Cistanche Deserticola Polysaccharides Mengurangkan Kemerosotan Kognitif Dan Meningkatkan Daya Ingatan dalam Tikus Model Penuaan

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRAK

Bukti terkini mencadangkan perubahan dalam paksi mikrobiota-otak usus boleh mendorong kemerosotan kognitif dengan penuaan. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa pentadbiran D-galaktosa yang berpanjangan kepada tikus menyebabkan penurunan kognitif, dysbiosis mikrob usus, keradangan periferal, dan tekanan oksidatif. Dalam model penurunan kognitif berkaitan usia ini, Cistanche deserticola polysaccharides (CDPS) meningkatkan fungsi kognitif dalam tikus yang dirawat galaktosa D dengan memulihkan homeostasis mikrob usus, dengan itu mengurangkan tekanan oksidatif dan keradangan periferal. Kesan berfaedah CDPS dalam tikus model penuaan ini telah dimansuhkan melalui ablasi gutmicrobiota dengan antibiotik atau imunosupresi dengan cyclophosphamide. Pemprofilan metabolomik serum menunjukkan bahawa tahap kreatinin, valine, L-metionin, o-Toluidine, N-etilanilin, asid urik, dan prolin telah diubah dalam model tikus penuaan, tetapi telah dipulihkan oleh CDPS. Penemuan ini menunjukkan bahawa CDPS meningkatkan fungsi kognitif dalam model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa pada tikus dengan memulihkan homeostasis paksi otak mikrobiota usus, yang mengurangkan ketidakseimbangan asid amino, keradangan periferal, dan tekanan oksidatif. Oleh itu, CDPS menunjukkan potensi terapeutik untuk pesakit yang mengalami gangguan ingatan dan pembelajaran, terutamanya yang berkaitan dengan dysbiosis gutmicrobial.

Cistancheherba

PENGENALAN

Pentadbiran D-galaktosa (D-gal) dan garam berilium yang berpanjangan mendorong penuaan dalam model haiwan eksperimen dan kultur sel primer in vitro dan digunakan untuk mengenal pasti mekanisme yang mendasari proses penuaan semula jadi [1-4]. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa penurunan kognitif dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa berkaitan dengan pengurangan tahap protein faktor pertumbuhan saraf (NGF) dan peningkatan spesies oksigen reaktif (ROS) dalam otak, yang kedua-duanya menyebabkan degenerasi neuron hippocampal dan mengurangkan. neurogenesis [3, 4]. Kajian terbaru juga menunjukkan bahawa komposisi dan bilangan mikrobiota usus manusia berubah dengan ketara semasa proses penuaan[5].

Cistanche deserticola adalah herba yang tumbuh terutamanya di kawasan gurun Utara-Barat China dan digunakan dalam perubatan tradisional Cina. Ia biasanya dikenali sebagai "ginseng padang pasir." Ekstrak cistanche deserticola mengandungi beberapa sebatian aktif secara farmakologi, termasuk glikosida phenylethanoid, iridoid, lignose, oligosakarida, polisakarida, dan asid amino; sebatian ini dikaitkan dengan sifat anti-radang, anti-oksidatif, anti-penuaan, neuroprotektif, dan imunomodulator [6, 7]. Sebagai contoh, polisakarida yang diekstrak daripada Cistanche deserticolahave telah digunakan dalam perubatan tradisional Cina untuk merawat kanser kolorektal [8]. Pelbagai polisakarida toksik lemah dengan bioaktiviti berguna telah diasingkan daripada beberapa organisma, seperti polisakarida Chuanqiong, polisakarida Ganoderma lucidum, dan polisakarida Lycium barbarum [9–11]. CDA 0.05 ialah galaktoglucan yang diasingkan daripada Cistanche deserticola yang menggalakkan pertumbuhan beberapa bakteria usus yang bermanfaat, termasuk beberapa spesies Bacteroides dan Lactobacillus [12].

