Pengenalpastian Spesies Dan Analisis Komposisi Kimia Tumbuhan Cistanche Liar Dari Kenya

Abstrak:Kajian ini menggunakan teknik morfologi tumbuhan, histologi, dan pengekodan bar DNA untuk mengenal pasti spesies Cistanche liar di Kenya. Kandungan komponen aktif utama, termasuk glikosida phenylethanoid, alkohol gula, dan betaine, dalam Cistanche liar dari Kenya ditentukan oleh kaedah HPLC. Sementara itu, analisis cap jari telah dijalankan. Keputusan menunjukkan bahawa tumbuhan Cistanche liar yang dikutip dari Kenya telah dikenal pasti sebagai Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Kandungan bahan aktif sepertiechinacoside,cistanoside A, acteoside, isoacteoside, dan 2'-acetylacteoside dalam C. senegalensis dari Kenya adalah lebih rendah daripada C. tubulosa domestik, tetapi lebih tinggi daripada C. deserticola domestik. Kandungan betaine adalah serupa dengan C. deserticola domestik, tetapi ia tidak mengandungi glukosa. Ciri-ciri cap jari lebih serupa dengan C. tubulosa domestik. Kajian ini menyediakan asas untuk perlindungan sumber, penyelidikan mendalam dan pembangunan sumber Cistanche di Kenya.

Kata kunci: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; pengenalan spesies; pengekodan bar DNA; penentuan kandungan

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, herba yang berharga dalam Perubatan Tradisional Cina, merujuk kepada batang tumbuhan padang pasir yang kering, bersisik dan berair sepertiCistanche deserticolaYC MadanCistanche tubulosa(Schenk) Wight, kedua-dua ahli keluarga Orobanchaceae. Terkenal dengan keupayaannya untuk menguatkan buah pinggang, menyuburkan pati dan darah, dan melembapkan usus untuk melegakan sembelit, Cistanche telah diraikan dalam teks herba Cina selama berabad-abad. Rekod perubatan terawalnya muncul dalam klasik kunoMateria Medica Klasik Shennong, di mana Cistanche dikelaskan sebagai herba "gred unggul". Sepanjang sejarah, banyak teks perubatan tradisional telah mendokumentasikan faedah kuat Cistanche, menjadikannya nama samaran yang dihormati "Ginseng of the Desert."

Kesan farmakologi pelbagai Cistanche dikaitkan dengan pelbagai sebatian bioaktifnya. Antaranya, glikosida phenylethanoid adalah bahan aktif utama yang bertanggungjawab untuk kesan pengetonan buah pinggang dan penyuburan sumsum Cistanche. Sebatian ini-seperti echinacoside dan acteoside-mempamerkan aktiviti neuroprotektif, anti-demensia, anti-penuaan dan hepatoprotektif. Terutamanya, echinacoside dan acteoside ialah dua sebatian penanda aras yang digunakan untuk kawalan kualiti Cistanche seperti yang dinyatakan dalam edisi 2020 Pharmacopoeia Cina. Di samping itu, kesan julap Cistanche terutamanya disebabkan oleh komponen alkohol oligosakaridanya, termasuk betaine, manitol, fruktosa, glukosa, dan sukrosa. Lima komponen ini diiktiraf secara meluas sebagai penunjuk keupayaan Cistanche untuk melembapkan usus dan menggalakkan pergerakan usus.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

Di China, spesies utama Cistanche termasukCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,salsa cistanche(CA Mey.) G., danCistanche sinensisG. Beck. Spesies ini berasal dari kawasan seperti Mongolia Dalam, Ningxia, Gansu, dan Xinjiang. Di luar barat laut China, spesies Cistanche juga diedarkan di seluruh kawasan gersang dan padang pasir di Eurasia serta utara dan timur Afrika, termasuk negara seperti Iran, Afghanistan, Kenya, Pakistan dan Mongolia.

Kenya, yang terletak di Afrika Timur dan mengangkangi khatulistiwa, kebanyakannya terdiri daripada tanah tinggi dengan ketinggian purata 1,500 meter, tetapi kawasan utaranya adalah padang pasir atau separuh padang pasir. Orang asli Kenya mempunyai sejarah panjang menggunakan tumbuhan ubatan untuk penyembuhan. Wilayah ini mempunyai kekayaan flora perubatan-contohnya, ekstrak daripada kulit kayu dan akar pokok berus gigi (Salvadora persicaL.) terkenal dengan sifat anti-radang dan antibakteria dan sering digunakan untuk merawat sakit gigi dan jangkitan. Kulit pokok cendana (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) digunakan untuk merawat cirit-birit, manakala air rebusan jelatang Maasai (Urtica massaicaMildbr.) daun digunakan untuk sakit perut. Tradisi yang kaya ini telah memupuk budaya tumbuhan ubatan yang bertenaga, namun disebabkan oleh cabaran pembangunan ekonomi, penggunaan tumbuhan ubatan ini belum didokumenkan atau dikaji secara sistematik sepenuhnya.

