Mitogenomes Spesies Cistanche Mencadangkan Kepelbagaian Dan Kerumitan dalam Mitogenom Pesanan Lamiales

2.4. Ulangan dan Analisis Penduaan Segmen

Jenis dan bilangan ulangan berbeza-beza antara tiga mitogenom. SSR ialah jujukan yang terdiri daripada ulangan dengan motif 1 hingga 6 bp panjang. Antara mitogenom Cistanche, bilangan SSR adalah antara 37–133 dalam susunan berikut:C. tubulosa (133),C. deserticola(44) danC. salsa(37). Jenis ulangan poliadenin atau polythymine ialah SSR mononukleotida yang paling lazim (Rajah 2A dan Jadual S10). Keputusan ini adalah bersetuju dengan fakta bahawa kandungan AT (55.41–55.43 peratus ) adalah lebih tinggi daripada kandungan GC (44.57–44.59 peratus ) dalam mitogenom Cistanche (Jadual 1).

Rajah 2. Ulang jujukan mudah (SSRs), ulangan berselang dan ulangan tandem dalam 3 mitogenom spesies Cistanche. (A) Perbandingan SSR antara tiga mitogenom. Setiap lajur warna mewakili jenis ulangan SSR yang berbeza. (B) Perbandingan ulangan tandem antara tiga mitogenom. (C) Perbandingan ulangan berselang dalam tiga mitogenom. Setiap lajur warna mewakili jenis ulangan berselang yang berbeza. Bilangan ulangan dalam setiap kategori ditunjukkan pada bahagian atas lajur yang sepadan.

Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Maklumat Lanjut tentang Cara Cistanche meningkatkan Kesihatan

Seterusnya, kami mengesan ulangan berselang oleh REPuter. Ulangan berselang dibahagikan kepada empat jenis: ulangan ke hadapan, palindrom, terbalik dan pelengkap. Di dalamMitogenom cistanche, ulangan hadapan dan palindromik adalah jenis utama ulangan berselang (Rajah 2B dan Jadual S11–S13). Hanya 353 ulangan berselang dikesan dalam mitogenome C. salsa (Jadual S12), dan lebih daripada 1300 dalam C. tubulosa (Jadual S13).

In addition to the SSRs and interspersed repeats, we also detected tandem repeats >30 bp in length and similarities of >90 peratus. Bilangan ulangan berselang berkisar antara 4 hingga 26 dalam mitogenom Cistanche (Rajah 2C). Bilangan unit ulangan berjulat dari 1.8 hingga 2.5 salinan setiap ulangan bersamaan, dan saiz ulangan adalah antara 21 hingga 127 bp (Jadual S14–S16).

Keputusan pengenalpastian-penduaan segmen menunjukkan bahawa jujukan segmen adalah antara 199,584 bp hingga 2,142,551 bp panjang (Jadual 1), menyumbang 24.9 peratus , 11.7 peratus dan 53.9 peratus daripada panjang C. deserticola, C. salsa dan C. tubulosa mitogenomes, masing-masing (Rajah 3). Dalam mitogenome C. deserticola, 39 penjajaran telah dikenalpasti. Panjang penjajaran adalah antara 5078 bp hingga 38,025 bp (Jadual S17). Sebaliknya, hanya 14 penjajaran dikenal pasti dalam mitogenome C. salsa. Panjang penjajaran adalah antara 5385 bp hingga 23,085 bp (Jadual S18). Perlu diingat bahawa 168 penjajaran ditemui dalam mitogenome C. tubulosa. Panjang penjajaran adalah antara 5169 bp hingga 64,106 bp (Jadual S19). Penduaan segmen pasir berulang ini mungkin telah menggalakkan penyusunan semula genom dan menyumbang kepada variasi dalam saiz genom.

Rajah 3. Taburan pendua-segmen- mitogenomik bagi3 spesies Cistanche. (A) Cistanche tubulosa. (B) Cistanche deserticola. (C) salsa cistanche. Bulatan paling luar menandakan kedudukan mitogenome. Lengkok kuning terang menunjukkan penduaan segmen.