Mekanisme asas proses penuaan normal juga terlibat dalam beberapa penyakit manusia seperti gangguan neurodegeneratif, aterosklerosis koronari, diabetes jenis 2 (T2DM), dan hipertensi [13, 14]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa perubahan dalam flora usus memainkan peranan penting dalam penuaan manusia [15]. Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa pentadbiran D-galaktosa yang berpanjangan dalam tikus eksperimen dan tikus meniru proses penuaan biasa dan merupakan model yang berguna untuk mengkaji fenotip berkaitan penuaan seperti penurunan kognisi [16]. Selain itu, tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa menunjukkan perubahan dalam komposisi mikrobiota usus [17]. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa perubahan dalam komposisi mikrobiota usus boleh menyebabkan penurunan kognitif dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh galaktosa D, dan menyiasat jika Cistanche deserticola polysaccharides (CDPS) boleh mengurangkan penurunan kognitif dengan memulihkan dysbiosis mikrobiota usus.

batang cistanche

KEPUTUSAN

Tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa menunjukkan penurunan kognitif dan dysbiosis mikrob usus

Kami menganalisis prestasi tingkah laku tikus jenis liar (WT) dan yang dirawat dengan 150 mg D-gal per Kg berat badan selama 2 bulan (model atau Mod) menggunakan pengecaman objek baru dan ujian Morris water maze (MWM). Nilai indeks keutamaan dalam ujian pengecaman objek novel telah dikurangkan dengan ketara dalam tikus kumpulan Mod berbanding tikus kumpulan WT (Rajah 1A, 1B). Keputusan ujian MWM menunjukkan bahawa masa latensi melarikan diri selepas hari keenam meningkat dengan ketara dalam kumpulan Mod berbanding kumpulan WT (Rajah 1C, 1D). Selain itu, lintasan platform sasaran dan masa berenang dalam kuadran sasaran telah dikurangkan dengan ketara dalam kumpulan Mod berbanding kumpulan WT (Rajah 1E, 1F). Keputusan ini menunjukkan penurunan ketara dalam kebolehan pembelajaran dan ingatan tikus model penuaan yang disebabkan oleh Undang-undang.

Kami kemudian menganalisis perbezaan dalam kelimpahan dan komposisi filum, genera, dan spesies mikrob usus dalam sampel tahi kumpulan Mod dan WT tikus menggunakan data penjujukan 16S ribosom RNA (rRNA) daripada sampel tahi. Flora usus utama dalam tikus kumpulan WT dan Mod ialah Firmicutes dan Bacteroides. Walau bagaimanapun, kelimpahan Bacteroides telah berkurangan dengan ketara dan kelimpahan Firmicutes meningkat dengan ketara dalam kumpulan Mod berbanding kumpulan WT (Rajah 2A). Seterusnya, kami melakukan analisis diskriminasi linear (LDA) untuk menentukan skor saiz kesan LDA (LEfSe) diikuti oleh ujian Kruskal-Wallis dan Wilcoxon untuk menilai kelimpahan relatif takson yang berbeza dalam tikus kumpulan WT dan Mod. Keputusan LDA ditunjukkan dalam Rajah 2B. Tambahan pula, kami membina kladogram yang menunjukkan pembezaan pengayaan pelbagai genera dan spesies kepunyaan Bacteriodes dan Firmicutes phyla dalam WT dan kumpulan model (Rajah 2C). Secara keseluruhan, keputusan kami menunjukkan keupayaan kognitif terjejas dan dysbiosis mikrob usus dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa.

manfaat kesihatan cistanche: anti-pengoksidaan

Rawatan CDPS meningkatkan keupayaan kognitif dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal

Kami menganalisis jika rawatan CDPS mengurangkan penurunan kognitif dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal. Semasa 2 bulan pentadbiran, berat badan diukur setiap hari. Berat badan model dan kumpulan CDPS tikus adalah serupa (Rajah 3A). Menjalankan eksperimen tingkah laku selepas dos terakhir. Pengecaman objek novel dan keputusan ujian maze air Morris menunjukkan bahawa ingatan jangka pendek jauh lebih tinggi dalam kumpulan CDPS tikus berbanding kumpulan model tikus; ingatan jangka panjang dalam kumpulan tikus CDPS adalah lebih tinggi tetapi secara statistik tidak signifikan berbanding dengan kumpulan model tikus (Rajah 3B, 3C). Ini mencadangkan bahawa rawatan CDPS membatalkan kehilangan ingatan pengecaman objek jangka pendek dalam tikus yang dirawat D-gal.

Pembelajaran spatial dan ingatan tikus ini telah dinilai oleh ujian maze air Morris, dan keputusan menunjukkan bahawa masa latensi melarikan diri kumpulan CDPS tikus adalah setanding dengan kumpulan tikus WT dan jauh lebih pendek daripada tikus kumpulan Mod (Rajah 3D) . Tambahan pula, masa latensi melarikan diri adalah jauh lebih rendah pada pentadbiran pasca CDPS hari keenam berbanding kumpulan model (Rajah 3E). Masa berenang dalam kuadran sasaran adalah lebih tinggi dalam kumpulan CH dan CM berbanding kumpulan model. Kumpulan CL lebih tinggi daripada kumpulan model tetapi tidak mempunyai kepentingan statistik (Rajah 3F). Selain itu, bilangan lintasan platform adalah lebih tinggi dalam kumpulan CM dan CL berbanding kumpulan model. Walau bagaimanapun, kumpulan CH lebih tinggi daripada kumpulan model dan tidak mempunyai kepentingan statistik (Rajah 3G). Keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan CDPS meningkatkan pembelajaran dan ingatan spatial dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal.