Menariknya, spesies Cistanche sering dianggap sebagai rumpai di Afrika dan tidak mendapat banyak perhatian atau penyelidikan. Malah, hampir tiada kajian yang diterbitkan mengenai African Cistanche. Menjawab jemputan daripada Jabatan Pembangunan Wilayah untuk Tanah Gersang dan Separuh Gersang Komuniti Afrika Timur, pasukan penyelidik kami menjalankan kajian lapangan di Kenya untuk menyiasat sumber Cistanche tempatan. Kami mengumpul spesimen Cistanche liar, menjalankan pengenalan botani, dan menganalisis sebatian bioaktif utama mereka. Matlamatnya adalah untuk memahami kepelbagaian spesies dan potensi pembangunan Cistanche di Kenya, dan untuk menyediakan asas saintifik untuk penyelidikan dan penggunaan lanjut tumbuhan padang pasir yang berharga ini.

Cistanche tubulosa kering keseluruhan akar Jualan di China

Whatsapp Kami Untuk Maklumat Lanjut

 

 

Bahan dan Kaedah

Bahan Tumbuhan

Spesimen Cistanche Liar dari Kenya telah dikumpulkan pada Ogos 2023 oleh Profesor Pengfei Tu dan Yong Jiang dari Pusat Pengajian Sains Farmaseutikal, Universiti Peking, di Kajiado, Kenya (01 darjah 50'01"S; 36 darjah 47'00"E). Dua tumbuhan Cistanche liar telah dikumpulkan dan dilabelkan K1 dan K2, bersama-sama dengan akar tumbuhan perumah mereka (lihat Rajah 1). Kilang perumah telah dikenal pasti oleh Kennedy Matheka, pembantu penyelidik di Herbarium Afrika Timur, Muzium Negara Kenya, sebagaiSericocokopsis hildebrandtiiSchinz, tergolong dalam keluarga Amaranthaceae. Sampel daripadaCistanche deserticoladanCistanche tubulosatelah dikumpulkan dari Bandar Turpan dan Daerah Yutian di Wilayah Autonomi Uygur Xinjiang, masing-masing, dan telah disahkan oleh Profesor Pengfei Tu sebagai batang berair segarCistanche deserticolaYC Ma danCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Semua spesimen baucar disimpan di makmal kami.

Instrumen

Sistem HPLC Waters Arc

Baki elektronik Quintix125D-1CN (Sartorius, Beijing)

Olympus BX-50 mikroskop optik (Olympus, Jepun)

Pengimbas slaid panoramik NanoZoomer-SQ (Hamatsu Photonics, Jepun)

Pembersih ultrasonik digital KQ500DE (Alat Ultrasonik Kunshan, China)

Pengisar pengekstrakan DNA MM400 (Retsch, Jerman)

Penukar terma PCR (Analytik Jena, Jerman)

DYY-8C radas dan tangki elektroforesis (Kilang Alat Liuyi, Beijing)

Sistem pengimejan gel MINI Space 1000 (Tanon, Shanghai)

Inkubator suhu malar (Yiheng, Shanghai)

Reagen

Echinacoside (lot: DST191008-038), acteoside (DSTDL006101), isoacteoside (DST210601-060), D-mannitol (DSTDG006201) telah dibeli daripada Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubuloside A (MUST-15040115), 2'-acetylacteoside (MUST-15071504), betaine (MUST-23082505), D-glucose anhydrous (MUST-23030214), fruktosa (MUST-23031403), dan sukrosa (MUST-23082505) telah diperolehi daripada Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. Methanol (HPLCotrijer Ikan gred HPLCO., Ltd. gred, OCEANPAK), asid formik (gred HPLC, Reagen VOKA) semuanya mempunyai ketulenan kromatografi. Kit pengekstrakan DNA genomik tumbuhan (DP305, Tiangen Biotech, China) dan air ultratulen digunakan untuk analisis molekul.

