Abstrak

pengenalan: Propolis ialah bahan semula jadi resin yang dikumpul oleh lebah madu daripada tunas dan eksudat pelbagai pokok dan tumbuhan; diterima secara meluas bahawa komposisi propolis bergantung pada ciri-ciri fitogeografi tapak pengumpulan.

Glikosida cistanche juga boleh meningkatkan aktiviti SOD dalam tisu jantung dan hati, dan dengan ketara mengurangkan kandungan lipofuscin dan MDA dalam setiap tisu, dengan berkesan menghilangkan pelbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh OH-radikal. Glikosida phenylethanoid cistanche mempunyai keupayaan penghapusan radikal bebas yang kuat, keupayaan pengurangan yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktiviti SOD dalam penggantungan sperma, mengurangkan kandungan MDA, dan mempunyai kesan perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida cistanche boleh meningkatkan aktiviti SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan tisu paru-paru tikus senescent eksperimen yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangkan kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, mempunyai kesan penghapusan yang baik pada DPPH, memanjangkan masa hipoksia pada tikus senescent, meningkatkan aktiviti SOD dalam serum, dan melambatkan degenerasi fisiologi paru-paru dalam tikus senescent secara eksperimen Dengan degenerasi morfologi selular, eksperimen telah menunjukkan bahawa Cistanche mempunyai keupayaan antioksidan yang baik. dan berpotensi menjadi ubat untuk mencegah dan merawat penyakit penuaan kulit. Pada masa yang sama, echinacoside dalam Cistanche mempunyai keupayaan yang ketara untuk menghilangkan radikal bebas DPPH dan boleh menghilangkan spesies oksigen reaktif, menghalang degradasi kolagen yang disebabkan oleh radikal bebas, dan juga mempunyai kesan pembaikan yang baik pada kerosakan anion radikal bebas timin.

Klik pada Suplemen Cistanche Tubulosa

【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Objektif: Kajian ini bertujuan untuk menentukan komposisi fitokimia ekstrak etanol daripada lapan kelompok propolis yang dikumpul di kawasan berbeza Benin (utara, tengah, dan selatan) dan Congo, Afrika.

Bahan dan kaedah:Pencirian sampel propolis dilakukan dengan menggunakan kaedah kromatografi sempang berbeza digabungkan dengan penyahplikasian karbon-13 resonans magnetik nuklear (13C NMR) dengan perisian MixONat. Aktiviti antioksida atau anti glikasi lanjutan produk akhir (anti-AGE) mereka kemudiannya dinilai dengan menggunakan diphenylpicrylhydrazyl dan bovine serum albumin assays, masing-masing.

Keputusan: Analisis kromatografi digabungkan dengan dereplikasi 13C NMR menunjukkan bahawa dua sampel dari pusat Benin dipamerkan, sebagai tambahan kepada sejumlah besar triterpena pentacyclic, stilbenoid methoxylated atau phenanthrenes, yang bertanggungjawab untuk aktiviti antioksidan ekstrak untuk yang pertama. Antaranya, combretastatin mungkin sitotoksik. Untuk yang kedua, flavanon terprenilasi yang dikenali dalam propolis jenis Macaranga bertanggungjawab untuk aktiviti anti-AGE yang ketara. Sampel dari Congo terdiri daripada banyak derivatif triterpena kepunyaan spesies Mangifera indica.

Kesimpulan: Oleh itu, propolis dari pusat Benin nampaknya menarik, kerana sifat antioksidan dan anti-AGE. Namun begitu, memandangkan penyeragaman propolis adalah sukar di zon tropika kerana kepelbagaian kemoterapinya yang hebat, analisis fitokimia yang sistematik diperlukan sebelum mempromosikan penggunaan propolis dalam produk makanan dan kesihatan di Afrika.

