Polisakarida Cistanche Meningkatkan Penyerapan Echinacoside dalam Vivo Dan Mempengaruhi Mikrobiota Usus

Kenalan: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, et al

Abstrak

Polisakarida danglikosida fenilethanoiddaripadaCistanche deserticolatelah ditunjukkan mempunyai pelbagai manfaat kesihatan, namun, kesan interaktif antara kedua-dua jenis sebatian ini dalam vivo tidak diketahui secara terperinci. Objektif kajian ini adalah untuk menyiasat tindakan sinergistik polisakarida cistanche dengan glikosida phenylethanoid dan kesan polisakarida ke atas mikrobiota usus. Tikus Sprague-Dawley diberi makan dengan pelbagai jenis polisakarida cistanche selama 20 hari, pada hari terakhir, semua tikus diberiechinacosidepada 100 mg/kg. Hasilnya dibandingkan terutamanya pada perbezaan dalam parameter farmakokinetik, komposisi mikrobiota usus, dan kandungan asid lemak rantai pendek. Keputusan menunjukkan bahawa semua polisakarida sistanche, termasuk polisakarida mentah, molekul tinggipolisakarida berat, dan polisakarida berat molekul rendah, boleh mengawal kepelbagaian mikrobiota usus, meningkatkan bakteria berfaedah dan terutamanya meningkatkan pertumbuhan Prevotella spp. serta meningkatkan pengeluaran asid lemak rantaian pendek dan penyerapan echinacoside. Dengan meneroka tindakan sinergistik polisakarida dengan molekul kecil, penemuan ini mencadangkan bahawa polisakarida cistanche, terutamanya polisakarida berat molekul rendah, boleh digunakan sebagai manipulator mikrobiota usus untuk promosi kesihatan.

Kata kunci:CistanchedeserticolapolisakaridaEchinacosideMikrobiota usus

Klik di sini untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang produk cistanche

1. Pengenalan

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, telah menjadi jelas bahawa polisakarida memodulasi komposisi mikrobiota usus dan perubahan itu boleh mengantara pelbagai penyerapan nutrisi [1], menghasilkan fungsi fisiologi [2,3]. Polisakarida daripada perubatan tradisional Cina (TCM) telah ditunjukkan sebagai calon yang sesuai untuk peraturan mikrobiota usus dan menunjukkan kesan prebiotik. Dalam pencernaan, polisakarida dan beberapa sebatian molekul kecil bersentuhan tidak dapat dielakkan, menunjukkan beberapa kesan ke atas aktiviti biologi [4]. Sebagai salah satu jenis bahan aktif utama dalam Panax ginseng, yang telah digunakan secara meluas selama beribu-ribu tahun, polisakarida menunjukkan kebaikanpenambahbaikandi dalamususmetabolismedanpenyerapandaripadaginsenosidesdalam vivo [5]. Codonopsis pilosula polisakarida menunjukkan kesan promosi penyerapan saponin dalam tikus kolitis akibat natrium dekstran sulfat [6]. Ganoderma lucidum polysaccharides, terutamanya pecahan berat molekul yang tinggi, didapati mempunyaiprebiotikfungsidalam model tikus dysbiosis usus yang disebabkan oleh diet lemak tinggi [7]. Polisakarida longan mengawal mikrobiota usus dan metabolit usus (meningkatkan kandungan piruvat dan butanoat) untuk menghasilkan aktiviti imunomodulator [8].

Cistanche deserticola, sebagai Perubatan Tradisional Cina, telah digunakan secara meluas sebagai makanan tambahan di China. Kajian farmakologi menunjukkan bahawa ia dipamerkanneuroprotektif, imunomodulator, hormonmengimbangi, anti-keletihan, anti-radang, hepatoproteksi,anti-oksidatif, anti-bakteria, anti-viral, dananti-ketumbuhankesan [9]. Analisis kimia menunjukkan bahawa glikosida phenylethanoid dan polisakarida adalah juzuk aktif utama. Echinacoside, glikosida phenylethanoid utama dalam C. deserticola, telah menunjukkan tindakan farmakologi yang luas, walau bagaimanapun, kebolehgunaan dadah adalah terhad disebabkan oleh bioavailabiliti yang lemah, metabolisme yang cepat dan meluas dalam vivo. Kajian telah mengesahkan echinacoside boleh dimetabolismekan oleh mikrobiota usus secara in vitro [10,11]. Bagaimanapun, bukti in vivo belum disiasat. Seperti yang kita ketahui, mikrobiota usus memainkan peranan penting dalam pengantaraan bioaktiviti metabolisme ubat-ubatan herba. Oleh itu, matlamat utama kerja ini adalah untuk menyiasat pengaruhpolisakarida cistanchepada mikrobiota usus dan kesan pada metabolisme echinacoside.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Bahan dan bahan kimia

Cistanche deserticola YC Ma diperolehi daripada Alashan, Inner Mongolia Mandela sand industry development Co., LTD, China. Mereka telah disahkan oleh profesor Lijuan Zhang (Universiti Perubatan Tradisional Cina Tianjin). Satu spesimen baucar telah disimpan di makmal kami. Bahan standard seperti echinacoside, acteoside, dan asid klorogenik diperoleh daripada Institut Kebangsaan untuk Kawalan Produk Farmaseutikal dan Biologi (Beijing, China). Ketulenan setiap piawai adalah Lebih besar daripada atau sama dengan 98 peratus . Acetonitrile dan metanol gred kromatografi telah dibeli daripada Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Asid formik dibeli daripada Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, Amerika Syarikat). Reagen kimia lain adalah gred analitik dan dibeli daripada Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China).