2.5. Analisis Filogenetik oleh Urutan Mitogenome

Filogeni telah dibina semula menggunakan PCG mitokondria yang dikongsi daripada 11 mitogenom Lamiales menggunakan kaedah kemungkinan maksimum (ML). Genus kakak daripadaCistancheialah Castilleja, dengan skor bootstrap (BS) sebanyak 100 (Rajah 4). Kedua-dua genera ini tergolong dalamFamili Orobanchaceae. Spesies Cistanche telah diedarkan dalam dua klad utama. Klad pertama (BS: 100) dibentuk olehC. deserticoladanC. salsa, dengan saiz mitogenome yang sama. Klad kedua mengandungi C. tubulosa dengan BS 100. Kedua-dua klad ini kemudiannya dikelompokkan bersama (BS: 100) (Rajah 4). Skor bootstrap adalah tinggi untuk semua cawangan, menunjukkan tahap kebolehpercayaan tinggi pokok filogenetik. Selain itu, hubungan filogenetik daripadaSpesies cistanchedibina menggunakan mitogenom adalah kongruen dengan menggunakan genom plastid, seperti yang ditunjukkan dalam kajian terdahulu kami.

Rajah 4. Hubungan filogenetik spesies Cistanche dengan 8 spesies Lamiales yang lain. Pokok itu dibina berdasarkan urutan asid amino 49 gen pengekodan protein mitokondria, termasuk atp1, atp4, atp6, atp8, atp9, atpB, atpE, ccmB, ccmC, ccmFc, ccmFn, tongkol, cox1, cox2, cox3, cytB, ItrA, matR, mttB, nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, nad6, nad7, nad9, petG, petL, rbcL, rpl2, rpl5, rpl10, rpl16, rpl23, rpl36, rps1,4 rps7, rps10, rps11, rps12, rps13, rps14, rps19, sdh3 dan sdh4. Spesies dalam kotak merah adalah tigaSpesies cistanche.

2.6. Kadar Penggantian PCG Mitokondria

PCG mitokondria yang dikongsi digunakan untuk menganggarkan kadar penggantian nukleotida PCG mitokondria di Lamiales. Bagi setiap 28 PCG, nisbah Ka / Ks berpasangan dikira. Kami mendapati bahawa catuan Ka/K bagi empat PCG adalah melebihi 1.0 dalam kebanyakan spesies (Rajah 5 dan Jadual S20). Empat PCG ini ialah atp4, ccmB, ccmFc dan matR, mencadangkan pemilihan positif yang berpotensi. Walau bagaimanapun, kebanyakan PCG mitokondria menunjukkan nisbah Ka / Ks yang rendah, menunjukkan kemungkinan pemilihan penulenan. Khususnya, catuan Ka/Ks atp9, cox1, cox3 dan nad4L menunjukkan nilai yang agak rendah (Rajah S8–S31).

Rajah 5. Petak kotak nilai Ka/Ks berpasangan di antara setiap gen pengekodan protein mitokondria yang dikekalkan dalam 11 spesies Lamiales.

3. Perbincangan

3.1. Pengembangan Genom dalam C. tubulosa

Sebahagian besar mitogenom tumbuhan mungkin terdiri daripada jujukan berulang kecil [26]. Sebagai contoh, DNA berulang dengan kerumitan rendah membentuk 5-10 peratus daripada jujukan dalam mitogenom Citrullus dan Cucurbita [27]. Tambahan pula, nisbah yang sama bagi urutan DNA berulang kerumitan rendah diperhatikan dalam tumbuhan lain [9,28]. Dalam kajian kami, C. tubulosa, C. salsa dan C. deserticola mempunyai urutan berulang iaitu 174,618 bp, 32,375 bp dan 149,945 bp panjang, menyumbang 4.4 peratus , 1.89 peratus dan 8.06 peratus daripada saiz mitogenom. Keputusan ini konsisten dengan keputusan kajian terdahulu, yang menunjukkan bahawa urutan ulangan boleh menyebabkan perubahan dalam saiz mitogenome [9,26,27,28].