Rajah 1. Pentadbiran D-galaktosa yang berpanjangan mendorong pembelajaran dan kemerosotan ingatan pada tikus.

Rajah 2. Pemberian D-galaktosa yang berpanjangan mendorong disbiosis mikrob usus pada tikus.

Rawatan CDPS memulihkan homeostasis komposisi mikrobiota usus dalam tikus model penuaan D-galaktosa

Monosakarida dan polisakarida adalah nutrien penting yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteria [18-21]. Ia juga melaporkan bahawa CDPS mengawal komposisi mikrobiota usus [22]. Oleh itu, kami menganalisis jika rawatan CDPS mengurangkan dysbiosis mikrob usus dalam tikus kumpulan model dengan menilai data penjujukan rRNA 16S sampel najis daripada kumpulan tikus WT, model, dan CDPS.

Pertama, kami mengira indeks kepelbagaian alfa untuk menilai keseluruhan kekayaan mikrobiota tahi dan perbezaan struktur di kalangan kumpulan ini. Kami menganalisis indeks kepelbagaian alfa ( -kepelbagaian) seperti spesies yang diperhatikan, nilai indeks Shannon, Chao 1, ACE, dan Simpson untuk menentukan perubahan dalam komposisi pelbagai spesies bakteria dalam sampel najis kumpulan murin yang berbeza. Indeks kepelbagaian (spesies yang diperhatikan, indeks Shannon, Chao 1, ACE, dan Simpson) adalah lebih tinggi dalam kumpulan tikus WT dan CDPS berbanding kumpulan model, tetapi kepentingan statistik hanya diperhatikan untuk nilai indeks Chao 1 antara CM kumpulan dan kumpulan Mod. Ia menunjukkan bahawa pentadbiran dengan CDPS meningkatkan kekayaan mikrobiom (Rajah 4A-4E). Seterusnya, kami menganalisis indeks kepelbagaian untuk mengenal pasti perbezaan dalam spesies mikrob usus antara WT, model dan kumpulan CDPS tikus menggunakan Penskalaan Multidimensi Bukan Metrik (NMDS), Analisis Koordinat Utama (PCoA) dan Analisis Komponen Utama (PCA) . PCA menunjukkan variasi dalam komposisi mikrob usus bagi tikus kumpulan model semasa proses penuaan, termasuk pengurangan dimensi dan penyelenggaraan corak dan trend (Rajah 4F). Perbezaan dalam mikrobiota tahi antara kumpulan WT, model, dan CDPS telah dikenalpasti berdasarkan PCoA jarak UniFrac yang tidak berwajaran untuk gen rRNA 16S (Rajah 4G). Analisis pengelompokan menunjukkan perbezaan yang ketara dalam NMDS antara kumpulan model dan kumpulan WT dan CDPS (Rajah 4H).

Kami menilai 10 filum teratas mikrobiota usus dan mendapati bahawa kelimpahan phyla Bacteroides jauh lebih tinggi dalam kumpulan CH, CM, dan CL berbanding kumpulan model (Rajah 4I). Ini mencadangkan bahawa CDPS memulihkan homeostasis mikrobiota usus dalam tikus yang dirawat D-gal. Kladogram menunjukkan pengayaan pembezaan pelbagai genera dan spesies kepunyaan Bacteriodes dan Firmicutes phyla dalam WT, model, dan kumpulan CDPS (Rajah 4J). Seperti yang ditunjukkan dalam peta haba, rawatan CDPS mengurangkan kelimpahan relatif Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria tidak dikenal pasti, Fusobacteriia dan Elusimicrobia tidak dikenal pasti serta meningkatkan kelimpahan relatif Methanobacteria, Spirochaetia,Deltaproteobacteria, unidentified_Molliphacteresereia deferribacterie ,Erysipelotrichia dan tidak dikenal pasti_Cyanobacteria berbanding kumpulan model (Rajah 4K). Keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan CDPS memulihkan homeostasis mikrobiota usus dengan ketara dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal.

Rajah 3. Rawatan CDPS meningkatkan pembelajaran dan ingatan dalam tikus model penuaan D-gal.

