Pengklonan, Pengenalpastian Fungsian Dan Analisis Ekspresi Chalcone Synthase Daripada Cistanche Tubulosa

Abstrak: Objektif

Untuk mengkaji fungsichalcone synthase daripada Cistanche tubulosadan corak ekspresi gen CtCHS dalam bunga putih, merah dan ungu.

KaedahGen CtCHS telah diklon oleh RT-PCR dan analisis bioinformatik telah dijalankan. Plasmid pET-28a-CtCHS telah dipindahkan ke dalam Escherichia coli untuk mendorong ekspresi protein oleh IPTG. Protein rekombinan CtCHS diinkubasi dengan substrat p-coumaroyl CoA dan malonyl CoA, dan produk telah dikesan oleh HPLC dan MS. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS telah dipindahkan ke dalam protoplas Arabidopsis thaliana untuk memerhatikan penyetempatan subselular protein CtCHS. Corak ekspresi gen CtCHS dalam bunga C. tubulosa dengan tiga warna telah dikesan oleh qRT-PCR.

KeputusanGen CtCHS telah diklon. Panjang bingkai bacaan terbuka (ORF) ialah 1173 bp, pengekodan 390 asid amino, dan berat molekul protein ialah 42 8000.

EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK DENGAN 30% ECHINACOSIDE DAN 12% ACTEOSIDE

CtCHS mengandungi sisa pemangkin Cys164, His303, Asn336, yang dipelihara dalam sintase chalcone. Protein CtCHS dinyatakan dalam E. coli dan disucikan untuk mendapatkan protein rekombinan. Protein CtCHS boleh memangkinkan p-coumaroyl CoA dan malonyl CoA untuk menghasilkan naringenin chalcone. Protein CtCHS terutamanya disetempat dalam sitoplasma. Gen CtCHS sangat dinyatakan dalam bunga ungu dan merah, dan tahap ekspresi relatif masing-masing adalah 8.44 dan 3.21 kali lebih tinggi daripada bunga putih.

Kesimpulan Gen CtCHS telah diklon daripada bunga C. tubulosa dan protein telah dinyatakan. Protein CtCHS mempunyai fungsi sintase chalcone, dan ekspresi gen CtCHS lebih tinggi dalam bunga yang lebih gelap, menunjukkan bahawa gen CtCHS boleh mengawal warna bunga C. tubulosa, yang meletakkan asas untuk penyelidikan lanjut mengenai mekanisme peraturan warna bunga C. tubulosa.

Kata kunci: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; sintase kalkon; analisis aktiviti enzim; penyetempatan subselular; analisis ungkapan

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT ialah tumbuhan genus Pyreal, yang diedarkan secara semula jadi di selatan Xinjiang [1] di kawasan Hetian di Xinjiang [2]. Bunga paip mempunyai nilai perubatan yang tinggi. Batang dagingnya adalah salah satu sumber versi 2020 "Farmakope Cina". [3] Penyelidikan mengenai bunga paip batang daging cordonus telah meningkat, tetapi terdapat sedikit kajian biologi pada bunganya. Tempoh berbunga bunga paip adalah dari April hingga Mei [4], terutamanya Terdapat tiga warna putih , merah, dan ungu Bunga paip kaya dengan warna, tetapi mekanisme peraturan warna bunganya belum dilaporkan Kelas berkaitan dengan jenis, kandungan, dan pengedaran struktur tisu kelopak, pigmen, dan peraturan faktor persekitaran dan faktor genetik [5]. Pigmen dalam bunga tumbuhan terutamanya merangkumi tiga kategori: flavonoid, karotena, dan beetin, julat warna yang paling meluas Jenis dan kandungan flavonoid mempengaruhi warna banyak tumbuhan, seperti sebagai tiga jenis Paeonia Lactiflora Pall.