C. deserticolamemiliki bahagian terbesar urutan pengulangan di antara tiga mitogenom Cistanche dalam kajian kami. Walau bagaimanapunsaiz mitogenome C. derserticola adalah hampir dengan saiz C. salsa, yang bermaksud bahawa faktor lain juga mungkin memainkan peranan penting dalam saiz mitogenome sebagai tambahan kepada urutan berulang kecil. Penduaan segmen dan gen pengekodan protein berbilang salinan adalah dua faktor lain yang menyebabkan pengembangan mitogenome.

Dalam mitogenome C. tubulosa, jujukan segmen pendua adalah 2,142,511 bp panjang, menyumbang 53.9 peratus daripada keseluruhan saiz mitogenome. Begitu juga, Sloan melaporkan bahawa 4.6-ulangan megabait telah dikenal pasti dalam mitogenome Silene conica, menyumbang 40.8 peratus daripada keseluruhan mitogenome [13]. Tambahan pula, gen pengekodan protein berbilang salinan mungkin mengakibatkan pengembangan mitogenome. Dalam mitogenome C. tubulosa, perkadaran gen teras pendua dan gen berubah adalah 58 peratus dan 35 peratus, masing-masing. Untuk mitogenom besar biasa (spesies Cucumis), beberapa gen pengekodan protein (rps19) juga dibentangkan dua kali dalam kedua-dua Citrullus dan Cucurbita [14]. Dalam C. tubulosa, kompleks Ⅰ (nad4, nad4L, nad6 dan nad7), kompleks Ⅳ (cox1 dan cox2), kompleks Ⅴ (atp4, atp8 dan atp9), biogenesis Cytochromec (ccmFc dan ccmFn), subunit kecil protein Ribosom (rps3, rps4 dan rps14), gen pengekodan protein Intron maturase (matR) dan pengangkutan bebas SecY (mttB) semuanya mempunyai beberapa salinan. Kami membuat spekulasi bahawa ini berkaitan dengan fakta bahawa tumbuhan holoparasit tidak menjalankan fotosintesis. Di samping itu, tekanan alam sekitar mungkin mengawal selia ekspresi beberapa gen yang berkaitan. Kajian terdahulu mencadangkan bahawa rantaian pengangkutan elektron mitokondria tumbuhan boleh meningkatkan prestasi tumbuhan di bawah keadaan persekitaran yang tertekan [29].Tidak seperti C. deserticola dan C. salsa, C. tubulosa mengalami tekanan garam dan tekanan sejuk berbanding tekanan kemarau[30,31,32]. Ini mungkin membawa kepada pertindihan gen dalam C. tubulosa. Ringkasnya, ulangan kecil, pertindihan segmen, dan gen berbilang salinan adalah punca utama pengembangan mitogenome.

3.2. Kehadiran MTPT

Dalam tumbuhan angiosperma, MTPT hampir selalu ada [33]. Dalam kajian kami, kami mendapati 158 C. deserticola, 128 C. salsa dan 139 C. tubulosa jujukan MTPT. Panjangnya ialah 35,165 bp, 28,963 bp dan 26,911 bp, menyumbang 1.89 peratus , 1.64 peratus dan 0.68 peratus daripadaC. deserticola, C. salsadanC. tubulosamitogenom, masing-masing. Cheng et al. mencadangkan bahawa 26.87-serpihan MTPT kilobait ditemui dalam glauca Suaeda, menyumbang 5.18 peratus daripada mitogenome [34]. Di samping itu, MTPT yang ditemui dalam Salix suchowensis menyumbang 11.3 peratus (17.5 kb) plastom dan 2.8 peratus (18.1 kb) mitogenome [35]. Menariknya, perkadaran MTPT dalam mitogenom Cistanche agak rendah. Di samping itu, keputusan kami menunjukkan bahawa, dalam jujukan MTPT, PCG plastid dan RNA ribosom adalah jujukan separa. Sebaliknya, gen tRNA plastid mempunyai urutan lengkap dalam serpihan MTPT. Kehilangan separa PCG plastid dan RNA ribosom menunjukkan bahawa mereka mungkin tidak lagi berfungsi dalam urutan MTPT. Ini menyokong teori bahawa serpihan DNA daripada plastom biasanya menjadi pseudogen tidak berfungsi, manakala beberapa gen tRNA masih menjalankan fungsi normal [36].