Tikus Sprague-Dawley jantan (200–220 g) dibekalkan oleh Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Beijing, China, No. lesen SCXK (Jing) 2014- 0004). Semua haiwan dibiakkan dan ditempatkan di bawah keadaan SPF di kemudahan haiwan. Eksperimen telah dilakukan mengikut garis panduan yang ditetapkan oleh penjagaan haiwan dan menggunakan jawatankuasa TJUTCM dan mematuhi panduan untuk penjagaan dan penggunaan haiwan makmal yang diterbitkan oleh Institut Kesihatan Kebangsaan AS (Nombor Penerbitan NIH 85–23, disemak 1996). ). Selepas tempoh penyesuaian 1 minggu, tikus dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan: kumpulan kawalan, kumpulan polisakarida jumlah, kumpulan polisakarida molekul tinggi, dan kumpulan polisakarida molekul rendah. Setiap kumpulan terdiri daripada 6 ekor tikus, yang dibiakkan dalam sangkar yang sama.

2.2. Penyediaan polisakarida cistanche

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma telah dibersihkan dan dikeringkan pada 40 darjah dalam ketuhar pengering udara, kemudian dihancurkan menjadi serbuk kasar. Serbuk kasar kering telah diekstrak dengan 85 peratus etanol akueus (v/v) pada 60 darjah dua kali, dan 2 jam untuk setiap kali. Nisbah pepejal-cecair ialah 1:12 dan 1:10, masing-masing. Sisa herba diekstrak dengan air pada 100 darjah dua kali lagi, masa ekstrak dan nisbah pepejal-cecair adalah sama dengan 85 peratus etanol. Larutan air telah digabungkan dan dipekatkan di bawah tekanan yang dikurangkan dan kemudian dimendakan dalam 80 peratus etanol, berdiri di bawah 4 darjah selama 24 jam. Mendakan diasingkan melalui sentrifugasi pada 8000 rpm selama 10 minit pada 4 darjah dan kemudian diliofilkan untuk mendapatkan jumlah polisakarida (ZT). ZT kemudiannya dilarutkan dalam air ternyahion dan ditapis pada membran ultraturasan gentian berongga 100 kDa, polisakarida molekul tinggi (HM) infiltrat retentif terkumpul. Turasan yang meresap telah ditapis dengan membran ultraturasan 6 kDa. Polisakarida molekul tengah turasan retentif (MM) dan polisakarida molekul rendah (LM) turasan meresap telah diperolehi.

2.3. Pencirian utama polisakarida cistanche

Kandungan polisakarida ditentukan oleh kaedah fenol asid sulfurik menggunakan glukosa sebagai piawai [12]. Jumlah kandungan protein ditentukan oleh kaedah BCA [13]. Analisis komposisi monosakarida telah dijalankan oleh sistem HPLC (UltiMate 3000) yang dilengkapi dengan lajur SinoPak C18 (5 μm, 150 mm × 4.6 mm) dan pengesan tatasusunan diod (VWD-3000). Pengasingan kromatografi bagi derivatif pra-lajur PMP (1-fenil-3- metil-5-pirazolon) telah dijalankan menggunakan penimbal fosfat 100 mM dan asetonitril pada nisbah 82:18 (v/v , peratus ) sebagai fasa bergerak pada kadar aliran 1.0 mL/min. Sebanyak 10 μL setiap sampel disuntik dan jangka masa analisis selama 30 minit dengan pengesanan pada 245 nm telah digunakan. Pemerolehan dan pemprosesan data dilakukan menggunakan Perisian Chromeleon 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, Amerika Syarikat).

Berat molekul (Mw) ditentukan oleh kromatografi pengecualian saiz berprestasi tinggi (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 sistem), dilengkapi dengan TSK gel G3000 PWXL (7.8 × 300.0 mm, Tosoh, Jepun) dan TSK gel GMPWXL (7.8 × 300.0 mm, Tosoh, Jepun) lajur dan pengesan indeks biasan RefractoMax521 (RID). Sampel telah dicairkan dengan 0.1 moL/L Na2SO4 pada kadar alir 0.5 mL/min. Suhu lajur dikekalkan pada 35 darjah . Dextran sebagai piawai dan lengkung piawai telah diplot mengikut masa elusi yang diplotkan terhadap logaritma berat molekul.

