Analisis Komponen Terserap dalam Plasma Tikus selepas Pentadbiran Oral Fraksi Estrogen Kuasi Cistanche

Analisis Komponen Terserap dalam Plasma Tikus selepas Pentadbiran Oral Fraksi Estrogen Kuasi Cistanche

Untuk maklumat lanjut: Ali.ma@wecistanche.com

Klik untuk memberi manfaat dan kesan sampingan

Abstrak:

Untuk menganalisis dan mengenal pasti juzuk dalam plasma tikus selepas pemberian oral bagi pecahan aktifcistanche, komponen dalam plasma tikus telah dikesan oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi-pengionan electrospray-quadrupole-masa spektrometri jisim penerbangan (HPLC-Q-TOF MS)． Struktur komponen telah dijelaskan dengan membandingkan masa pengekalan mereka dan spektrum MS / MS dengan sebatian rujukan dan data yang dilaporkan dalam literatur． 13 komposisi kimia dikenal pasti, termasuk 6 komponen prototaip, seperti asid Geniposidic, Salidroside,Cistanoside A, Echinacoside, Acteoside, Cistanoside D,7 komponen metabolit, seperti 3,4-Dihydroxyphenylethanol glycosides, metilasi acteoside, asetilasi Cistanoside G,3,4-Dihydroxyphenylethanol, acetyl tubuloside B, Cistanoside B glucuronide metabolit and metilasi-3,4 Dihydroxyphenylethanol. Hasilnya boleh memberikan data penting untuk menerangi asas terapeutik aktiviti pengawalan separa estrogencistanche．

Kata kunci:

cistanche; ubat yang mengandungi serum; kuasi estrogen; kromatografi cecair berprestasi tinggi-pengionan electrospray-quadrupole-masa spektrometri jisim penerbangan (HPLC-Q-TOFMS)

Cistanche deserticolaialah tumbuhan parasit di akar pokok padang pasir (seperti haloxylon ammodendron, tamarix, dll.). Sebagai sejenis ubat tradisional Cina yang berkhasiat dan berharga, ia mempunyai pelbagai kesan farmakologi seperti buah pinggang Yang berkhasiat, mengawal imuniti, melambatkan penuaan, anti-radiasi dan melindungi sistem saraf pusat. Ia dikenali sebagai "ginseng padang pasir". Pada masa ini, kebanyakan kajian mengenai aktiviti c. deserticola di dalam dan di luar negara adalah terhad kepada penilaian aktiviti farmakologi, manakala asas bahan farmakodinamiknya belum dijelaskan, yang secara serius menghalang pembangunan dan penggunaan rasionalCistanche deserticola.

Komponen perubatan Tradisional Cina adalah kompleks dan pelbagai, dan hanya selepas pentadbiran yang betul melalui penyerapan dan metabolisme dalam badan boleh komponen akhirnya memasuki darah untuk menjadi asas bahan farmakodinamik perubatan tradisional Cina. Bahan-bahan aktif ini mungkin prototaip atau metabolit perubatan Cina TRADISIONAL, atau ia mungkin bahan-bahan baru yang dibentuk oleh tindak balas bersama pelbagai komponen dalam perubatan Cina tradisional, atau ia mungkin bahan aktif fisiologi endogen yang dihasilkan oleh tindakan langsung ubat-ubatan. pada badan. Oleh itu, komponen darah ini boleh mewakili asas bahan farmakodinamik perubatan Cina Tradisional dan ubat kompaun. Menganalisis komponen dan metabolit yang boleh memasuki darah selepas pemberian oral, dan mencari peraturan interaksi komponen, boleh menyediakan asas tertentu untuk penyelidikan asas bahan farmakodinamik.