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Pensampelan, Pengekstrakan DNA, dan Penjujukan Genom

Sampel segar C. deserticola, C. salsa dan C. tubulosa dikumpul dari Liga Alxa (Wilayah Autonomi Mongolia Dalam), Bandar Tacheng (Wilayah Autonomi Uygur Xinjiang), Wilayah Hotan (Wilayah Autonomi Xinjiang Uygur), China (Jadual S1) . Sampel telah dikenal pasti oleh Profesor Yulin Lin dan disimpan di Herbarium Akademi Sains Perubatan Cina dan Kolej Perubatan Kesatuan Peking (di bawah nombor pendaftaran spesimen CMPB13484, CMPB13485 dan CMPB13487). Jumlah pengekstrakan DNA telah dijalankan menggunakan kit pengekstrakan DNA genomik tumbuhan (Tiangen Biotech, Beijing, China). Menggunakan kit bangunan perpustakaan NEBNext® [37], perpustakaan DNA dengan saiz sisipan 400 bp telah dibina. Selepas itu, platform penjujukan Illumina HiSeq4000 digunakan untuk penjujukan. Penjujukan menghasilkan 5.44, 5.16 dan 4.34 G data mentah, masing-masing (Jadual S1). Trimmomatic digunakan untuk menapis data mentah untuk mendapatkan data bersih [38]. Secara keseluruhan, 4.88 G, 4.62 G dan 3.92 G data bersih telah diperolehi, masing-masing. Sampel tumbuhan juga digunakan untuk penjujukan Oxford Nanopore. Pembinaan perpustakaan, pengesanan kualiti dan penjujukan telah dijalankan mengikut protokol standard pengeluar. Akibatnya, 78.96 G, 39.19 G dan 59.52 G data mentah diperolehi, dan 48 G, 31.96 G dan 54.56 G kekal selepas penapisan dan kelayakan (Jadual S1).

4.2. Perhimpunan dan Anotasi Mitogenome

Lapan mitogenom Lamiales telah dimuat turun sebagai rujukan daripada NCBI (Jadual S2). Kami pada mulanya memperkaya bacaan bersih berkaitan mitogenome daripada data Oxford Nanopore menggunakan USEARCH [39]. Bacaan Nanopore yang ditapis telah dipasang ke dalam contigs menggunakan Nextdenovo v2.4.0 (tersedia dalam talian: https://github.com/Nextomics/NextDenovo (20 Disember 2020)) dengan parameter lalai. Contigs yang diperoleh kemudiannya digunakan sebagai rujukan, dinamakan Contigs Struktur Cistanche. Bacaan akhir berpasangan Illumina dipetakan kembali ke Contigs Struktur Cistanche menggunakan Minimap2 [40] dan SAMtools [41]. Kami mengekstrak bacaan berpasangan Illumina yang ditapis dan memasangnya ke dalam contigs menggunakan SPAdes v. 3.10.1 [42]. Dengan membandingkan pemasangan bacaan pendek dan bacaan panjang menggunakan Minimap2 [40], kami terlebih dahulu menentukan contig yang merupakan molekul mitokondria yang diduga. Contigs perhimpunan yang diperoleh di atas telah diperbetulkan dengan bacaan akhir berpasangan Illumina menggunakan NextPolish1.3.1 [43]. Draf contigs mitokondria telah diproses selanjutnya mengikut langkah-langkah di bawah. Pertama, kami membandingkan urutan dengan yang di GenBank menggunakan program BLASTn untuk menentukan sama ada ia adalah bacaan mitokondria [44]. Kedua, kami memberi anotasi mitogenom menggunakan MITOFY untuk menentukan sama ada urutan mengandungi gen mitokondria [14].