2.4. Kajian farmakokinetik

Sampel darah dikumpulkan dari kanthus dalam pada {{0}} h, 0.083 h, 0.167 h, 0.25 h, 0.5 j, 0.75 h, 1.0 h, 2.0 h, 3.{{20}} h, 4.0 h, 6.0 h, 8.0 h, 10 h, 12 h dan 24 h selepas pentadbiran echinacoside (100 mg/kg). Sampel plasma diperolehi dengan mengempar selama 10 minit pada jam 7500 malam. Kepada 100 μL sampel plasma, 10 μL larutan IS (asid klorogenik), dan 500 μL metanol telah ditambah. Campuran kemudiannya divirteks selama 3 minit dan sentrifugasi pada 14,000 rpm selama 10 minit. Supernatan dikumpulkan dan dikeringkan dalam nitrogen pada suhu bilik. Selepas itu, sisa telah dilarutkan dalam 100 μL 50 peratus metanol akueus, sentrifugasi pada 14,000 rpm selama 10 minit lagi. Akhirnya, 3 μL supernatan disuntik ke dalam sistem LC-MS/MS untuk analisis. Sampel dianalisis menggunakan kaedah mengikut yang dilaporkan sebelum ini. Fasa bergerak terdiri daripada CH3CN (pelarut A) dan H2O (mengandungi 0.1 peratus HCOOH; pelarut B) menggunakan kecerunan berikut: 0–1 min, 10 peratus A; 1–8 min, 10–90 peratus A; 8–9 min, 90–10 peratus A; 9–11 min: 10 peratus A. Sampel diasingkan pada lajur ACQUITY HSS T3 (1.8 μm, 100 mm × 2.1 mm id). Kadar alir ialah 0.3 mL/min dan suhu lajur ditetapkan pada 35 darjah . Dalam analisis MS, mod pengionan negatif digunakan, dengan parameter dioptimumkan berikut: voltan kapilari, 2.5 kV; suhu pelarutan, 450 darjah . Nitrogen digunakan sebagai gas pelarutan dan kon, pada kadar aliran 900 L/j dan 150 L/j, masing-masing. Oleh itu, kuantifikasi dilakukan menggunakan MRM bagi peralihan m/z 785.29 → 623.26 untuk echinacoside, m/z 353.06 → 191.07 untuk asid klorogenik (IS), m/z 623.24 → 161.09 untuk acteoside. Voltan kon untuk echinacoside, IS dan acteoside ialah 100 V, 32 V, dan 74 V; tenaga perlanggaran, 32 V, 14 V, dan 30 V.

2.5. Kajian asid lemak rantaian pendek (SCFA).

Tikus Sprague-Dawley jantan diberi ZT, HM, dan LM secara lisan selama 3 minggu. Penentuan SCFA (asid asetik, asid propionik, asid isobutirik, asid butirik, asid isovalerik, asid valerik, dan asid heksanoik) oleh kromatografi gas (GC) telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini dengan beberapa pengubahsuaian [14]. Secara ringkas, 0.5 g sampel najis ditaburkan dalam 2.5 mL air Milli-Q, dipusingkan selama 10 min dan 7.5 mL 1 peratus larutan HCl/etanol yang mengandungi piawaian dalaman (asid butirik 24.0 ug /mL dan 2- asid etil heksanoik 1.32 ug/mL sebagai piawai dalaman) telah ditambah. Campuran dihomogenkan selama 5 minit dan disentrifugasi pada 14,000 rpm selama 10 minit pada 4 darjah . Lima mikroliter supernatan disuntik dalam mod split pada nisbah 30: 1. Gas pembawa ialah N2 (99.999 peratus ) pada 1 mL/min. Gas solekan (N2) adalah pada 25 mL/min. Kadar alir H2 dan udara ialah 30 mL/min dan 300 mL/min, masing-masing. Sampel najis dikumpul pada hari ke-20 kajian ini dan segera disimpan pada suhu -80 darjah.

2.6. Pengumpulan najis, pengekstrakan DNA, dan penjujukan gen rRNA 16S

Kira-kira 200 mg sampel tahi segar dikumpulkan dalam tiub Eppendorf steril 1.5 mL daripada setiap tikus dan disimpan pada suhu -80 darjah untuk penyediaan DNA kemudian. DNA telah diekstrak daripada najis menggunakan Kit Mini Najis DNA QIAamp (QIAGEN). Jumlah DNA ditentukan menggunakan spektrofotometer NanoDrop (Thermo Electron Corporation); integriti dan saiz telah diperiksa oleh 1.0 peratus elektroforesis gel agarose. Mengikut kepekatan, DNA telah dicairkan kepada 1 ng/μL menggunakan air steril.

16S rRNA telah dikuatkan menggunakan primer khusus (V4: 515F-806R) dengan kod bar. Semua tindak balas PCR telah dijalankan dengan Campuran Induk PCR Kesetiaan Tinggi Phusion® (New England Biolabs). Campurkan volum yang sama bagi penimbal pemuatan 1× (mengandungi hijau SYB) dengan produk PCR dan kendalikan elektroforesis pada gel agarose 2 peratus untuk pengesanan. Jalur utama yang terang antara 400 dan 450 bp telah dipilih untuk eksperimen selanjutnya. Produk PCR dicampur dalam nisbah ketumpatan EU. Kemudian, campuran produk PCR telah ditulenkan dengan Kit Pengekstrakan Gel Qiagen (Qiagen, Jerman).

Perpustakaan penjujukan telah dibina menggunakan Kit Penyediaan Sampel Percuma PCR TruSeq® DNA (Illumina, Amerika Syarikat) berikutan pengesyoran pengilang dan kod indeks telah ditambahkan. Kualiti perpustakaan telah dinilai pada sistem Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) dan Agilent Bioanalyzer 2100. Perpustakaan ini disusun pada platform Illumina HiSeq 2500 dan bacaan akhir berpasangan 250 bp telah dihasilkan.

