Kesan Apoptotik Polisakarida Cistanche Pada Leukemia

Pengarang:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Mongolia Dalam, China

Untuk menyiasat kesan apoptosis bagiPolisakarida cistanche( CDP) pada manusialeukemia akutsel baris sel Jurkat．KaedahUjian MTT digunakan untuk mengesan kesan CDP pada percambahan sel, Western blotting digunakan untuk mengesan pengaktifan caspase-9 dan caspase-3, dan molekul isyarat apoptosis juga telah diuji.ＲhasilProliferasi sel T telah dihalang oleh 1 mg / ml dan 2 mg / ml CDP, Apoptosis sel T telah diinduksi oleh 5 mg / ml CDP, danungkapan pro-caspase-9 dan pro-caspase-3 telah dikurangkan dengan ketara． Ekspresi reseptor permukaan sel CD45 dan CD71 telah dihalang dengan ketara oleh 5 mg / ml CDP, Fosforilasi EＲK telah diinduksi, dan fosforilasi JNK telah dihalang．

Kesimpulan

【Kata kunci】Polisakarida cistanche; Apoptosis; Ｒreseptor; caspase-9; caspase-3

Leukemia limfoblastik akut (ALL) ialah penyakit klon malignan sistem limfa dengan tahap heterogeniti imunofenotip yang tinggi. , mudah berulang, dan sebagainya. Pada masa ini, kaedah rawatan yang biasa digunakan termasuk pemindahan sumsum tulang, terapi induksi, imunoterapi, kemoterapi gabungan, dll. Disebabkan oleh keupayaan terhad kebanyakan ubat kemoterapi untuk menyasar dan membunuh tumor, ia boleh menyebabkan kerosakan serius pada sistem pencernaan, sistem darah, kardiovaskular dan serebrovaskular, dsb. Semasa menerima rawatan, ia sering disertai dengan tindak balas buruk yang besar, malah ada yang membawa maut. Apabila kemoterapi berlangsung, badan cenderung untuk membangunkan toleransi terhadap ubat kemoterapi, meningkatkan risiko penyakit berulang.

Oleh itu, pencarian terapi leukemia atau terapi pembantu yang sangat berkesan, ketoksikan rendah, dan sangat disasarkan telah menjadi tumpuan perhatian semasa.Cistanchedipanggil Chagangaoya dalam bahasa Mongolia. Ia tergolong dalam keluarga Ledangaceae dan genus Cistanche. Ia bersifat parasit pada akar pokok padang pasir dan mempunyai reputasi "ginseng padang pasir".

Bahan aktif utama Cistanche termasuk glikosida phenylethanoid, lignan, betain, sterol, asid amino, dan polisakarida. Anti-radang, antivirus, antioksidan, peraturan imun dan kesan lain.

Kajian mendapati bahawaPolisakarida cistanche (CDP),sebagai salah satu komponen aktif utamanya,mempunyai kesan anti-tumor dan imunomodulator.Para penyelidik mendapati bahawa CDP mempunyai kesan membunuh yang ketara pada sel leukemia K562 dan THP-1, dan mencadangkan bahawa CDP mempunyai peranan tertentu dalampencegahan atau rawatan leukemia. Di samping itu, dalam sebatian perubatan Cina tradisional, cistanche, untuk rawatan akutleukemia, Cistanchejuga memainkan peranan sebagai salah satu komponen penting. Walau bagaimanapun, mekanisme tindakan khusus bagiCistanchetidak diketahui. Dalam makalah ini, pengasingan dan pemurnianCDP Cistanchetelah dikaji, dan kesan pembunuhan dan mekanisme berkaitan CDP pada saluran sel leukemia akut manusia Jurkat telah disiasat.