4.3. Pengenalpastian DNA Plastid Mitokondria (MTPT)

Mitogenom cistanche dibandingkan dengan plastomes C. deserticola (MN614127), C. slsa (MN614128) dan C. tubulosa (MN614129) untuk mengenal pasti MTPT menggunakan BLASTn [44]. Parameter BLASTn dipilih berdasarkan yang dilaporkan sebelum ini [45]. Tambahan pula, TBtools digunakan untuk menggambarkan keputusan BLASTn [46]. Dengan bantuan plastomes Cistanche sebagai rujukan, segmen DNA yang dipindahkan yang dikenal pasti telah dijelaskan menggunakan BLASTn [44].

4.4. Analisis Ulangan Jujukan Mudah (SSR), Ulangan Tandem, Ulangan Bersilang dan Duplikasi Segmen

Laman web dalam talian MISA (Tersedia dalam talian: http://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/ (15 Januari 2021)) telah digunakan untuk mengenal pasti SSR dalam genom mitokondria. SSR ini termasuk mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, dan hexanucleotides dengan nombor minimum masing-masing 10, 6, 5, 5, 5 dan 5. Dengan parameter lalai, Pencari Ulangan Tandem [47] digunakan untuk mengenal pasti ulangan bersamaan. Di samping itu, REPuter digunakan untuk mengenal pasti urutan ulangan ke hadapan, terbalik, palindromik dan pelengkap [48]. Saiz ulangan minimum ditetapkan kepada 30 bp dan identiti unit ulangan adalah Lebih besar daripada atau sama dengan 90 peratus. Penduaan segmen dikenal pasti dengan membandingkan genom mitokondria dengan dirinya sendiri menggunakan BLASTN dengan nilai e-tetapan parameter=1 × 10−5. Semua penjajaran dengan panjang > 5000 bp dan skor > 90 peratus dianggap pendua segmen untuk pengiraan nombor pendua segmen. TBtools digunakan untuk menggambarkan keputusan BLASTn [46].

4.5. Analisis Filogenetik dan Anggaran Kadar Penggantian Nukleotida

Untuk analisis filogenetik, urutan DNA PCG genom mitokondria yang dikongsi daripada 11 spesies Lamiales, termasuk spesies Cistanche dalam kerja ini (Jadual S2), digunakan dalam pembinaan. Mitogenom 8 spesies Lamiales yang lain telah dimuat turun daripada pangkalan data Sumber Genome Organelle GenBank. PhyloSuite (v1.2.1) digunakan untuk mengekstrak PCG mitokondria yang dikongsi daripada spesies Lamiales [49]. MAFFT (v7.450) digunakan untuk menyelaraskan jujukan asid amino yang sepadan [50]. Urutan asid amino yang diselaraskan telah digabungkan dan digunakan untuk membina pokok filogenetik melalui kaedah kemungkinan maksimum (ML), menggunakan Solanum lycopersicum (MF03).

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, kajian ini memberikan pandangan pertama tentang kepelbagaian struktur dan kerumitanMitogenom cistanche. Keputusan kami menjawab tiga soalan saintifik yang dikemukakan dalam pengenalan. Pertama, mitogenom lengkapC. deserticola, C. salsadanC. tubulosatelah berjaya dipasang, yang merupakan pencapaian penting dalam kajian mitogenom Cistanche. Kedua, yangC. tubulosabersaiz hampir 4 Mb, menunjukkan pengembangan yang ketara. Tambahan pula,C. tubulosamitogenom berbeza dengan ketara daripada mitogenomC. deserticoladan C. salsa dari segi bilangan pendua PCG dan penduaan segmen. Tiga spesies Cistanche telah dibentuk menjadi satu klad, dekat dengan spesies Orobanchaceae. Di samping itu, topologi Lamiales dalam kajian ini sangat serupa dengan dalam sistem APG IV. Ketiga, jujukan MTPT dikenal pasti dalam tiga mitogenom spesies Cistanche, dengan PCG separa dan serpihan RNA ribosom, dan tRNA lengkap daripada plastomes. Oleh itu, hasil kajian ini mendedahkan banyak aspek menarik tentang kepelbagaian dan kerumitan mitogenome.