2.7. Analisis bioinformatik

Pemotongan jujukan kod bar dan primer, pemasangan jujukan dan penapisan data mengikut QIIME (V 1.7.0). Urutan dengan persamaan Lebih daripada atau sama dengan 97 peratus telah diberikan kepada OTU yang sama. OTU dianotasi sebagai label SILVA. Indeks kepelbagaian alfa yang menilai kekayaan komuniti mikrob usus (metrik ACE dan Chao1) dan kepelbagaian komuniti (metrik Shannon dan Simpson) dikira menggunakan Qiime (Versi 1.9.1). Analisis kepelbagaian beta digunakan untuk menyiasat variasi struktur komuniti mikrob menggunakan jarak UniFrac. Perbezaan antara semua kumpulan telah diuji oleh ujian Tukey dan ujian Wilcox. Analisis koordinat utama (PCoA) digunakan untuk menerangkan perbezaan komposisi antara empat kumpulan menggunakan pakej R. Kaedah saiz kesan analisis diskriminasi linear (LEfSe) direka khusus untuk penemuan biomarker dan data penjujukan penjelasan. Dan analisis diskriminasi linear (LDA) digunakan untuk mengira saiz kesan setiap mikrob usus yang berbeza dan ciri-ciri yang berkaitan dengan setiap kumpulan tikus. Analisis korelasi telah dilaksanakan dengan menggunakan pakej R gcorrplot (Versi 1.1.463).

Data SCFA dianalisis menggunakan ANOVA SPSS 22.0.

3. Keputusan dan perbincangan

3.1. Penyediaan dan analisis kimia polisakarida cistanche

Cistanches Herba digunakan sebagai makanan dan perubatan di China. Polisakarida yang diasingkan daripadanya telah menarik perhatian besar kerana aktiviti pentingnya. Dalam kajian ini, empat bahagian polisakarida cistanche (ZT, HM, MM, dan LM) diperoleh dengan kaedah pengekstrakan air, pemendakan alkohol, dan ultraturasan. Komposisi kimia empat bahagian polisakarida ditunjukkan dalam Jadual 1.

Jumlah kandungan gula sampel dengan menggunakan lengkung piawai glukosa. Keputusan menunjukkan bahawa hasil HM dan LM adalah lebih tinggi daripada MM. Polisakarida menunjukkan sifat farmakologi yang pelbagai, terutamanya aktiviti imun. Kajian telah menunjukkan bahawa kandungan dan jenis monosakarida, berat molekul, jenis kumpulan substituen memainkan peranan penting dalam aktiviti polisakarida [15]. Bahagian berbeza komposisi monosakarida polisakarida cistanche adalah serupa, dan mannose (Man), asid galakturonik (GalUA), glukosa (Glc), galaktosa (Gal), dan arabinosa (Ara) adalah monosakarida utama.

Walau bagaimanapun, kandungannya berbeza antara empat bahagian. Glukosa dan arabinosa merupakan komponen utama ZT dan HM, manakala glukosa ialah unit gula utama LM, selain itu, sedikit rhamnose dan asid glukuronik (GlcUA) turut dikesan dalam pecahan ini.

Berat molekul relatif sampel telah disiasat oleh kromatografi pengecualian saiz berprestasi tinggi (HPSEC). Mengikut lengkung piawai dextrans dan masa pengekalan dalam lajur, berat molekul puncak utama dalam ZT diperhatikan pada 1.68 × 106 Da dan 1.70 × 104 Da, dalam HM ditentukan sebagai 1.54 × 106, 2.06 × 105, dan 4.81 × 104, dalam MM dan LM ditentukan masing-masing menjadi 1.09 × 104 dan 2.05 × 104. Hasil daripada mereka disenaraikan dalam Jadual 1 dan hasil MM adalah rendah dan tidak mencukupi untuk eksperimen haiwan. Kajian terdahulu telah menunjukkan kesan yang bergantung kepada struktur polisakarida cistanche pada pelbagai bioaktiviti [16]. Eksperimen lanjut masih diperlukan, terutamanya penulenan, Analisis struktur Fifine harus digunakan untuk kajian aktiviti struktur

3.2. Kajian farmakokinetik

Farmakokinetik echinacoside telah disiasat oleh kromatografi cecair berprestasi ultra tinggi spektrometri jisim triple quadrupole (UPLC dan Xevo TQ-S) selepas pemberian oral echinacoside. Purata profil masa kepekatan plasma echinacoside ditunjukkan dalam Rajah 1. Menurut perisian ubat dan statistik (DAS, versi 2.0), farmakokinetik echinacoside fifi pada model satu petak, dan satu lagi parameter dalam kumpulan ZT, HM, dan LM diringkaskan dalam Jadual 2, termasuk masa untuk mencapai kepekatan maksimum (Tmax), kepekatan maksimum (Cmax), kawasan di bawah lengkung kepekatan-masa (AUC), dan masa kediaman min (MTR). ). Kajian farmakokinetik menunjukkan bahawa purata Cmax echinacoside dalam kumpulan ZT, HM dan LM didapati 646.4 ng/mL, 732.0 ng/ml dan 898.4 ng/mL iaitu 1.6, 1.8 dan 2.2 kali berbanding kumpulan kawalan (406.8 ng/ml), masing-masing. Dengan prarawatan dengan polisakarida, AUC(0-24} h) echinacoside masing-masing meningkat sebanyak 6.6 peratus , 36.7 peratus dan 63.6 peratus dalam kumpulan ZT, HM dan LM, berbanding dengan kumpulan kawalan, yang membuktikan bahawa polisakarida menunjukkan aktiviti menggalakkan penyerapan molekul kecil. Keputusan ini agak serupa dengan chitooligosaccharides meningkatkan bioavailabiliti glikosida phenylethanoid dalam ekstrak Fructus Forsythia [17] dan polisakarida Polygonum multiflorum meningkatkan sifat biofarmaseutikal 2, 3, 5, 4′-tetrahydroxy-stilbene- 2- O- -D-glukosida dalam tikus Sprague-Dawley biasa [18]. Mikrobiota usus mengandungi pelbagai enzim berkaitan metabolisme dadah dan mekanisme mikrobiom membentuk farmakokinetik dan farmakodinamik ubat masih tidak diketahui [19]. Polisakarida boleh menyuburkan mikrobiota usus dengan meningkatkan sistem imun, menyerap nutrien, dan mengurangkan pertumbuhan patogen [20,21]. Walaupun kesusasteraan melaporkan bahawa polisakarida cistanche boleh meningkatkan metabolit echinacoside (seperti acteoside) secara in vitro, kami tidak mendapati polisakarida yang wujud bersama telah mendapat manfaat untuk penukaran echinacoside kepada acteoside dalam vivo [10,11].