KATA KUNCI

Dereplikasi 13C NMR, stilbenoid atau phenanthrenes methoxylated, triterpene pentacyclic, flavanones terprenilasi, Propolis

1. PENGENALAN

Propolis ialah bahan resin semula jadi yang dikumpul oleh lebah daripada tunas dan eksudat pelbagai pokok dan tumbuhan, dicampur dengan lilin lebah dan enzim air liur.1 Ia digunakan oleh lebah untuk melindungi pintu masuk daripada penceroboh, lubang palam, dinding dalaman licin, memumikan haiwan mati. (serangga kecil) di dalam sarang, dan mengimbangi kelembapan yang melampau atau keadaan kemarau.2,3 Propolis telah digunakan secara meluas dalam perubatan rakyat sejak zaman purba kerana pelbagai sifat terapeutiknya.4 Propolis umumnya terdiri daripada resin (50 peratus ) , lilin (30 peratus), minyak (10 peratus), debunga (5 peratus), dan sebatian fenolik tambahan seperti flavonoid.5,6 Komposisi kimia propolis diketahui kompleks dan berbeza-beza mengikut spesies tumbuhan yang tumbuh di sekitar sarang. , dari mana lebah mengumpul eksudat.7 Adalah diterima bahawa beberapa faktor, seperti komposisi floristik kawasan, tempat dan masa pengumpulan, musim, jenis pengumpul, ketersediaan dan ketinggian, dan aktiviti makanan yang dibangunkan semasa eksploitasi propolis mempunyai kesan ke atas komposisi kimia propolis.8,9 Terdapat pelbagai jenis propolis, bergantung kepada kawasan geografi pengeluaran, sumber botani, dan komposisi kimia. Jenis propolis yang paling biasa adalah sederhana, birch, tropika, Mediterranean, dan Pasifik.10 Propolis dari zon iklim sederhana, seperti Eropah, Amerika Utara, atau kawasan bukan tropika di Asia, datang terutamanya daripada eksudat tunas spesies Populus ( Salicaceae) dan oleh itu kaya dengan flavonoid dan asid fenolik serta esternya; walau bagaimanapun, propolis tropika, yang berasal dari kawasan yang tidak tumbuh poplar mahupun birch, kaya dengan derivatif terprenilasi asid p-kuumarik, benzofenon atau terpenoid.11 Propolis Pasifik, biasanya kaya dengan flavanon terprenilasi, merupakan satu lagi jenis propolis penting yang ditemui di Taiwan. , Jepun, dan Kepulauan Solomon, dan propolis birch ditemui secara khusus di Rusia.12 Kajian propolis dari Asia tropika telah membawa kepada penemuan Macaranga denarius L. dan Mangifera indica L. sebagai sumber tumbuhan propolis Indonesia.13 Mengenai Sebaliknya, spesies konifer daripada keluarga Cupressaceae merupakan sumber botani utama propolis di kawasan Mediterranean.14 Analisis kimia mendedahkan bahawa propolis mengandungi lebih daripada 300 produk semula jadi (NP) yang berbeza, termasuk derivatif asid fenolik, kumarin, flavonoid, seskuiterpena, diterpena, triterpena, steroid, lignan, atau benzofenon terprenilasi.15 Kesan biologi propolis telah diterangkan terutamanya mengenai bukan sahaja antioksidannya,16–18 anti-AGE (iaitu, perencatan pembentukan produk akhir glikasi lanjutan [AGE]),19 anti -keradangan,20 dan kesan anti-tumor,21–23 tetapi juga aktiviti antibakteria,24–26 anti-kulat,15 anti-virus,27 dan anti-parasit28. Propolis juga dikenali untuk merangsang pengeluaran antibodi, mencadangkan potensi penggunaannya sebagai adjuvant dalam vaksin.29 Peningkatan penggunaan bahan semula jadi komposisi terpelbagai ini dan oleh itu pelbagai aktiviti biologi dalam industri farmaseutikal, kosmetik dan makanan menjana minat khusus. dalam penyelidikan saintifik, terutamanya apabila ia datang untuk menentukan komposisi kimianya. Kebanyakan kajian telah dijalankan ke atas sampel dari Eropah19,30–33 dan Amerika Latin, lebih khusus lagi Brazil,20,23,34–36 manakala beberapa kajian telah dijalankan di Afrika.37–41 Maklumat mengenai propolis Beninese dan Congo42 masih terhad.

Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk mencirikan sebatian utama daripada sampel propolis yang dikumpul di pelbagai zon fitogeografi Benin dan Congo (Afrika) menggunakan nyahreplikasi resonans magnetik nuklear (NMR) 13C dengan perisian MixONat.43,44 Kajian awal menggunakan pangkalan data (DB) yang mengandungi NP sebelum ini dilaporkan daripada propolis bersama-sama dengan anjakan kimia (δC) yang diramalkan 13C mereka tidak menghasilkan sebarang data yang boleh digunakan berbanding dengan keputusan yang memuaskan yang biasanya diperoleh dengan ekstrak tumbuhan.43–45 Ini boleh dijelaskan oleh komposisi kimia propolis, yang sangat bergantung pada flora tempatan, menjadikannya mustahil untuk membina DB chemotaxonomic. Oleh itu, untuk menguraikan sebatian utama daripada propolis Benin dan Congo, dalam kerja ini kami melakukan kromatografi cecair berprestasi tinggi ditambah dengan spektrometri jisim pengesanan serakan cahaya ultraungu dan penyejatan (HPLC-UV-ELSD-MS) dan kromatografi gas ditambah dengan spektrometri jisim ( GC-MS) menganalisis ekstrak propolis mentah untuk mengenal pasti ciri struktur utamanya dan membina DB NP yang sepadan yang sesuai untuk perisian MixONat.46 Kemudian, selepas pecahan kasar sampel propolis dipilih mengikut profil kimianya, penyahplikasian berasaskan NMR 13C dibenarkan. pengenalpastian NP utama tanpa pembersihan lanjut. Ujian antioksida dan anti-AGE juga dijalankan.

2. PROSEDUR EKSPERIMEN

2.1 Bahan kimia

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), reagen Folin–Ciocalteu, asid formik dan asid gallik, semua gred analitikal, dibeli daripada Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Perancis). 6-Hydroxy-2,- 5,7,8-tetramethylchroman-2-asid karboksilik (Trolox®) dan 50 - asid caffeoylquinic (asid klorogenik) ialah diperoleh daripada Acros Organics (Geel, Belgium).

2.2 Sampel propolis

Lapan sampel propolis Benin dikumpul dengan mengikis daripada sarang lebah dalam tiga zon fitogeografi (Jadual 1 dan Rajah SI-1). Satu sampel propolis Congo telah dikumpulkan di hutan tiruan pokok akasia di dataran tinggi Bateke di tengah Republik Congo (Jadual 1).

2.3 Pengekstrakan Propolis

Ekstrak etanol propolis (EEPs) pada mulanya disediakan menggunakan protokol pengekstrakan berikut.19 Propolis mentah pertama kali dilumatkan secara homogen dengan kehadiran nitrogen cecair. Untuk semua sampel, 1 g serbuk propolis telah dimaserasi dalam 20 ml 95 peratus EtOH. Selepas kacau selama 2 jam pada suhu bilik, campuran itu ditapis menggunakan penapis corong cakera kaca tersinter (saiz liang 16-40 μm). Sisa diekstrak semula dua kali menggunakan langkah yang sama. Kemudian, tiga turasan terkumpul dikekalkan pada suhu 18 C semalaman, ditapis untuk mengeluarkan lilin, dan disejat di bawah tekanan yang dikurangkan (40 C, 10 bar) untuk memberikan EEP.

Jumlah 8.0 g serbuk propolis BC1 (1) dan BC2 (2) atau 10.3 g CG (3) diekstrak semula dengan EtOH 95 peratus (UAE, 4 80 ml, 15 min) untuk selanjutnya kromatografi kilat.