1.1 Reagen dan instrumen utama

Serbuk cistanche dibeli dari Sichuan WecistancheGroup Co, Ltd., saluran sel leukemia akut manusia Jurkat dibeli daripada bank sel Institut Biologi Sel Shanghai, thiazole blue (MTT) dan sodium dodecyl sulfate (SDS) dibeli daripada Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., serum lembu janin (FBS) telah dibeli daripada Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., caspase yang mengandungi sistein-3, caspase-9, CD71, CD45, kinase terminal amino c-Jun berfosforilasi (p -JNK) dan antibodi kinase terkawal isyarat ekstraselular (p-ERK) terfosforilasi telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel, Amerika Syarikat, dan antibodi aktin dibeli daripada Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Elektrokimia Substrat luminescence (ECL) dibeli daripada Thermo Syarikat Saintifik Amerika Syarikat, dan reagen lain adalah gred analisis domestik. Stesen kerja imej pintar Gel-View 6000 plus (produk Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), mikroskop pendarfluor terbalik Revolve FL (produk Echo Laboratories, Amerika Syarikat), pembaca plat mikro EPOCH (produk Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd.).

1.2 Pengasingan dan penulenan CDP Ambil 500 gSerbuk ekstrak cistanche, rendam dalam 95 peratus etanol semalaman, tapis dengan kain kasa, kumpulkan sisa penapis, rebus dengan air panas pada suhu 60 darjah selama 2 jam/masa, sebanyak 3 kali. Selepas akhir, turasan digabungkan tiga kali, tertumpu di bawah tekanan yang dikurangkan kepada 2/3 daripada isipadu asal, ditambah 3 kali ganda isipadu etanol 95 peratus, dan dibiarkan berdiri pada 4 darjah semalaman. Keesokan harinya, sentrifuge pada 4 000 r/min selama 10 minit, kumpulkan mendakan, keluarkan protein dengan kaedah Sevag, mendakan dengan etanol mutlak, beku-keringkan untuk mendapatkan CDP.

1.3 Kultur sel Talian sel leukemia akut manusia telah disimpan dalam nitrogen cecair di makmal Jurkat. Apabila digunakan, sel-sel telah pulih dengan cepat dalam mandi air 37 darjah dan dibiakkan dalam medium RPMI1640 (mengandungi 100 U/ml penisilin dan 100 U/ml streptomycins) dengan 10 peratus FBS. Sel-sel telah dibiakkan dalam inkubator sel CO2 37 darjah, 5 peratus, dilalui setiap 2 hingga 3 hari, dan eksperimen dijalankan apabila sel memasuki fasa pertumbuhan logaritma.

1.4 Eksperimen MTT Sel Jurkat dalam fasa pertumbuhan logaritma telah diambil, disentrifugasi untuk mendapatkan pelet sel, dan dikira pada 5×105 sel/ml. Ambil 96-plat kultur sel telaga, inokulasi 100 sel ul dalam setiap telaga, dan kemudian tambahkan 100 ul medium lengkap RP-MI1640 sebagai kumpulan kawalan; kumpulan eksperimen dibahagikan kepada 3 kumpulan, pertama menggunakan medium RPMI1640 untuk menyediakan kepekatan CDP yang berbeza, dan kemudian menambah 100 ul medium RP-MI1640 ke setiap telaga. Sel ul Jurkat dan larutan 100 ul CDP digunakan untuk membuat kepekatan akhir CDP pada 1, 2, dan 5 mg/ml, masing-masing. Setiap kumpulan telah disediakan dengan 5 telaga pendua dan diinkubasi dalam inkubator sel 37 darjah selama 48 jam. Selepas pengeraman, tambah 20 ul MTT (kepekatan larutan stok ialah 5 mg/ml) ke dalam setiap telaga, masukkan semula ke dalam inkubator sel, dan teruskan mengeram selama 4 jam, dan akhir sekali tambah 100 ul 20 peratus SDS untuk melarutkan formazan pada 37 darjah semalaman, dan menggunakannya pada keesokan harinya. Penyerapan pada 570 nm setiap kumpulan telah dikesan oleh pembaca plat mikro, dan kadar perencatan kepekatan CDP yang berbeza pada percambahan sel Jurkat dikira dengan formula.