Kaedah penambahan berat rahim tikus dan kolorimetri MTT digunakan untuk menyaring bahagian aktif seperti estrogen dan dos cistanche deserticola. Keputusan percubaan awal menunjukkan bahawa pekali rahim tikus yang tidak matang telah meningkat dengan ketara oleh pentadbiran intragastrik etanol (95 peratus) ekstrak cistanche deserticola pada 30 g /kg sehari, dan serum yang mengandungi ubat menggalakkan percambahan. daripada sel McF-7 dengan ketara (P < 0.="" 01),="" yang="" merupakan="" bahagian="" aktif="" kesan="" seperti="" estrogen="" cistanche="">

Dalam kajian ini, spektrometri jisim masa penerbangan kromatografi cecair berprestasi tinggi-quadrupole (HPLC-Q-TOF MS) digunakan untuk menganalisis dan mengenal pasti komponen darah, komponen prototaip, dan metabolit bahagian aktif cistanche selepas pentadbiran cistanche dengan estrogen, dan untuk membuat spekulasi laluan metabolik, untuk menyediakan asas untuk penyelidikan asas mengenai bahan farmakodinamik cistanche dengan estrogen.

1 Bahagian eksperimen

1.1 Instrumen dan reagen

Air-600 Kromatografi cecair: Waters Co., LTD., dilengkapi dengan pam kecerunan empat elemen, pensampel automatik, mesin penyahgas vakum, kotak suhu lajur, pengesan DAD, Memperkasakan stesen kerja kimia;

Agilent-1290 6530 siri Q-TOF LC-MS spektrometer jisim: produk syarikat American Agilent;

Xw-80adun vorteks: Shanghai Yugong Machinery Co., LTD.

Dk-80 Mandian air termostatik elektrik: Shanghai Yiheng Technology Co., LTD.

Alc-110. 4 Imbangan analisis: Shanghai Renhe Scientific Instrument Co., LTD.

Pengayun ultrasonik H66MC: Ohaus Technology Co., LTD.

Cistanche deserticola: dibeli dari pasaran herba perubatan San Ke Shu, yang dikenal pasti sebagai Cistanche deserticola oleh Profesor Zhang Delian dari Harbin Commercial University.;

Mullein (No. Kelompok 111530-200505), echinoside (No. kelompok 111670-200503), salidroside (No. kelompok 110736-200628): semuanya disediakan oleh Institut Kawalan Produk Farmaseutikal dan Biologi China Kebangsaan ;

Etilena stilbestrol: Guangzhou Hampden Pharmaceutical Co., LTD. Metanol dan asetonitril: gred HPLC, produk Shandong Yuwang Reagent Co., LTD. Reagen lain adalah tulen analitik.

Air eksperimen: air tulen.

Tikus Wistar betina: Nombor kelompok SCXK-(JI) 2003 -- 2004, berat (220 ± 20) g, disediakan oleh Pusat Haiwan percubaan Pangkalan Industri Biologi Kebangsaan Changchun.

1.2 Penyediaan larutan ubat intragastrik

Serbuk mentah cistanche deserticola diekstrak melalui pengekstrakan refluks dengan 95 peratus etanol, dan kemudian diekstrak dengan 8 kali pelarut selama 150 minit, 6 kali pelarut selama 75 minit, dan 6 kali pelarut selama 75 minit berturut-turut. Kemudian, ketiga-tiga ekstrak itu digabungkan dan dipekatkan di bawah tekanan untuk mendapatkan ekstrak, yang disimpan di dalam peti sejuk untuk kegunaan kemudian. Sebelum digunakan, air suling digunakan untuk menyediakan larutan intragastrik dengan kepekatan 1.5 g / mL.

1.3 Penyediaan penyelesaian rujukan

Sejumlah mullein, salidroside dan echinacoside yang tepat telah diambil dan dilarutkan sepenuhnya dalam metanol untuk menyediakan 1 mL larutan kontras campuran, setiap satu mengandungi 0.2 mg daripada tiga bahan rujukan. Letakkan larutan bahan rujukan melalui 0.45 μm membran penapis, dan ketepikan.