Rawatan CDPS mengurangkan neurodegenerasi dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal dengan mengurangkan tekanan oksidatif

Kami seterusnya menganalisis kesan CDPS pada keradangan dengan menganalisis tahap serum sitokin pro-radang (IL-2 dan TNF-), dan sitokin anti-radang (IL-4 dan IL-10 ) dalam kumpulan tikus yang berbeza. Tahap serum IL-2 dan TNF- adalah jauh lebih rendah dan tahap serum IL-4 dan IL-10 adalah lebih tinggi dengan ketara dalam kumpulan CH, CM dan CL berbanding model kumpulan. Ia ditunjukkan bahawa CDPS mempunyai kesan anti-radang (Rajah 5A–5D).

Tekanan oksidatif disebabkan oleh peningkatan pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) dan merupakan salah satu faktor utama yang menggalakkan penuaan [23]. Oleh itu, kami menganalisis kesan CDPS pada tekanan oksidatif dalam model tikus penuaan yang disebabkan oleh D-gal dengan menilai tahap serum enzim antioksidan, SOD, dan produk peroksidasi lipid, malondialdehid (MDA). Tahap serum MDA adalah jauh lebih tinggi dan tahap serum SOD telah berkurangan dengan ketara dalam kumpulan Mod berbanding kumpulan WT, tetapi, rawatan CDPS membalikkan kesan ini (Rajah 5E, 5F). Keputusan ini menunjukkan bahawa tekanan oksidatif telah meningkat dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal, tetapi dikurangkan oleh rawatan CDPS.

Tambahan pula, kami menilai tahap tekanan oksidatif dalam tisu otak dengan menganalisis tahap produk protein teroksida lanjut (AOPP), peroksidasi lipid langsung (LPO), dan MDA serta aktiviti enzim antioksidan seperti glutation peroxidase (GSH-Px). ) dan superoksida dismutase (SOD) dalam homogenat tisu otak. Otak tikus kumpulan Mod menunjukkan aktiviti SOD dan GSH-PX yang berkurangan dengan ketara dan peningkatan tahap AOPP, LPO dan MDA dengan ketara berbanding kumpulan WT, tetapi kesan ini telah diterbalikkan dalam kumpulan CH, CM, dan CL (Rajah 6A- 6E).

Tambahan pula, kami melakukan pewarnaan histologi bahagian otak dengan pewarnaan H&E dan Nissl untuk menilai kesan perlindungan CDPS pada otak tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal. Tikus kumpulan Mod menunjukkan pengurangan ketara dalam bilangan dan volum neuron, peningkatan jurang antara neuron, susunan neuron yang tidak teratur, dan pyknosis nuklear di rantau hippocampus CA1 berbanding kumpulan WT, tetapi perubahan patologi ini dikurangkan dengan ketara oleh rawatan CDPS ( Rajah 6F). Keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan CDPS secara signifikan mengurangkan tekanan oksidatif dan patologi otak dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D gal.

Rajah 4. Rawatan CDPS memulihkan komposisi mikrob usus dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa.

Rawatan CDPS mengurangkan keradangan periferal dan tekanan oksidatif dengan mengekalkan homeostasis mikrob usus dalam tikus model yang disebabkan oleh D-gal

Seterusnya, kami menganalisis jika perubahan dalam komposisi mikrobiota usus dikaitkan dengan peningkatan keradangan periferal dan tekanan oksidatif semasa penuaan. Ke arah ini, kami menggunakan koktel tiga antibiotik (kumpulan ABX) atau cyclophosphamide (kumpulan Cy; lihat juga Bahan dan kaedah) untuk menghilangkan mikrobiota usus atau mendorong imunosupresi dalam tikus model penuaan yang dirawat CDPS. Rawatan antibiotik membatalkan kesan berfaedah rawatan CDPS dalam tikus model penuaan. Kami memerhatikan pembelajaran dan ingatan terjejas (Rajah 7A), dan perubahan dalam komposisi mikrobiota usus (Rajah 7B, 7C) dalam tikus kumpulan ABX berbanding kumpulan yang dirawat CDPS. Keputusan di atas menunjukkan bahawa walaupun pentadbiran CDPS tidak dapat meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan tikus selepas menukar flora usus. Selain itu, kami melihat peningkatan tahap sitokin pro-radang di dalam otak dan serum tikus kumpulan ABX berbanding kumpulan CDPS (Rajah 7D-7N). Keputusan kumpulan ABX dan kumpulan CY menunjukkan bahawa selepas flora usus dan fungsi imun dimusnahkan, walaupun pentadbiran CDPS tidak dapat meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan tikus. Keputusan ini mencadangkan bahawa rawatan CDPS mengurangkan keradangan periferi, tekanan oksidatif, dan penurunan kognitif dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh Undang-undang dengan menghalang dysbiosis usus.