Ia kelihatan sebagai putih, dan warna utama warna mengandungi warna merah dan kecekapan yang indah menjadikan bunga hadir sebagai ungu -merah [8]. Warna bunga adalah ciri penting bagi banyak tumbuhan hiasan, dan ia juga merupakan faktor utama yang menarik serangga merah jambu [9]. Kajian telah menunjukkan bahawa ia diturunkan Kekerapan tertinggi lawatan serangga adalah tumbuhan cistanche ungu tua [10]. Untuk penyelidikan biologi mengenai penyelidikan genetik sintetik cistanoids dalam bunga cistanosaurus bunga tiub, ia adalah kondusif untuk menjelaskan mekanisme kawalan pewarnaan kordon bunga tiub, menyediakan asas teori untuk meningkatkan warna teknologi kejuruteraan genetik, mempromosikan warna yang lebih kaya, meningkatkan tontonan, meluaskan skop aplikasi.

Laluan biosintetik daripadaflavonoidbermula denganlaluan fenilpropanoid. Fenilalanin mula-mula ditukar kepada asid sinamik di bawah tindakan fenilalanin ammonialyase (PAL), dan asid sinamik 4-dihidroksilasi oleh asid sinamik. Enzim (asid sinamik-4-hidroksilase, C4H) dan 4-coumarate coenzyme A ligase (4-coumarate coenzyme A ligase, 4CL) memangkinkan tindak balas untuk menjana 4-coumaroyl-CoA [11]. Satu molekul 4-coumaroyl-CoA dan tiga molekul malonyl-CoA dimangkinkan oleh chalcone synthase (CHS) untuk menghasilkan naringenin chalcone, yang mempunyaisebatian flavonoid.Rangka asas chalcone isomerase, flavanone-3-hydroxylase, dihydroflavonol 4-reductase, dsb. menjana pelbagai flavonoid seperti isoflavon, flavonol, anthocyanin, dsb. [12]. Sebagai enzim utama dalam laluan biosintetik flavonoid, CHS mengawal kandungan flavonoid dalam tumbuhan dan juga memainkan peranan penting dalam mengawal warna bunga tumbuhan [13]. Sebagai contoh, pembungkaman gen pasca-transkripsi Gentiana scabra Bunge CHS boleh menghalang biosintesis antosianin dan menyebabkan pemutihan spesifik lobus corolla [14]. Pembungkaman gen CHS Actinidia eriantha Benth. CHS mengurangkan kandungan antosianin dalam kelopak dan menyebabkan Warna kelopak merah menjadi lebih cerah [15]. Oleh itu, dalam kajian ini, gen CtCHS telah diklon daripada bunga Cistanche deserticola, dan analisis bioinformatik, ekspresi dan penulenan prokariotik, analisis aktiviti enzim, analisis penyetempatan subselular dan analisis ekspresi dalam tiga warna bunga telah dilakukan ke atasnya untuk meneroka Fungsi CtCHS protein dan corak ekspresi gen CtCHS digunakan untuk menerokai hubungan antara warna bunga CtCHS dan Cistanche deserticola, yang meletakkan asas untuk kajian mekanisme pengawalseliaan warna bunga Cistanche deserticola.

1 Bahan dan instrumen

1.1 Bahan

Bunga Cistanche tuberosa dikumpulkan dari Yutian County, Hotan Prefecture, Xinjiang pada Mei 2018. Prinsip rawak diikuti semasa pensampelan, dan bunga Cistanche tuberosa dengan status fisiologi yang baik dan ketinggian tumbuhan yang konsisten telah dipilih. Tiga strain Cistanche deserticola dengan tiga warna bunga putih, merah dan ungu telah diambil dan dikenal pasti sebagai Cistanche tubulosa (Schenk) Wight oleh Profesor Tu Pengfei dari Sekolah Farmasi Universiti Peking. Mereka dengan cepat dibekukan dalam nitrogen cecair, disimpan di atas ais kering, dan diangkut ke Beijing. Sel kompeten E. coli DH5 secara kimia telah dibeli daripada Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., dan sel kompeten secara kimia E. coli BL21 (DE3) dibeli daripada Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor telah dibeli daripada Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA telah dibeli daripada Syarikat Sigma, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -kalkon dibeli daripada Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., dan naringenin dibeli daripada Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumen

Spektrofotometer Nanodrop 2000C (Syarikat Thermo Fisher, Amerika Syarikat); instrumen PCR kecerunan (Syarikat Eppendorf, Jerman); Alat PCR kuantitatif pendarfluor CFX 96, pengimejan gel UVP, alat elektroforesis gel, alat elektroforesis protein (Syarikat BioRad, Amerika Syarikat) ;EnSpire

Pembaca plat mikro (Syarikat PerkinElmer, Amerika Syarikat); inkubator suhu malar (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D berkapasiti besar pengayun suhu penuh (Kilang Peralatan Eksperimen Taicang); THZ-82Pengayun suhu malar mandi air ( Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Meja kerja ultra-bersih AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); pensteril wap tekanan tinggi (Syarikat TOMY, Jepun); Alat air tulen Milli Q (Millipore, Amerika Syarikat); LC-20Kromatografi Fasa cecair berkecekapan tinggi (Shimadzu Company, Jepun); spektrometri jisim resolusi tinggi UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Syarikat Thermo Fisher, Amerika Syarikat); Mikroskop konfokal laser FV1200 (Syarikat Olympus, Jepun).

2 Kaedah eksperimen

2.1 Pengekstrakan RNA dan sintesis cDNA. Bunga cistanche deserticola dikisar dalam nitrogen cecair dan kemudian tertakluk kepada ujian pengekstrakan RNA.

Jumlah RNA diekstrak menggunakan kit (Norgen, Cat 17200), kepekatan dan kualiti RNA dikesan oleh NanoDrop 2000C, dan sampel RNA dengan nisbah A260/A280 antara 1.8 dan 2.1 telah dipilih untuk sintesis transkripsi terbalik cDNA. Transkripase terbalik M-MLV (Promega, M170B) digunakan untuk mentranskripsikan jumlah RNA yang layak ke dalam cDNA. Operasi eksperimen dilakukan mengikut arahan.

2.2 Pengklonan gen CtCHS

Berdasarkan data transkrip bunga Cistanche deserticola kumpulan penyelidikan kami [16], CtCHS dengan bingkai bacaan terbuka yang lengkap telah disaring keluar, dan perisian SnapGene digunakan untuk mereka bentuk primer tertentu berdasarkan urutan gen (Jadual 1). Penguatan PCR dilakukan menggunakan cDNA bunga Cistanche deserticola sebagai templat. Sistem amplifikasi ialah 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, primer huluan dan hiliran (10 μmol/L) 2 μL setiap satu, cDNA 2 μL, Phanta Max Super- Fidelity

DNA Polimerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Keadaan tindak balas adalah: pra-pendenaturan pada 95 darjah selama 3 minit; 25 kitaran denaturasi pada 95 darjah selama 15 s, penyepuhlindapan pada 55 darjah selama 15 s, dan lanjutan pada 72 darjah selama 1 min; dan lanjutan tindak balas pada 72 darjah selama 5 minit. Produk PCR telah dikesan oleh 1% elektroforesis gel agarose dan kit penulenan DNA (Novizan, Cat DC301-01) digunakan untuk pemulihan gel, dan kemudian DNA yang dipulihkan telah ditulenkan oleh kit pengklonan pantas (Novizan, Cat C{17}}). Serpihan DNA telah diikat dengan vektor pCE2 TA/Blunt-Zero, diubah menjadi sel kompeten Escherichia coli DH5, dan selepas pengkulturan semalaman pada suhu 37 darjah , strain klon tunggal telah dipilih dan dihantar kepada syarikat untuk penjujukan.