3.3. Kandungan SCFA dalam najis tikus

Polisakarida ditapai mikrobiota usus, menghasilkan pelbagai polimer dan metabolit bioaktif, seperti SCFA [3]. Sebagai metabolit utama polisakarida, SCFA dianalisis dalam najis. SCFA, termasuk asid asetik, asid propionik, dan butirat telah dilaporkan mempunyai kesan yang baik terhadap metabolisme glukosa, kolesterol dan lipid. Asetat adalah SCFA utama dalam kolon dan merupakan substrat penting untuk sintesis kolesterol, propionat adalah substrat untuk glukoneogenesis dalam hati dan butirat adalah substrat tenaga pilihan kolonosit dan mempunyai anti-radang dalam usus [22,23].

Keputusan kami menunjukkan bahawa asetat adalah SCFA utama yang terbentuk dalam najis untuk semua kumpulan, diikuti oleh butirat dan propionat, manakala kepekatan valerat dan SCFA bercabang (asid isobutirik dan asid isovalerik) adalah lebih rendah. Asetat telah ditunjukkan untuk meningkatkan aktiviti enzim dalam tisu hati, menghasilkan kawalan gula darah yang lebih baik [24]. Pada hari ke-20(Rajah 2), kumpulan LM mempunyai paras asetat yang lebih tinggi dengan ketara (pb 0.05), perkadaran propionat cenderung menurun, dan perkadaran butirat cenderung meningkat walaupun perubahan adalah tidak ketara dalam najis berbanding dengan kumpulan kawalan.

Walau bagaimanapun, kumpulan HM mempunyai bahagian butirat yang jauh lebih rendah daripada kumpulan kawalan (pb 0.05). Kandungan jumlah SCFA antara LM dan HM adalah arah aliran yang bertentangan berbanding dengan kumpulan kawalan dan hanya kumpulan LM yang mempunyai perbezaan yang ketara.

Banyak faktor mempengaruhi tahap SCFA dalam tinja, termasuk komposisi dan jumlah mikrobiota usus, sumber pemakanan, dan masa yang diperlukan untuk makanan melalui saluran pencernaan [22]. Kajian terkumpul menunjukkan bahawa struktur polisakarida, termasuk komposisi sisa monosakarida, tahap pempolimeran, kedua-duanya boleh menjejaskan sifat penapaian dan pengeluaran SCFA [25]. Daripada keputusan kami, kami boleh membuat kesimpulan bahawa polisakarida cistanche memodulasi pengeluaran SCFA dan polisakarida struktur yang berbeza mempunyai kesan yang berbeza.

3.4. Polisakarida cistanche menyebabkan perubahan teras dalam komposisi dan kepelbagaian mikrobiota usus

Komposisi bakteria bagi sampel najis (n=4) telah diperiksa menggunakan teknik penjujukan hasil tinggi Illumina. Perpustakaan ini disusun pada platform Illumina HiSeq2500 dan bacaan akhir berpasangan 250 bp dihasilkan. Mereka diproses untuk pengenalpastian taksonomi dan analisis kepelbagaian. Keluk rarefaction (Rajah 3a) menunjukkan bahawa, bagi setiap sampel, kekayaan spesies bakteria diratakan apabila kedalaman pensampelan meningkat, menunjukkan bahawa usaha penjujukan adalah mencukupi dan bahawa jumlah kepelbagaian dalam sampel telah ditangkap. Keluk Shannon (Rajah 3b) menunjukkan bahawa bilangan spesies bakteria unik meningkat apabila bilangan jujukan yang dikenal pasti meningkat. Ketepuan lengkung Shannon bermakna data penjujukan sudah cukup untuk merangkumi semua spesies bakteria.