Kami kemudian menggunakan ubat imunosupresif, cyclophosphamide [24] untuk menentukan peranan keradangan dalam kesan bermanfaat CDPS. Tikus CDPS yang dirawat Cyclophosphamide (Kumpulan Cy) menunjukkan keupayaan pembelajaran dan ingatan terjejas, perubahan dalam komposisi mikrobiota usus, dan tahap menyimpang sitokin pro-dan anti-radang dalam otak dan serum berbanding tikus kumpulan jenis liar dan CDPS. Walau bagaimanapun, tidak ada kepentingan berbanding dengan model dan kumpulan ABX. (Rajah 7A–7N). Data ini menunjukkan bahawa perubahan dalam komposisi mikrobiota usus meningkatkan keradangan periferal dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal.

Rajah 5. Rawatan CDPS memodulasi tahap pengedaran sitokin pro-dan anti-radang dan faktor-faktor berkaitan tekanan oksidatif dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa.

CDPS menghalang penuaan akibat D-gal dengan mengawal metabolisme asid amino

Sistem imun tuan rumah dipengaruhi oleh metabolit yang dihasilkan oleh mikrobiota usus [25]. Metabolit tahi mewakili bacaan berfungsi metabolisme mikrob usus dan komposisi mikrob usus [26]. Selain itu, metabolit mikrobiota usus memasuki peredaran darah dan memberi kesan kepada metabolisme dan kesihatan tuan rumah [26, 27]. Sebanyak 1058 metabolit telah dikenalpasti dalam sampel serum daripada tikus FWT, Mod, dan CDPS. Kemudian, kami menganalisis metabolit ini menggunakanBioCyc, Ensiklopedia Gen dan Genom Kyoto (KEGG), dan Pangkalan Data Metabolom Manusia (HMDB) dan mendapati bahawa 65 metabolit dinyatakan secara berbeza dalam kumpulan Mod berbanding kumpulan WT. Tambahan pula, kami mendapati bahawa tahap 8 metabolit (kreatinin, valine, L-(-)-Metionin, o-Toluidine, N Ethylaniline, asid urik, prolin, dan fenilalanin) berbeza dengan ketara antara kumpulan WT, Mod, dan CDPS. Analisis pengayaan laluan 8 metabolit ini menggunakan MetaboAnalyst [28, 29] menunjukkan bahawa metabolit ini berkaitan dengan metabolisme arginin, histidin, arginin, prolin dan purin (Rajah 8A, 8B). 7 metabolit berbeza kumpulan MOD dan kumpulan CDPS dalam kumpulan WT.

Kami kemudian menganalisis jika perubahan dalam metabolisme asid amino berkaitan dengan perubahan dalam komposisi mikrobiota usus. Kami memerhatikan bahawa 7 metabolit berbeza kumpulan WT, Mod, dan CDPS (kreatinin, valine, L-(-)-Methionine, o-Toluidine, N-Ethylaniline, asid urik, dan prolin) telah menurun dengan ketara dalam ABX, Cy, dan kumpulan Mod berbanding kumpulan WT dan CDPS. Selain itu, tidak ada kepentingan antara kumpulan ABX dan Cy (Rajah 8C). Akhirnya, untuk meneroka terdapat korelasi antara metabolisme perbezaan dan penyakit berkaitan penuaan lain. Kami menganalisis korelasi antara tujuh metabolit yang dinyatakan secara berbeza dan penyakit manusia menggunakan pangkalan data MetaboAnalyst dan mendapati metabolit ini dikaitkan dengan penyakit Alzheimer (p=0.00173; Rajah 8D, 8E). Secara keseluruhan, data ini mencadangkan bahawa CDPS melindungi daripada penuaan yang disebabkan oleh D-gal dengan mengawal metabolisme asid amino.

Rajah 6. Rawatan CDPS mengurangkan tekanan oksidatif dalam otak tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa

PERBINCANGAN

Penurunan progresif dalam fungsi kognitif adalah ciri ciri penuaan. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa rawatan CDPS secara signifikan meningkatkan pembelajaran dan ingatan dalam tikus model penuaan [30-33]. Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa rawatan CDPS meningkatkan fungsi kognitif dengan menghalang keradangan periferi dan tekanan oksidatif melalui pemulihan homeostasis mikrob usus dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal (Rajah 9). Tikus Sprague-Dawley yang diberi polisakarida Cistanche menunjukkan peningkatan pertumbuhan bakteria usus yang bermanfaat dan meningkatkan kepelbagaian mikrob usus [34]. CDA-0.05, polisakarida neutral Cistanche, meningkatkan pertumbuhan Lactobacilli probiotik [22]. Data ini mencadangkan bahawa polisakarida Cistanche meningkatkan homeostasis bakteria usus.

Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa CDPS mempunyai kesan anti-radang dan meningkatkan keupayaan kognitif tikus model penuaan dengan memodulasi banyak genera bakteria usus seperti Bacteroidetes, Firmicutes, dan Proteobacteria. Oleh itu, CDP mungkin bermanfaat secara terapeutik untuk penyakit berkaitan penuaan dengan membentuk semula komposisi mikrobiota usus [35,36]. Selain itu, kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa tahap sitokin radang dalam serum dan kolon dikaitkan dengan kelimpahan relatif genera bakteria seperti Bacteroidetes, Firmicutes, dan Proteobacteria [37, 38]. Tambahan pula, komposisi mikrob usus mengawal fungsi otak dengan memodulasi tahap peredaran beberapa sitokin [39-43]. Keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan CDPS mengurangkan kelimpahan relatif Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria tidak dikenal pasti, Fusobacteriia dan Elusimicrobia yang tidak dikenal pasti, dan meningkatkan kelimpahan relatif Methanobacteria, Spirochaetia,Deltaproteobacteria, unidentified_Deferribacteres, Nitlieroshaesteria, Nitrosophasteria, Nitlinophacteres. Erysipelotrichia, dan_Cyanobacteria yang tidak dikenali.

Metabolit mikrob usus dilepaskan ke dalam aliran darah dan mengawal kesihatan dan metabolisme tuan rumah [26, 27]. Metabolit mikrob usus boleh dianggarkan dengan menilai komposisi metabolit tahi, yang berubah dengan perubahan dalam komposisi mikrob usus [44]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa paras plasma citrulline, proline, arginine, asparagine, phenylalanine, dan threonine dikaitkan dengan gangguan neurodegenerative termasuk penyakit Alzheimer [45, 46]. Kajian kami menunjukkan bahawa tahap serum kreatinin, valine, L-metionin, o-Toluidine, N ethylaniline, asid urik, dan prolin dikaitkan dengan penuaan yang disebabkan oleh D-gal pada tikus.

Ekstrak cistanche: penyakit anti-Alzheimer

Lengan semula jadi dan adaptif sistem imun memainkan peranan penting dalam mengekalkan homeostasis hos-mikrob dalam permukaan luminal usus [47]. Mikrobiota usus juga memainkan peranan penting dalam mengawal sistem saraf pusat (CNS) dan imuniti dengan melepaskan sitokin dan metabolit ke dalam aliran darah [48, 49]. Sitokin pro-radang memainkan peranan penting dalam beberapa penyakit neurodegeneratif [50-52]. Sebagai contoh, degenerasi makula berkaitan usia (AMD) dan glaukoma dikaitkan dengan pengumpulan ekstraselular amiloid (A ) dan pemendapan intraselular tau hiperfosforilasi (p tau) dan besi dalam sel ganglion retina (RGC) [44]. Selain itu, keradangan memainkan peranan penting dalam patogenesis yang berkaitan dengan glaukoma [53]. Kerosakan penglihatan adalah gejala awal penyakit Alzheimer (AD) dan dimanifestasikan sebelum permulaan penurunan kognitif [54]. Kajian kami menunjukkan bahawa CDPS melindungi daripada penurunan kognitif dan keradangan periferi dengan mengekalkan homeostasis mikrobiota usus.

Terdapat beberapa batasan untuk kajian ini. Pertama, hubungan antara metabolisme asid amino dan komposisi mikrobiota usus tidak diketahui. Kedua, komposisi dan struktur molekul CDPS tidak diketahui. Oleh itu, kajian masa depan diperlukan untuk meneroka lebih lanjut peranan pengawalseliaan CDPS dalam mengurangkan AD melalui paksi isyarat mikrobiota-otak usus.

Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa CDPS meningkatkan keupayaan kognitif dalam tikus model penuaan yang disebabkan oleh D-gal dengan memulihkan homeostasis mikrobiota usus, dengan itu memulihkan ketidakseimbangan asid amino, keradangan periferal, dan tekanan oksidatif. Penemuan ini menunjukkan bahawa CDPS adalah terapeutik yang berpotensi untuk pesakit yang mengalami gangguan pembelajaran dan ingatan, terutamanya yang berkaitan dengan dysbiosis usus.