1.5 Sel-sel Jurkat blotting Barat dalam fasa pertumbuhan logaritma telah diambil dan disemai dalam 6-plat perigi pada ketumpatan 2 × 105 sel/ml, 500 ul/telaga, dan medium lengkap 500 ul RPMI1640 telah ditambah pada kawalan kumpulan. Sediakan 3 kumpulan eksperimen, 1, 2, dan 5 mg/ml kumpulan rawatan polisakarida, CDP

Dilarutkan dalam medium lengkap RPMI1640 terlebih dahulu, 500 ul sel dan 500 ul larutan CDP dengan kepekatan berbeza telah ditambahkan pada 6-plat perigi dan diinkubasi pada 37 darjah selama 48 jam. Selepas kultur, penggantungan sel setiap kumpulan dikumpul, disentrifugasi pada 1 500 r/min selama 5 minit untuk mendapatkan pelet sel, dan dibasuh dua kali dengan salin penimbal fosfat (PBS) yang telah disejukkan sebelumnya. Selepas mencuci, 20 ul penimbal lisis sel telah ditambah kepada setiap kumpulan, dan sel-sel telah dilisiskan pada ais selama 30 minit. Jumlah protein telah diekstrak dan kepekatan sel telah diselaraskan menggunakan kaedah Bradford. 20 ug protein telah diambil dari setiap kumpulan untuk elektroforesis gel SDS-polyacrylamide (PAGE), dan protein dipindahkan ke membran polyvinylidene fluoride (PVDF) melalui elektroporasi. Disekat dengan susu tepung tanpa lemak pada suhu bilik selama 1 jam, tambah antibodi caspase anti-manusia arnab-3 dan caspase-9 pada nisbah pencairan 1:1 000, diinkubasi pada suhu bilik selama 1 h, dibilas 3 kali dengan penggoncang fosfat Tween buffer (PBST) ( 10 min/masa), tambahkan antibodi sekunder berlabel lobak pedas peroksidase (HRP) (1:1 000), inkubasi selama 1 jam pada suhu bilik, bilas 3 kali dengan PBST, bilas 1 kali dengan PBS, tambah substrat ECL, dan gunakan Stesen kerja imej pintar digunakan untuk pengimejan, dan perubahan jalur setiap kumpulan dibandingkan untuk mengkaji apoptosis sel Jurkat yang disebabkan oleh CDP. Untuk pengesanan protein berkaitan laluan apoptosis, kultur sel dan keadaan rawatan CDP adalah sama seperti di atas. Selepas tindak balas, sel-sel telah dilisiskan untuk kuantiti protein. Protein telah dipindahkan ke membran PVDF oleh SDS-PAGE dan elektroporasi. Selepas menyekat dengan susu tepung skim selama 1 jam, antibodi anti-CD71, CD45, p-JNK dan p-ERK (1:1 000) telah ditambah, dan diinkubasi pada suhu bilik selama 1 jam. Antibodi sekunder berlabel HRP (1:1 000) telah diinkubasi selama 1 jam, dan akhirnya, stesen kerja pengimejan pintar digunakan untuk pengimejan untuk mengkaji molekul isyarat berkaitan apoptosis sel Jurkat yang disebabkan oleh CDP. Jalur eksperimen yang terhasil adalah berskala kelabu dengan Imej J (1.8.0).

Klik di sini untuk mengetahui kesan Cistanche pada anti-tumor dan Kesan Anti-kanser

1.6 Analisis statistik SPSS21.0 perisian telah digunakan untuk ujian-t dan analisis varians

2 keputusan fungsi Cistanche dihidupkanleukemia

2.1 Tahap percambahan sel

CDP berjaya diasingkan, dengan lebih daripada 9{{20}} peratus kandungan gula dan kurang daripada 5 peratus kandungan protein. Kadar perencatan percambahan sel dalam kumpulan CDP 1 mg/ml ialah (19. 1 ± 2. 1) peratus, manakala dalam kumpulan CDP 2 mg/ml dan 5 mg/ml adalah (44. 2 ± 5. 2). ) ) peratus dan ( 47. 8 ± 4. 4) peratus , menunjukkan bahawa CDP boleh menghalang pembiakan sel Jurkat dengan ketara dalam cara yang bergantung kepada dos. 2.2 Berbanding dengan kumpulan kawalan (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.{{49 }}7), tahap apoptosis dalam sel Jurkat yang dirawat dengan 5 mg/ml CDP menghasilkan enzim caspase-9 dan caspase{{30}}. Pro-bentuk pro-caspase-9 ( 0. 09 ± 0. 02) dan pro-caspase-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) telah dikurangkan dengan ketara dan kumpulan CDP 1 mg/ml dan 2 mg/ml adalah kurang berkesan untuk pro-caspase-3 dalam sel. Kandungan Caspase-9 (0.58±0.04, 0.51±0.01) dan pro-caspase-3 (0.48±0.04, 0.44±0.05) tidak mempunyai kesan yang ketara, iaitu rendah Kepekatan CDP tidak mendorong apoptosis sel Jurkat, tetapi terutamanya menghalang percambahan sel, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1.