1.4 Penyediaan serum berubat dan serum kosong

Penyediaan serum yang mengandungi ubat: timbang tikus Wistar betina, beri mereka 1 mL /100 g setiap hari, masing-masing, beri mereka air suling dan larutan gavage dua kali pada waktu pagi dan petang, selama 3 hari berturut-turut, 60 minit selepas dos terakhir, bius dengan 2 mL /kg 10 peratus kloral hidrat melalui suntikan intraperitoneal. Darah diambil dari vena portal hepatik dan disentrifugasi pada 3 000 r /min selama 10 minit selepas pembekuan penuh. Supernatan itu kemudiannya merupakan serum yang mengandungi dadah.

Penyediaan serum kosong: tikus adalah intragastrik dengan jumlah air suling yang sama setiap hari, dan kaedah penyediaan lain adalah sama seperti serum yang mengandungi ubat.

mL serum yang mengandungi ubat telah diambil, 5 kali jumlah metanol ditambah, dan vorteks dijalankan dalam tiub emparan selama 10 min. Emparan dilakukan pada 14 000 r /min selama 10 min, dan supernatan diserap, dan pelarut dikeringkan. 0.5 mL metanol ditambah dengan mikropipet untuk melarutkan sisa. Sisa itu ditapis oleh membran mikroporous 0. 22 μm dan dianalisis dengan kromatografi.

1.5 Keadaan eksperimen

Keadaan kromatografi: Lajur RP18 Waters Symmetry ShieldTM (4.6 mm × 250 mm × 5 μm); Lajur pra: Nova - Pengawal PakC18 - PakTM; Kadar aliran: 0.5 mL/min; Isipadu suntikan:10 μL; Fasa mudah alih: asetonitril-0.2 peratus larutan akueus asid format; Keadaan kecerunan: 0-35 min, 5 peratus -34 peratus asetonitril, 35-65 min, 24 peratus -26 peratus asetonitril; Suhu lajur: 30 darjah ; Panjang gelombang pengesanan: 254 nm.

Sumber ion bersyarat spektrometri jisim: Sumber pengionan elektrospray tekanan atmosfera (ESI); Kadar aliran: {{0}}.5 mL/min; Tekanan gas pengabusan: 0.2 MPa; Kadar aliran gas kering :8. 0 L/min; Suhu kering: 30 darjah; Voltan kapilari: 3.5 kV; Kadar aliran gas sarung: 12.0 L/min; Suhu sarung: 400 darjah. Mod pengimbasan ion positif dan negatif dipilih dan julat pengimbasan jisim ialah m/z 100 ~ 3 000.

2 Keputusan dan Perbincangan

2.1 Analisis HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS bagi juzuk kimia dalam serum bahagian aktif estrogen Cistanche deserticola

Analisis kualitatif dilakukan ke atas sampel serum yang mengandungi dadah daripada tikus di bahagian aktif estrogen Cistanche deserticola oleh pengesan ESI-MS. Mod ion positif dan mod ion negatif digunakan untuk pengimbasan masing-masing, dan keputusan ditunjukkan dalam Rajah 1. Dengan membandingkan rajah aliran ion jumlah spektrometri jisim peringkat pertama bagi dua mod pengimbasan dalam Rajah 1, didapati jumlah ion aliran yang diperolehi dalam mod ion negatif mempunyai ciri yang kuat dan kepekaan yang tinggi, maka pengimbasan mod ion negatif telah dipilih dalam eksperimen ini.

Dalam mod ion negatif, pengesan esI-MS digunakan untuk menjalankan analisis kualitatif serum tikus selepas pentadbiran bahagian aktif estrogen Cistanche deserticola. Melalui analisis perbandingan gambar rajah aliran jumlah ion pengimbasan peringkat pertama serum kosong dan serum pentadbiran, sejumlah 13 puncak ion molekul telah ditanda, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2. Puncak 2, 3, 5, 7, 9 dan 10 diandaikan menjadi komponen prototaip, dan puncak 1, 4, 6, 8, 11, 12 dan 13 diandaikan sebagai komponen metabolik.