BAHAN DAN KAEDAH

Penyediaan CDPS

Kira-kira 1.0 Kg Cistanche deserticola yang telah dibersihkan telah dikeringkan di dalam ketuhar pada suhu 40 darjah C dan dilumatkan menjadi serbuk mentah. Serbuk diekstrak dalam etanol panas selama 3 jam. Sisa itu ditapis melalui kain kasa untuk mengeluarkan turasan dan kemudian dicairkan dengan air (8X) dan direfluks secara berurutan selama 2 jam, 1.5 jam, dan 1 jam pada suhu 90 darjah C. Pada setiap titik masa, larutan itu disentrifuge untuk mengasingkan supernatan dan digabungkan dengan turasan coklat-merah. Kemudian, turasan itu dipekatkan di bawah tekanan berkurangan, disejukkan ke suhu bilik, ditambah perlahan-lahan kepada 95 peratus etanol (3X), dan dibiarkan berdiri pada 4 darjah C selama 24 jam. Kemudian, larutan itu disentrifugasi pada 6000 r/min selama 20 minit pada 4 darjah C. Mendakan dikumpul selepas mengulangi pengekstrakan air dan pemendakan alkohol tiga kali. Mendakan telah disusun semula di dalam air, dinyahprotein, dialisis, dan dikeringkan beku untuk mendapatkan polisakarida Cistanche deserticola mentah (CDP). Kandungan polisakarida adalah lebih daripada 90 peratus seperti yang dinilai oleh spektrofotometri ultraungu.

ekstrak cistanche

Pengelompokan dan rawatan haiwan

Tikus Kunming jantan berusia lapan minggu (No. Lesen SCXK2019-0010) telah dibeli daripada SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, China), ditempatkan di dalam bilik terkawal cahaya dan suhu serta diberi makanan dan air. Semua eksperimen haiwan telah dijalankan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Perubatan Mongolia Dalam. Eksperimen telah dijalankan mengikut Panduan Institut Kesihatan Nasional (NIH) untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal.

Selepas 1 minggu penyesuaian kepada persekitaran baharu, 120 tikus dibahagikan kepada 7 kumpulan berikut: (1) kawalan jenis liar (WT); kumpulan model (150 mg/Kg/hari D-gal; Mod); (3) CH: D-gal ditambah 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal tambah 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal tambah 25 mg/kg CDPS; (6) Kumpulan ABX: antibiotik ditambah D-gal ditambah 50 mg/Kg CDPS; (7) Kumpulan Cy: cyclophosphamide ditambah D-gal ditambah 50mg/kg CDPS.

Tikus daripada kumpulan model, ABX, Cy dan CDPS menerima suntikan subkutaneus 150 mg/kg D-gal setiap hari selama 2 bulan. Kumpulan WT disuntik secara subkutan dengan jumlah garam yang sama selama 2 bulan. Tikus kumpulan CDPS juga diberikan setiap hari dengan suntikan intragastrik yang mengandungi 100 mg/kg, 50 mg/Kg atau 25 mg/Kg CDPS selama 2 bulan. Tikus kumpulan ABX menerima air minuman dengan 0.1 mg/mL ampicillin dan 0.5 mg/mL streptomycin selama 2 bulan sebagai tambahan kepada suntikan D-gal dan CDPS. Sebelum mentadbir D-gal, tikus menerima suntikan yang mengandungi 0.1 mg/mL ampicillin, 0.5 mg/mL streptomycin, dan 0.1 mg/mL colistin selama 7 hari dalam kumpulan ABX. Tikus kumpulan Cy menerima suntikan intraperitoneal 20 mg / Kg cyclophosphamide setiap hari (qod) selama 2 bulan sebagai tambahan kepada suntikan harian D-gal dan CDPS.

Ujian pengecaman objek novel

Menjalankan eksperimen tingkah laku selepas dos terakhir. Ujian pengecaman objek melibatkan peringkat suai kenal, latihan, dan ujian. Semasa peringkat suai kenal, tikus telah dibiasakan di dalam ruang ujian kosong selama 10 minit selama dua hari. Kemudian, pada hari ketiga (hari latihan), dua objek yang sama saiz, bentuk, dan warna (A1 dan A2) diletakkan pada bahagian yang bertentangan dengan ruang tersebut. Setiap tetikus kemudian diberi masa 10 minit untuk meneroka dua objek yang serupa. Selepas 1-jam(pada hari ketiga) dan 24-jam (pada hari keempat) selang latihan-ke-ujian, salah satu objek yang serupa (A1 atau A2) telah digantikan dengan B atau C objek yang berbeza dari segi saiz, warna dan bentuk pada hari ujian. Semasa peringkat ujian, setiap tetikus telah diuji selama 5 minit dan indeks keutamaan dikira untuk menentukan memori pengecaman objek baru (B atau C) menggunakan formula berikut: Indeks keutamaan=Masa pada objek B atau C/ (Masa pada objek B atau C tambah Masa pada objek A)×100 peratus .