1-4: kumpulan rujukan,

1 mg/ml kumpulan CDP, 2 mg/ml kumpulan CDP, 5 mg/ml kumpulan CDP; sama seperti rajah berikut

Rajah 1 Kesan CDP pada caspase-9 dan caspase-3 dalam sel Jurkat

Pengaruh polisakarida Cistanche Kesan ke atas leukemia

2.3 Tahap ekspresi relatif CD71 dan CD45 dalam kumpulan kawalan reseptor apoptosis ialah 1.00±0.04, {{10}}.54± 0.{{20}}2. Kumpulan CDP 5 mg/ml boleh menghalang CD71 (0) dengan ketara.05±0.02). 01) dan CD45 ( 0. 13 ± {{40}}. 03); 1 mg/ml dan 2 mg/ml kumpulan CDP boleh menghalang ekspresi CD71 ( 0. 52 ± 0. 06, 0. 43 ± 0. 07) pada tahap tertentu Tiada kesan ketara ke atas ekspresi CD45 (0.51). ±0.01, 0.48±0.02). Lihat Rajah 2.

Rajah 2 Kesan CDP pada ekspresi reseptor pada permukaan membran sel

2.4 Laluan berkaitan apoptosis

Tahap ungkapan relatif p-JNK dan p-ERK dalam kumpulan rujukan ialah 1.20±0.08 dan 0.21±0 .03, masing-masing. Kumpulan CDP 5 mg/ml menyebabkan apoptosis dan mengurangkan tahap fosforilasi JNK dengan ketara. ( 0. 32 ± 0. 04), dengan ketara meningkatkan tahap fosforilasi ERK ( 1. 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP meningkatkan tahap fosforilasi JNK ( 1. 12 ± 0. 06 , 1. 06 ± 0. 06) tidak mempunyai kesan yang ketara, tetapi masih meningkatkan tahap fosforilasi ERK (0. 54 ± 0. 04, 0. 63 ± 0. 02). Lihat Rajah 3.

Rajah 3 Kesan CDP pada fosforilasi JNK dan ERK

3 Perbincangan

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, kajian mendapati bahawa CDP mempunyai kesan perencatan tertentu pada garisan sel leukemia, tetapi mekanisme tindakan khusus belum diketahui.

Dalam proses apoptosis, caspase-9 ialah salah satu molekul isyarat hulu dalam proses apoptosis yang bergantung kepada caspase. Selepas rangsangan isyarat, pro-caspase-9 dihidrolisiskan secara besar-besaran untuk menghasilkan satu bentuk cleaved-caspase-9 yang diaktifkan, yang terus menghantar isyarat apoptosis ke bawah untuk menggalakkan proses apoptosis. Caspase-3 ialah molekul caspase jenis effector dan merupakan molekul isyarat utama dalam proses apoptosis bergantung kepada caspase selular. Ia juga wujud dalam bentuk pro-enzim (pro-caspase-3) dalam keadaan biasa. Sebaik sahaja diaktifkan oleh hidrolisis, sejumlah besar caspase terbelah dihasilkan. -3, ia akan melisiskan pelbagai molekul protein utama dalam sel dan akhirnya mendorong apoptosis. CDP tergolong dalam polisakarida aktif makromolekul biologi dan tidak boleh memasuki sel secara bebas melalui membran sel. Oleh itu, CDP mendorong apoptosis dengan menjejaskan ekspresi dan pengedaran reseptor pada permukaan membran sel Jurkat, dengan itu menghantar isyarat ke bahagian dalam sel, dan akhirnya mengaktifkan keluarga caspase. protein, membawa kepada apoptosis sel. Kajian ini menunjukkan bahawa kepekatan rendah CDP tidak mendorong apoptosis sel Jurkat, tetapi terutamanya menghalang percambahan sel. CD71, juga dikenali sebagai reseptor transferin, ialah reseptor glikoprotein transmembran jenis II yang terlibat dalam penyerapan besi dan pengawalan pertumbuhan dan perkembangan sel. CD71 sangat dinyatakan pada pesakit dengan leukemia akut dan dikaitkan dengan rintangan dadah utama, iaitu ekspresi CD71. Semakin tinggi nilainya, semakin teruk kesan kemoterapi pertama. Oleh itu, CD71 adalah salah satu penanda untuk diagnosis tambahan. CD45 dinyatakan pada permukaan semua jenis leukosit, juga dikenali sebagai antigen biasa leukosit. Ia tergolong dalam glikoprotein transmembran jenis I dan berkait rapat dengan perkembangan dan pembezaan sel T. CD45 mempunyai tahap ekspresi dan jenis alosterik yang berbeza dalam pelbagai jenis leukemia, jadi ia boleh digunakan sebagai salah satu penanda untuk diagnosis pembezaan dan immunophenotyping leukemia. Antibodi monoklonal CD45 telah digunakan secara meluas dalam rawatan leukemia, terutamanya leukemia tahan dadah. Friesen et al. mendapati bahawa radionuklid