Menurut puncak ion molekul yang dikesan oleh setiap puncak kromatografi dalam mod ion negatif dan berat molekul relatif yang diberikan oleh serpihan ciri yang sepadan, sejumlah 13 ms puncak telah ditanda. Juzuk kimia 13 puncak dikenal pasti dengan membandingkan maklumat UV-MS setiap bahan standard dan merujuk kepada komponen yang dilaporkan dalam kesusasteraan, yang disenaraikan dalam Jadual 1.

Enam komponen prototaip ialah geniposide, salidroside, Cistanche glycoside a, Echinacea glycoside, Mullein glycoside, dan Cistanche glycoside D;

Tujuh komponen metabolik ialah 3,4-dihydroxy phenyl ethanol glycoside, methylated Mullein glycoside, acetylated Cistanche glycoside g, 3,4-dihydroxy phenyl ethanol, acetyl tubuloside B, Cistanche glycoside B metabolit asid glukuronik dan metilasi{{ 4}},4-dihidroksi fenil etanol. Di antara tujuh metabolit, adalah spekulasi bahawa puncak 1 (3,4-dihydroxyphenylethanol), puncak 8 (3,4-dihydroxyphenylethanol) dan puncak 13 (methylated 3,4-dihydroxyphenylethanol glycoside) adalah serpihan hidrolitik phenylethanol glycosides dalam Cistanche deserticola; Puncak 4 (methylated Mullein glycoside) ialah metabolit Mullein glycoside; Puncak 6 (Acetylated Cistanche glycoside g) ialah metabolit Cistanche glycoside G; Puncak 11 (acetyl guanosine b) ialah metabolit guanosine B; Puncak 12 (metabolit asid glukonik bagi Cistanche glycoside b) ialah metabolit bagi Cistanche glycoside B.

Aksara Cina meluaskan penjelasan:

质谱信息 mewakili maklumat spektrum jisim.

相对分子质量 mewakili jisim molekul relatif

化合物推测结果 mewakili keputusan spekulasi Kompaun

代谢 mewakili komponen metabolik

原型 mewakili komponen prototaip

2.2 Perbincangan

Dalam eksperimen ini, hplc-q-tof MS digunakan untuk mengenal pasti 13 puncak kromatografi utama dalam serum selepas pentadbiran estrogen seperti bahagian aktif Cistanche deserticola. Ini mungkin bahan bertindak langsung Cistanche deserticola in vivo. Pada masa yang sama, ia juga mencerminkan bahawa keberkesanan perubatan tradisional Cina adalah hasil daripada penyelarasan pelbagai komponen, saling melengkapi atau sekatan. Dengan menganalisis 13 komponen peralihan dalam darah, terbukti bahawa glikosida fenil etanol adalah komponen aktif utama Cistanche deserticola. Dalam kajian susulan, hubungan kesan spektrum yang sepadan akan diwujudkan untuk mengkaji korelasi kesan ubat, untuk menjelaskan lagi asas bahan kesan ubat, dan mewujudkan hubungan dos, masa dan kesan pelbagai komponen pada masa yang berbeza. titik dalam badan, supaya mendedahkan laluan metabolik dan mod metabolik Cistanche deserticola.

3 Kesimpulan

Dalam eksperimen ini, teknologi hplc-esi-q-tof MS / MS digunakan untuk menganalisis komponen darah estrogen seperti bahagian aktif Cistanche deserticola, dan 13 komponen kimia telah dikenal pasti, yang sangat penting untuk menjelaskan asas bahan farmakodinamik. daripada estrogen seperti komponen aktif Cistanche deserticola dan juga boleh menyediakan asas yang boleh dipercayai untuk penyelidikan lanjut dan ubat klinikal Cistanche deserticola.