Ujian labirin air Morris

Ujian maze air Morris dilakukan di dalam kolam bulat yang mempunyai kedalaman 45 cm dan diameter 90 cm. Protokol yang diterangkan oleh Ruediger S, et al. (2011) [55] dan Wood RA, et al. (2018) [56] telah bekerja di sini. Kedalaman air di kolam adalah 30 cm, dan suhu air ialah 20±1 darjah C. Platform adalah diameter 6 cm dan 1 cm di bawah air. Masa untuk latihan dan ujian ialah 60 saat setiap satu. Untuk latihan, kami menjalankan empat percubaan selama 60 saat setiap satu dengan platform tersembunyi setiap hari selama lima hari berterusan. Jika platform tidak ditemui oleh tikus dalam 60 s, mereka dibimbing ke platform dan diletakkan di atas platform selama 5 s. Semasa peringkat ujian, kependaman untuk mencapai platform tersembunyi dalam sesi latihan dan percubaan siasatan, bilangan lintasan ke lokasi platform yang dialih keluar dan masa yang dihabiskan dalam kuadran sasaran (platform) telah direkodkan dan dianalisis.

ujian ELISA

Tahap serum sitokin pro-radang seperti IL-2(), IL-4, IL-10 dan TNF- telah dianalisis untuk setiap kumpulan tikus menggunakan kit ELISA yang dibeli dari Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd.(Shanghai, China) mengikut arahan pengeluar. Aktiviti enzim antioksidan, superoksida dismutase (SOD), dan tahap produk peroksidasi lipid, malondialdehid (MDA), dalam serum setiap kumpulan tikus telah dianalisis oleh kit ujian yang dibeli dari Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng (Nanjing, China) . Tahap produk protein pengoksidaan lanjutan (AOPP) dalam sampel hippocampus murine dianggarkan menggunakan kit ELISA daripada Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd.(Shanghai, China) mengikut arahan pengilang.

Anggaran tekanan oksidatif dalam otak murine

Kami menghomogenkan 100 mg tisu hippocampus dengan 0.9 ml garam sejuk ais dan homogenat disentrifugasi pada 12000 rpm selama 30 minit pada 4 darjah C. Kandungan protein dalam supernatan dianalisis menggunakan Kit Assay Protein BCA ( Bioteknologi Beyotime, Shanghai, China). Tahap peroksidasi lipid (LPO) dan malondialdehid (MDA), dan aktiviti GSH-Px dan SOD dalam sampel hippocampus telah dianalisis dengan kolorimetri menggunakan kit dari Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng (Nanjing, China) mengikut arahan pengilang.

Suplemen cistanche: meningkatkan daya ingatan

Komposisi mikrobiota usus

Sampel najis dikumpul daripada semua tikus dan segera disimpan pada -80 darjah C. Rantau V3 ditambah V4 gen rRNA 16S telah disusun menggunakan Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, China) dan dianalisis menggunakan QIIME platform terbuka untuk menentukan profil mikrobiota usus.

Analisis LC/MS metabolit serum

Sampel serum diinkubasi selama 1{12}} minit dengan metanol prasejuk dalam nisbah 1: 3 untuk memendakan protein. Sampel telah disentrifugasi pada 12000r/min selama 15 minit pada 4 darjah C. Supernatan dianalisis oleh Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography dan spektrum jisim QExactive. Keadaan kromatografi ditunjukkan dalam Jadual 1. Analit diasingkan dalam lajur kromatografi XBridge BEH Amide (2.1×100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) menggunakan 0.1 peratus asid formik dan asetonitril sebagai fasa mudah alih A dan B , masing-masing. Kadar alir ditetapkan pada 0.4 ml/min, isipadu suntikan ialah 5 µl, dan suhu lajur ditetapkan pada 25 darjah C (Jadual 1). Isyarat spektrum jisim diperoleh menggunakan mod pengimbasan ion positif dan negatif. Voltan semburan ion dan parameter MS khusus lain ditunjukkan dalam Jadual 2.

Analisis statistik

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 dan hlm< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">