Cys-His-Asn yang terpelihara [23]. Dalam kajian ini, analisis penjajaran jujukan asid amino menunjukkan bahawa CtCHS telah memulihara sisa pemangkin Cys164, His303, dan Asn336, menunjukkan bahawa CtCHS mungkin mempunyai fungsi sintase chalcone yang tipikal.

mampu. Analisis aktiviti enzim dilakukan menggunakan ekspresi prokariotik protein CtCHS dalam Escherichia coli dan dikesan oleh HPLC dan MS. Telah didapati bahawa protein CtCHS boleh memangkinkan 4-coumaroyl-CoA dan malonyl-CoA untuk menghasilkan naringenin-chalcone.

CHS terlibat dalam sintesis flavonoid dalam banyak tumbuhan, tetapi lokasi subselularnya berbeza dalam spesies yang berbeza. Contohnya, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Setiap CHS[26] semuanya terletak dalam sitoplasma, manakala Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], terung Solanum melongena L. SmCHS [28] terletak dalam sitoplasma dan nukleus, dan dalam anggur Vitis vinifera L. VvCHS terletak dalam sitoplasma, nukleus dan dinding sel [29]. Dalam kajian ini, plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS telah digunakan untuk mengubah protoplas Arabidopsis thaliana dan diperhatikan bahawa protein CtCHS kebanyakannya disetempat dalam sitoplasma, dan boleh memangkinkan pengeluaran naringenin-kalkon dalam sitoplasma kepada menggalakkan pengumpulan flavonoid.

Laluan fenilpropanoid bercabang daripada 4-coumaroyl-CoA ke dalam laluan sintesis flavonoid dan laluan biosintesis lignan. CHS memangkinkan 4-coumaroyl-CoA dan malonyl-CoA untuk menjana naringenin dan chalcone untuk memulakan flavonoid. Laluan biosintetik sebatian seperti sebatian adalah enzim utama pertama dalam laluan ini [30]. Oleh itu, CHS yang sangat dinyatakan bermanfaat untuk tumbuhan mengumpul tahap flavonoid yang lebih tinggi dan menghasilkan bunga yang lebih gelap. Sebagai contoh, tahap ekspresi CHS dalam varieti bunga ungu Hosta plantaginea (Lam.) Aschers adalah lebih tinggi daripada varieti berbunga putih. Hosta HpCHS diubah menjadi tembakau untuk mendapatkan Berbanding dengan tembakau jenis liar, tumbuhan overexpression mempunyai kelopak yang lebih gelap dan jumlah kandungan antosianin yang lebih tinggi [31].

Dalam kajian ini, tahap ekspresi gen CtCHS adalah berkaitan dengan warna bunga Cistanches tubulosa. Ia sangat dinyatakan dalam bunga ungu gelap dan bunga merah, dan rendah dalam bunga putih berwarna terang. Perbezaan ungkapan CtCHS mungkin disebabkan oleh perbezaan dalam bunga Cistanches tubulosa. Salah satu sebab untuk mempunyai sut dan warna yang berbeza. Secara ringkasnya, kajian ini mengklonkan gen CtCHS daripada bunga Cistanche deserticola dan menjalankan analisis bioinformatik ke atasnya. Protein rekombinan CtCHS diperolehi oleh ekspresi eksogen dalam Escherichia coli. Analisis aktiviti enzim membuktikan bahawa protein CtCHS boleh memangkinkan 4-koenzim coumaroyl. A dan malonil-koenzim A menjana naringenin-kalkon. Didapati bahawa gen CtCHS sangat dinyatakan dalam bunga ungu dan merah dan rendah dalam bunga putih. Keputusan ini menunjukkan bahawa gen CtCHS boleh mengawal pengeluaran warna bunga yang berbeza dalam Cistanche deserticola, yang bermanfaat untuk penyelidikan lanjut mengenai mekanisme pengawalseliaan warna bunga Cistanche tubulosa dan menyediakan rujukan untuk penyelidikan seterusnya mengenai peranan CtCHS dalam pengawalseliaan warna bunga dalam Cistanche deserticola.