Analisis kepelbagaian alfa digunakan untuk mengukur kepelbagaian dalam sampel. Indeks kepelbagaian Chao1, ACE, Shannon dan Simpson telah dikira oleh ujian Tukey untuk menerangkan kepelbagaian alfa. Analisis kepelbagaian berdasarkan indeks ACE dan Chao 1 mendedahkan kekayaan komuniti mikrobiota usus di peringkat OTU. Indeks ACE dan Chao 1 adalah jauh lebih rendah dalam sampel tahi kumpulan LM berbanding dengan kumpulan kawalan (pb 0.05) (Rajah 4a, b), membayangkan bahawa kekayaan spesies mikrobiota usus telah berkurangan. dengan memberi makan LM. Analisis kepelbagaian berdasarkan indeks Shannon dan Simpson mendedahkan kepelbagaian komuniti mikrobiota usus. Tiada perubahan jelas dalam indeks kepelbagaian Shannon dan Simpson apabila dirawat dengan polisakarida cistanche berbanding dengan kumpulan kawalan.

Polisakarida cistanche menyebabkan perubahan besar dalam taksa. Selain itu, dalam empat kumpulan N98 peratus daripada OTU berkaitan dengan phyla Bacteroidetes, Firmicutes, dan Proteobacteria. Filum yang paling dominan ialah Bacteroidetes yang menyumbang 55.09 peratus , 57.89 peratus , 52.72 peratus dan 69.{{20}}4 peratus mikrobiota tahi dalam kawalan, ZT, HM dan Kumpulan LM masing-masing, diikuti oleh Firmicutes, menyumbang 41.39 peratus , 38.0masing-masing 3 peratus , 42.15 peratus dan 28.15 peratus (Rajah 5a, b). Berbanding dengan kumpulan kawalan, kumpulan ZT ditunjukkan menghasilkan kesan lemah pada kelimpahan relatif filum utama, kecuali kelimpahan Actinobacteria yang rendah telah meningkat dengan ketara (MetaStat, pb 0.05). Dalam kumpulan HM, Proteobacteria meningkat dengan ketara (pb 0.01). Ini menunjukkan bahawa polisakarida HM Cistanche boleh menggalakkan pengayaan Proteobacteria untuk menjejaskan metabolisme bahan dalam tikus. Dalam kumpulan LM, kelimpahan Bacteroidetes, yang penyumbang utamanya ialah Prevotellaceae dan Prevotellaceae_UCG-001 meningkat dengan ketara (pb 0.05) dan kelimpahan Firmicutes, termasuk Peptococcaceae, menurun dengan ketara (pb 0.01) . Ahli Prevotella dan Bacteroides sebelum ini digambarkan sebagai pengurai serat pemakanan [26], menghasilkan produk akhir metabolik seperti suksinat dan asetat [27]. Findings sedemikian mengesahkan kajian terdahulu menunjukkan bahawa beberapa Prevotella spp. boleh merendahkan polisakarida tumbuhan kompleks. Laporan terdahulu juga menunjukkan bahawa dua bahagian bakteria yang dominan, nisbah peningkatan filum Firmicutes/Bacteroidetes dikaitkan dengan obesiti [28]. Kelimpahan yang lebih rendah dari bekas dan kelimpahan yang lebih tinggi daripada yang terakhir dalam kumpulan LM mencadangkan LM boleh membantu mengurangkan berat badan.

Daripada 72 keluarga yang dikesan, taxa top10 telah diasingkan dan dianalisis (Rajah 5c, d). Lachnospiraceae dan Ruminococcaceae adalah dua daripada keluarga yang paling banyak ditemui dalam persekitaran usus mamalia dan telah dikaitkan dengan penyelenggaraan kesihatan usus [29]. Dalam kajian ini, kumpulan keluarga Bacteroidales{_S24-7_(39.11 ± 6.04 peratus , 36.88 ± 4.44 peratus , 28.37 ± 4.01 peratus , 35.81 ± 5.91 peratus ), Prevotellaceae (10.66 ± 10.68 peratus) peratus , 19.65 ± 8.97 peratus , 21.05 ± 8.39 peratus ), Lachnospiraceae (18.21 ± 5.20 peratus , 15.09 ± 3.29 peratus , 12.13 ± 7.14 peratus , 13.12 ± 6 peratus ), 13.8 ± 4 peratus, 13.12 ± 12.8 peratus ± 4.70 peratus , 8.19 ± 1.72 peratus ) mendominasi dalam setiap kumpulan. Keluarga S24-7 telah dilaporkan yang mengandungi banyak enzim pengurai karbohidrat [30]. Prevotellaceae menunjukkan peningkatan dan Lachnospiraceae menunjukkan kecenderungan menurun dalam kumpulan polisakarida berbanding dengan kumpulan kawalan [31]. Diandaikan bahawa tiada enzim aktif polisakarida cistanche yang sepadan dalam kumpulan_S24-7_Bacteroidales dan Lachnospiraceae atau modul bakteria pengikat karbohidrat pada polisakarida. Genera Prevotella telah dilaporkan berkaitan dengan lokus penggunaan polisakarida dan enzim aktif karbohidrat [32]. Untuk mencari hubungan antara bakteria dan SCFA, analisis korelasi Spearman telah digunakan. Beberapa genera seperti Bacteroides, Prevotella, dan Lactobacillus dalam mikrobiota usus memainkan peranan penting dalam hidrolisis polisakarida ke dalam SCFA [33]. Keputusan kami juga menunjukkan bahawa Bacteroidaceae berkorelasi positif dan mikrobiota yang didominasi menghasilkan lebih banyak butirat [34], manakala Prevotellaceae berkorelasi secara positif dan mikrobiota yang didominasi menghasilkan lebih banyak asetat. Lactobacillaceae dan Ruminococcaceae mendominasi mikrobiota menghasilkan lebih propionat (Rajah 6).