CD45 mAb yang ditag boleh mendorong apoptosis dalam talian sel leukemia yang tahan dadah dengan mengaktifkan protein keluarga caspase (termasuk caspase-3, caspase-8 dan caspase-9). CDP mendorong apoptosis sel Jurkat, pertama sekali dengan bertindak pada reseptor permukaan membran sel CD45 dan CD71, menjejaskan ekspresi dan pengedaran kedua-duanya, menghantar isyarat apoptosis ke dalam sel, dan akhirnya mengaktifkan caspase-9 dan caspase{{8 }}, mencetuskan apoptosis. Walau bagaimanapun, kedua-dua caspase-9 dan caspase-3 terletak di hilir laluan apoptosis dan molekul isyarat hulu perlu diterokai dengan lebih lanjut. Dalam kajian ini, CDP pada kepekatan 5 mg/ml menyebabkan apoptosis sel Jurkat sambil menghalang ekspresi CD45, yang serupa dengan antibodi monoklonal CD45 yang diterangkan di atas. Oleh itu, dari perspektif reseptor berkaitan apoptosis CD45 dan CD71,Cistanchemempunyai potensi tertentu untuk rawatan atau rawatan pembantu leukemia.Sistem kinase protein diaktifkan mitogen (MAPKs) dinyatakan dalam semua sel eukariotik.

Tablet Cistanche untuk meningkatkan Sistem Imuniti Rawatan Leukemia

Ia adalah laluan penghantaran maklumat yang sangat penting yang menjalankan transduksi isyarat rangsangan ekstraselular ke intraselular dan terdiri daripada kinase protein serin/treonin, termasuk ERK, JNK, dan p38MAPK. Fosforilasi dan nyahfosforilasi adalah suis aktiviti kehidupan sel dan terlibat dalam Dan mengawal proses pertumbuhan sel, percambahan, pembezaan, pengaktifan dan apoptosis. Kajian ini menunjukkan bahawa defosforilasi JNK terlibat dalam apoptosis sel T yang disebabkan CDP, manakala fosforilasi ERK terlibat dalam dua proses dalam CDP itu menghalang percambahan sel dan mendorong apoptosis.

Kesimpulannya,CDP Cistanchemempunyai kesan sitotoksik pada garisan sel leukemia T-limfositik Jurkat, menunjukkan bahawa kepekatan rendah (di bawah 2 mg/ml) menghalang percambahan sel, manakala kepekatan tinggi (5 mg/ml) mendorong apoptosis.CDP Cistanchemendorong apoptosis dalam sel Jurkat terutamanya dengan menjejaskan dan mengubah sel.

Ekspresi reseptor berkaitan apoptosis CD71 dan CD45 pada permukaan membran menghantar isyarat ke bahagian dalam sel, seterusnya menyebabkan fosforilasi ERK dan nyahfosforilasi JNK, dan akhirnya pengaktifan caspase-9, yang seterusnya mengaktifkan caspase{{4} } untuk mendorong apoptosis.