Penyediaan, Pewarnaan, dan Pemerhatian Bahagian Batang Sukulen

Mengikut kaedah dalam rujukan [10], batang succulent Cistanche segar dipotong mengikut saiz yang sesuai dan diawet dalam fiksatif FAA (70% etanol: asid asetik glasier: formaldehid=90:5:5). Selepas mencuci dengan air yang mengalir untuk membuang sisa fiksatif, tisu dilembutkan dengan asid hidrofluorik, diwarnai dengan Safranin, dehidrasi, tertanam dalam parafin, dan dipotong. Selepas dipasang, slaid dibakar, parafin dicairkan, dan bahagian diwarnai dengan larutan Fast Green 95% etanol, kemudian dimeterai dengan resin neutral. Morfologi tisu diperhatikan di bawah mikroskop, dan bahagian yang terbentuk dengan baik diimbas menggunakan pengimbas panorama untuk mendapatkan imej resolusi tinggi.

Pengekstrakan DNA, Penguatan PCR dan Penjujukan

Jumlah DNA daripada sampel Cistanche dan akar tumbuhan perumah telah diekstrak menggunakan kit pengekstrakan DNA genomik tumbuhan (Tiangen), mengikut protokol pengeluar. Kepekatan DNA dan nisbah OD260/OD280 diukur dengan spektrofotometer UV mikrovolume untuk menilai kualiti sebelum meneruskan.

Penguatan PCR menyasarkan kawasan transkripsi dalaman spacer 2 (ITS2) DNA ribosom dan gen kloroplas psbA-trnH untuk pengenalpastian molekul [11]. Urutan primer adalah seperti berikut:

ITS2 ke hadapan: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 terbalik: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH ke hadapan: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH terbalik: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

Reaksi PCR (25 μL) termasuk 12.5 μL 2 × Taq Master Mix, 1 μL setiap primer ke hadapan dan belakang (2.5 μmol·L⁻¹), 2 μL templat DNA, dan 8.5 μL ddH₂O. Penguatan ITS2: 94 darjah 5 min; kemudian 35–40 kitaran 94 darjah 30 s, 56 darjah 30 s, 72 darjah 45 s; lanjutan akhir pada 72 darjah 10 min. amplifikasi psbA-trnH: 95 darjah 4 min; 35 kitaran 94 darjah 30 s, 55 darjah 1 min, 72 darjah 1 min; lanjutan akhir pada 72 darjah 10 min. Produk PCR dianalisis oleh elektroforesis gel, dan jalur sasaran tertakluk kepada penjujukan dua arah Sanger. Kromatogram jujukan dianalisis menggunakan CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA) untuk mendapatkan jujukan DNA sasaran, yang dikenal pasti menggunakan sistem kod bar DNA Materia Medica China dan analisis BLAST dalam pangkalan data GenBank. Pokok filogenetik telah dibina dengan perisian MEGA X untuk pengecaman spesies.

Penentuan Kuantitatif Lima Glikosida Phenylethanoid

Kandungan lima glikosida phenylethanoid ditentukan mengikut kaedah yang telah ditetapkan sebelum ini [13]. Penyediaan penyelesaian rujukan: timbang dengan tepat echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside, dan 2'-acetylacteoside, dan larutkan dalam 50% metanol untuk menyediakan larutan standard campuran kepekatan yang telah ditetapkan. Keadaan kromatografi: Lajur Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); fasa mudah alih A: asetonitril–metanol (6:1, v:v); fasa mudah alih B: 0.1% penimbal asid formik; elusi kecerunan: 0–5 min, 10%–18% A; 5–15 min, 18%–24% A; 15–20 min, 24%–26% A; 20–28 min, 26%–30% A; 28–35 min, 30%–35% A. Kadar aliran: 1.0 mL·min⁻¹; suhu lajur: 30 darjah; panjang gelombang pengesanan: 330 nm. Kaedah: menyuntik 10 μL setiap larutan piawai dan sampel ke dalam HPLC untuk dianalisis.

Penentuan Kuantitatif Betaine, Manitol, Fruktosa, Glukosa dan Sukrosa

Komponen ini dikira mengikut kaedah sebelumnya [14]. Penyelesaian rujukan: timbang betaine, manitol, fruktosa, glukosa dan sukrosa dengan tepat, larut dalam air untuk menyediakan larutan standard campuran. Penyelesaian sampel: cairkan larutan sampel Cistanche (disediakan seperti di atas) dengan 50% metanol kepada 1/5 kepekatan asal, gaul rata, dan tapis melalui membran mikroporous 0.22 μm. Keadaan kromatografi: Lajur Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); fasa mudah alih: asetonitril–air (77:23); kadar aliran: 0.7 mL·min⁻¹; suhu lajur: 25 darjah; pengesanan dengan pengesan serakan cahaya penyejatan (ELSD): suhu tiub hanyut 100 darjah , aliran gas pembawa 3 L·min⁻¹. Kuantifikasi dilakukan dengan menyuntik 5 μL dan 10 μL larutan piawai dan 5 μL larutan sampel, dan mengira kandungan menggunakan persamaan logaritma dua titik piawai luaran.