Analisis kepelbagaian beta digunakan untuk menyiasat variasi struktur mikrobiota usus merentasi sampel menggunakan metrik jarak UniFrac. Perbezaan dalam jarak Unifrac dianalisis oleh ujian Tukey dan Wilcox (Rajah 7). Menggunakan analisis unweighted uniFrac, kami mendapati bahawa LM memberi makan kelompok tikus jauh dari kumpulan lain. Corak pengelompokan yang jelas telah dikenal pasti untuk kumpulan kawalan, ZT, HM, dan LM.

Kelimpahan mikrob ini dimodulasi secara berbeza dengan rawatan polisakarida. Untuk mengenal pasti taksa bakteria tertentu dalam setiap kumpulan, komposisi mikrobiota daripada kumpulan kawalan, ZT, HM, dan LM dibandingkan dengan kaedah saiz kesan analisis diskriminasi linear (LEfSe). Analisis Diskriminasi Linear (LDA) digunakan untuk mengira saiz kesan bagi setiap ciri yang banyak berbeza. Ambang skor LDA adalah lebih tinggi daripada senarai 4, menunjukkan kelimpahan komuniti relatif yang lebih tinggi dalam kumpulan yang sepadan berbanding kumpulan lain. Dengan menggunakan kaedah ini, kami mendapati bahawa 19 OTU adalah ketara berbeza dalam semua kumpulan, iaitu, 6 OTU dalam kumpulan kawalan adalah lebih tinggi, hanya 1 OTU dalam kumpulan ZT lebih tinggi, 10 OTU dalam kumpulan HM lebih tinggi. dan 2 OTUS dalam kumpulan LM adalah lebih tinggi daripada kumpulan lain (Rajah 8). Kelimpahan g_Prevotellaceae_ UCG_001 dalam LM telah meningkat dengan ketara (8.47 ± 1.9 peratus dalam LM, 0.40 ± {{21 }}.09 peratus dalam kumpulan Kawalan, pb 0.01). Hasilnya adalah konsisten dengan laporan bahawa Porphyra haitanensis dan Ulva prolifera polysaccharides jelas boleh menggalakkan pembiakan Prevotellaceae UGC-001 (pb 0.05) dan Rikenellaceae RC9 (pb 0.01) [35].

4. Kesimpulan

Adalah jelas bahawa terdapat hubungan antara konstituen kimia TCM, mikrobiota usus, dan metabolit tertentu yang terhasil daripada mikrob usus. Findings semasa kami menyediakan kaedah untuk mengkaji sinergi metabolisme echinacoside dengan pelbagai jenis polisakarida berdasarkan mikrobiota usus. Mikrobiota usus boleh memetabolismekan TCM dan TCM boleh menjejaskan pertumbuhan mikrobiota usus. Di satu pihak, selepas pemberian oral polisakarida ke dalam usus, pelbagai mikrobiota usus mengekod enzim metabolik, memainkan peranan penting dalam penguraian polisakarida, dan menghasilkan metabolit bioaktif. Sebaliknya, sumbangan polisakarida mempunyai beberapa kesan ke atas keseimbangan mikroenvironmental usus dalam proses tersebut. Melalui perbandingan dengan atau tanpa polisakarida, kami mendapati bahawa polisakarida walaupun tidak dicerna oleh perumah secara langsung, berpotensi bertindak sebagai prebiotik, yang membawa kepada perubahan yang menggalakkan dalam mikrobiota usus dengan menggalakkan pertumbuhan probiotik. Polisakarida cistanche mengawal kepelbagaian mikrobiota usus, meningkatkan bakteria berfaedah dan terutamanya polisakarida molekul rendah meningkatkan pertumbuhan Prevotella spp. Tambahan pula, mikrobiota usus yang lebih baik kemudian meningkatkan penyerapan echinacoside dalam deserticola Cistanche. Tetapi sebabnya tidak jelas sepenuhnya, mungkin disebabkan oleh kecacatan gabungan mikrobiota usus, SCFA, dan imuniti, dan penyelidikan lanjut diperlukan untuk model penyakit. Sukar untuk membuktikan kesan prebiotik dalam model haiwan yang sihat yang komuniti mikrobiotanya stabil dan berdaya tahan. Cistanche deserticola polysaccharides boleh dibangunkan sebagai produk probiotik untuk mengawal mikrobiota usus dan boleh digunakan untuk metabolisme sinergistik molekul kecil pada masa hadapan. Data ini akan membantu kami untuk mereka bentuk campur tangan untuk menghalang kumpulan orang yang terdedah untuk meningkatkan kesihatan mereka.

Pengisytiharan kepentingan bersaing

Penulis mengisytiharkan bahawa tidak ada konflik kepentingan mengenai penerbitan kertas ini.