Jadual 1 Urutan primer

2.3 Analisis bioinformatik

Gunakan perisian dalam talian ProtParam untuk menganalisis sifat fizikal dan kimia protein; gunakan alat dalam talian Skala Prot untuk menganalisis hidrofilik/hidrofobisiti protein; gunakan alat dalam talian SOPMA untuk meramalkan struktur sekunder protein; gunakan perisian analisis dalam talian SWISS-MODEL untuk meramalkan struktur tertier protein; gunakan perisian dalam talian TMHMM Ramalkan struktur transmembran protein; gunakan perisian DNAMAN untuk membandingkan homologi CtCHS dengan jujukan asid amino CHS spesies lain; gunakan perisian MEGA-X untuk membina pokok filogenetik, menggunakan jiran-menyertai (NJ) dan pembetulan Poisson Jarak evolusi dikira menggunakan kaedah Bootstrap, dan bilangan ulangan Bootstrap ialah 1000 kali.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS telah digunakan untuk pengesanan lanjut. Keadaan fasa cecair ialah lajur Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm), suhu lajur 40 darjah , naringenin , kalkon dan naringenin. Isipadu pemuatan bahan kawalan ialah 4 μL, dan isipadu pemuatan produk tindak balas enzim ialah 7 μL. Air (A)-acetonitrile (B) digunakan sebagai fasa bergerak. Kecerunan elusi ialah: 0 hingga 5 min, 30% B; 5 hingga 15 min. , 30%~60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Kadar aliran isipadu ialah 0.3 mL/min. Keadaan spektrometri jisim adalah sumber ion elektrospray, nitrogen sebagai gas pembawa, tekanan gas sarung 3.5 MPa, tekanan gas tambahan 1.0 MPa, tekanan semburan 3500 V, suhu kapilari 350 darjah, suhu pemanasan gas tambahan 200 darjah, mod ion positif dan negatif, pengimbasan julat ion m/z ialah 100-1500, resolusi MS penuh ialah 35 000, resolusi dd-MS2 ialah 17 500, (N)

CE/step nce ditetapkan kepada 35, 60.

2.6 Penyetempatan subselular protein CtCHS

Berdasarkan jujukan CtCHS dan prinsip pengklonan lancar, primer dengan tapak pemotongan enzim Kpn Ⅰ dan BamH Ⅰ telah direka bentuk, dan serpihan sasaran yang sepadan telah dikuatkan oleh PCR. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP telah dicerna dengan endonuklease sekatan Kpn Ⅰ dan BamH Ⅰ, dan serpihan dan vektor sasaran disambungkan melalui kit pengklonan lancar (Novizan, Cat C115-01), dan kemudian dipindahkan ke dalam sel kompeten E. coli DH5. , pilih strain klon tunggal untuk penjujukan, dan ekstrak plasmid daripada strain yang betul. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS dan pCAMBIA 1300-35S-GFP telah diubah menjadi protoplas Arabidopsis thaliana menggunakan PEG4000 dan dibiakkan di bawah cahaya malap selama 8 hingga 10 jam. Penyetempatan subselular protein CtCHS diperhatikan di bawah mikroskop confocal laser.

2.7 Analisis corak ekspresi CtCHS

Berdasarkan jujukan CtCHS, DNAMAN digunakan untuk mereka bentuk primer kuantitatif pendarfluor masa nyata, dengan F-box sebagai gen rujukan dalaman. Urutan primer ditunjukkan dalam Jadual 1. Ekspresi relatif CtCHS dalam bunga Cistanche deserticola dengan warna yang berbeza telah dikesan oleh PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata. Gunakan TransStart Green qPCR SuperMix (emas penuh, AQ101-02) untuk mengukur dengan kaedah pewarna pendarfluor Hijau SYBR, sistem tindak balas: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, primer huluan dan hiliran (10

μmol/L) {{0}}.2 μL setiap satu, templat cDNA 0.5 μL, air bebas nukleotidase 4.1 μL, kaedah dua langkah telah digunakan untuk tindak balas, dan prosedur tindak balas adalah berdasarkan kaedah daripada Dong Xianjuan et al. [18]. Setiap sampel mengandungi 3 replika biologi, dan eksperimen diulang tiga kali. Data eksperimen dianalisis menggunakan Excel to 2

Ungkapan relatif CtCHS dikira menggunakan kaedah −ΔΔCt, dan GraphPad Prism 8 digunakan untuk melakukan analisis kepentingan dan melukis histogram.