Penilaian Kesamaan Cap Jari

Penyelesaian sampel telah disediakan seperti yang diterangkan di atas, dan keadaan dan kaedah HPLC adalah sama seperti untuk kuantifikasi glikosida phenylethanoid. Data kromatografi telah diimport ke dalam "Sistem Penilaian Kesamaan Cap Jari Kromatografi Perubatan Cina Tradisional (Edisi 2012)". Kromatogram sampel K1 digunakan sebagai rujukan, dengan lima puncak glikosida phenylethanoid ditandakan untuk pembetulan berbilang titik, menghasilkan tindanan dan kromatogram rujukan, dan mengira persamaan cap jari.

 

 

Keputusan dan Analisis

1. Pengenalan Morfologi Cistanche

Spesimen Cistanche liar yang dikumpul di Kenya mempamerkan ciri morfologi yang tersendiri. Perbungaan adalah pancang, dengan satu bract yang panjang-ovate-berbentuk pisau pembedah, dan dua bracteoles kecil, kedua-dua belahnya adalah glabrous. Calyx adalah tiub, dengan lima lobus tumpul di puncak. Corolla adalah tubular-campanulate, berukuran 3-4 cm panjang, kira-kira 2.5 kali panjang kelopak, dengan lima lobus di puncak dan tepi melengkung. Corolla berwarna kuning (Rajah 1A, B), menjadi coklat apabila dikeringkan. Filamen adalah kira-kira 3 cm panjang, dengan beberapa bulu halus di pangkal. Gayanya lebih panjang sedikit daripada benang sari, dan stigmanya hampir berbentuk sfera, licin dan berbulu. Terdapat empat benang sari, dengan anter bujur telur panjang yang dilitupi padat dengan bulu bulu panjang; pangkal anter ditunjuk secara tiba-tiba. Ciri ini konsisten dengan penerangan tentangCistanche deserticoladansalsa cistanchedalam "Flora of China"; sebaliknya, asas anter daripadaCistanche tubulosaadalah tumpul dan bulat, yang membezakannya dengan jelas daripada spesies lain dalam genus yang sama [7].

Selain itu, kilang perumah,Sericocokopsis hildebrandtiiSchinz, adalah pokok renek yang banyak bercabang. Cawangan mudanya dilitupi padat dengan bulu kuning pucat atau bulu putih. Daun secara meluas spatulate-obovate dengan tapak yang sempit (Rajah 1D, E). Perbungaan berkelompok padat di sepanjang tangkai bunga, yang, bersama-sama dengan paksi perbungaan, diliputi bulu-bulu bulu putih kelabu atau kelabu pucat atau putih.

Batang berair Cistanche liar berbentuk silinder leper, dengan permukaan kuning pucat atau kecoklatan ditutupi padat dengan sisik berisi seperti jarum yang tersusun dalam barisan. Teksturnya padat, namun sedikit fleksibel (Rajah 2A). Keratan rentas batang berair berwarna kuning pucat atau keperangan, dengan berkas vaskular coklat pucat berselerak boleh dilihat dengan mata kasar (Rajah 2B). Di bawah mikroskop, berkas vaskular kelihatan berbentuk ovoid atau fusiform, terdiri daripada xilem dan floem, selalunya hadir sebagai berkas berselerak bersendirian atau dikumpulkan secara berpasangan atau trio, dengan berorientasikan floem dalam pelbagai arah (Rajah 2C, D). Menurut edisi 2025 Pharmacopoeia Cina, keratan rentasCistanche deserticolaberwarna kecoklatan, menampilkan berkas vaskular seperti titik coklat pucat yang disusun dalam gelang beralun, selalunya membentuk berkas anulus berlipat dalam; sebaliknya,Cistanche tubulosamemaparkan berkas vaskular seperti titik bertaburan, ciri membezakan utama untuk mengenal pasti kedua-dua jenis hirisan Cistanche ini [1]. Cistanche liar dari Kenya juga menunjukkan berkas vaskular seperti titik bertaburan dalam keratan rentas, selaras dengan ciri-ciriCistanche tubulosa.

 

 

Rajah 2 Rupa dan ciri keratan rentas tumbuhan Cistanche liar (K2) di Kenya. A: Rupa batang; B: Keratan rentas batang berisi; C: Bahagian parafin pada batang berdaging (pewarnaan hijau cepat safranin); D: Pandangan diperbesarkan berkas vaskular di bahagian parafin