Ucapan terima kasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Yayasan Sains Semula Jadi Kebangsaan China (No. Geran 81830112 dan 81904058)

Rujukan
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Prebiotik yang berpotensi dan mekanisme penghantarannya: pendekatan terkini, J. Dubur Ubat Makanan. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, Mikrobiota usus, kesihatan perumah, dan polisakarida, Bioteknol. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, Peranan kritikal polisakarida dalam ekologi dan fisiologi mikrob usus, Annu. Mikrobiol Rev. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Kajian tentang ciri-ciri pengikatan tiga polisakarida dengan berat molekul yang berbeza dan flavonoid daripada sutera jagung (Maydis stigma), Karbohid. Polim. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, Mikrobiota usus -mekanisme yang terlibat dalam meningkatkan pendedahan sistemik ginsenosides dengan polisakarida yang wujud bersama dalam rebusan ginseng, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Penyerapan Codonopsis pilosula saponin oleh polisakarida yang wujud bersama mengurangkan disbiosis mikrob usus dengan natrium dextran sulfate -kolitis yang disebabkan oleh tikus model, Biomed. Res. Int. 2018 (2018), 1781036(18 muka surat).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum mengurangkan obesiti pada tikus dengan memodulasi komposisi mikrobiota usus, Nat. Commun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Mikrobiota usus terlibat dalam aktiviti imunomodulator polisakarida longan, Mol. Nutr. Makanan Re. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Ginseng Gurun": ulasan, Am. J. Chin. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Pengenalpastian metabolit echinacoside yang dihasilkan oleh bakteria usus manusia menggunakan cecair ultraperformance
spektrometri jisim masa penerbangan kromatografi–quadrupole, J. Agr. Kimia Makanan. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Metabolisme gastrousus manusia ekstrak air Cistanches Herba in vitro: penjelasan profil metabolik berdasarkan pengenalan metabolit komprehensif dalam jus gastrik, jus usus, usus manusia bakteria, dan mikrosom usus, J. Agric. Kimia Makanan. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Kaedah kolorimetrik untuk penentuan gula dan bahan berkaitan, Dubur. Kimia. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Imunisasi mukosa novel dengan konjugat polisakarida-protein yang terperangkap dalam mikrosfera alginat, J. Control. Keluaran 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Pengesanan sensitif dan dipermudahkan pengaruh antibiotik terhadap perubahan dinamik dan serba boleh pendek najis -asid lemak rantai, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Pengubahsuaian molekul polisakarida dan bioaktiviti yang terhasil , Compr. Makanan Rev. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: gambaran keseluruhan sifat kimia, farmakologi dan farmakokinetiknya, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Kesan chitooligosaccharides pada
penyerapan usus glikosida phenylethanoid dalam ekstrak Fructus Forsythia, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Pengaruh polisakarida daripada Ophiopogon japonicus pada 2,3,5,4′-tetrahydroxy -stilbene-2- Z. Fu et al. / Jurnal Antarabangsa Makromolekul Biologi 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glukosida tentang sifat biofarmaseutikal dalam vitro dan farmakokinetik dalam vivo, Int. J. Biol. Makromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precision medicine pergi mikroskopik: merekayasa mikrobiom untuk meningkatkan hasil dadah, Cell Host Microb 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Mencari prebiotik, kaedah penilaian inovatif, dan aplikasi kesihatannya: ulasan, 3 Bioteknologi. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Persatuan saintifik antarabangsa untuk probiotik dan pernyataan konsensus prebiotik (ISAPP) mengenai definisi dan skop prebiotik, Nat. Rev. Gastro. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Kesihatan kolon: penapaian dan asid lemak rantai pendek, J. Clin. Gastroenterol. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, Artikel ulasan: asid lemak rantai pendek dalam kesihatan dan penyakit, Aliment. Pharm. Di sana. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Peningkatan obesiti dan toleransi glukosa oleh asetat dalam diabetes jenis 2 Otsuka Long- Tikus Evans Tokushima Fatty (OLETF), Biosci. Bioteknol. Biokim. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, Kebolehpenapaian in vitro xylooligosaccharides dan pecahan Xylo-polisakarida dengan berat molekul yang berbeza oleh bakteria najis manusia, Karbohid. Polim. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Kapasiti penggunaan gentian berbeza-beza dalam mikrobiota usus yang dikuasai Prevotella- versus Bacteroides, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii ialah sinonim heterotip terdahulu Bacteroides chinchilla dan mempunyai keutamaan, Int. J. Syst. Evol. mikro. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Mikrobiom usus yang berkaitan dengan obesiti dengan peningkatan kapasiti untuk penuaian tenaga, Alam 444 (7122) (2006) 1027–1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Hubungan antara mikrobiom usus dan hormon metabolik pada awal kehamilan pada wanita yang berlebihan berat badan dan obes, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Pencirian genomik bagi keluarga S{1}} Bacteroidales yang tidak dikultur yang mendiami usus haiwan homeotermik, Mikrobiom. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Kesan bermanfaat Lachnospiraceae penghasil butirat pada hipersensitiviti viseral yang disebabkan oleh tekanan dalam tikus, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Radas degradasi polisakarida tumbuhan yang pelbagai dan meluas bagi rumen dan usus belakang spesies Prevotella: faktor dalam kewujudannya? Syst. Appl. mikrobiol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Peranan karbohidrat dalam kesihatan usus babi, Anim. suapan. Sci. Tech. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A . Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Memahami potensi prebiotik gentian pemakanan yang berbeza menggunakan model penapaian dewasa berterusan in vitro (PolyFermS), Sci. Rep. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Kesan dua polisakarida rumpai laut pada mikrobiota usus dalam tikus yang dinilai oleh penjujukan Illumina PE250, Int. J. Biol. Makromol. 112 (2018) 796–802.