2.4 Penentuan jumlah kandungan fenolik

Jumlah kandungan fenolik ditentukan melalui kaedah kolorimetrik Folin-Ciocalteu seperti yang diterangkan sebelum ini,19 dan baru-baru ini disesuaikan untuk kegunaan langsung dalam plat mikro. Secara ringkas, 10 ul setiap ekstrak propolis dalam MeOH (3.5 mg/ml untuk BC1, 5 mg/ml untuk BN2, BC2 dan CG, 7.5 mg/ml untuk BN1, BS1a, BS1b dan BS2, dan 10 mg/ml untuk BS3) dicampur dengan 20 ul air suling dan 10 ul reagen Folin–Ciocalteu dalam 96-plat mikro telaga. Selepas 3 minit, 120 ul air suling dan 40 ul natrium karbonat berair 20 peratus ditambah. Penyerapan diukur pada spektrofotometer mikroplat TECAN® (V6.5) pada 760 nm selepas 30 minit dalam gelap pada suhu bilik. Kosong disediakan dengan cara yang sama dengan menggunakan MeOH dan bukannya larutan ekstrak dan asid gallik digunakan untuk mengira lengkung penentukuran (0.04–0.328 mg/ml; y=2.7241x 0.0039; r2=0 .9982). Setiap sampel dianalisis dalam tiga kali ganda. Jumlah kandungan fenolik dinyatakan dari segi kesetaraan asid gallik (mg) setiap gram ekstrak (mg GAE/g).

2.5 Analisis kromatografi awal

2.5.1 TLC Analitik

Kromatografi lapisan nipis analitik (TLC) telah dilakukan pada TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Jerman), menggunakan campuran sikloheksana: AcOEt sebagai eluan. Bintik-bintik dalam kromatogram divisualisasikan terlebih dahulu di bawah cahaya UV (254 nm) dan kemudian dengan menyembur dengan reagen asid vanillin–sulfurik (2 ml asid sulfurik pekat dalam 98 ml vanillin 1:99 w/v: larutan etanol 95 peratus) dan memanaskan kromatogram kepada 110 darjah C selama 5 minit.

2.5.2 Prosedur GC-MS

Analisis GC-MS dilakukan pada sampel bukan terbitan menggunakan Shimadzu Gas Chromatograph GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Perancis) dengan voltan pengionan 70 eV (Electronic Kesan). Sampel disediakan dalam diklorometana (DCM) pada 2 mg/ml untuk ekstrak dan 1 mg/ml untuk pecahan. Pemisahan dilakukan menggunakan lajur Phenomenex ZB5 (diameter dalaman 30 m * 0.250 mm dengan ketebalan filem 0.25 mm; Phenomenex, Le Pecq, Perancis). Suhu telah diprogramkan seperti berikut: 180 darjah C (3 min), 180-280 darjah C pada kadar 10 C/min, dan 280 darjah C (27 min). Helium digunakan sebagai gas pembawa pada kadar aliran 2.0 ml/min. Suhu penyuntik dan pengesan ditetapkan pada 250 darjah C dan 280 darjah C, masing-masing. Metabolit dikenal pasti dengan membandingkan masa pengekalan (Rt), jisim nominal dan/atau corak pemecahan dengan sampel tulen dan/atau yang terkandung dalam pustaka corak pemecahan peralatan (NIST11, NIST11s, dan FFNSC2).

2.5.3 Prosedur HPLC-DAD-ELSD

Analisis kromatografi telah dijalankan menggunakan kromatografi cecair Shimadzu 2030C 3D (Noisiel, Perancis) yang dilengkapi dengan tatasusunan diodpengesan (DAD) dan ELSD (Sedere®) dengan lajur Lichrospher® 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Jerman ) dilindungi dengan kartrij pelindung Lichrocart® 4–4 (id 4 mm*4 mm), menggunakan kadar aliran 1 ml/min. Fasa bergerak terdiri daripada 0.1 peratus asid format dalam air (pelarut A) dan metanol (pelarut B), dan pengasingan dilakukan dengan kecerunan linear berikut: 25–100 peratus B (0– 40 min), 100 peratus (40–45). min). Spektrum UV-vis direkodkan dalam julat 190-600 nm, dan kromatogram diperoleh pada 254 dan 280 nm. ELSD dipanaskan pada 30ijazahC, dan keuntungan 4 digunakan pada isyarat. Sampel disediakan pada kepekatan 10 mg/ml dalam MeOH dan disentrifugasi pada 13,000 g selama 10 minit sebelum suntikan (10 ul) untuk menghilangkan kesan bahan terampai.

2.5.4 Prosedur HPLC-UV-MS

Analisis HPLC-UV-MS dilakukan menggunakan modul pemisahan 2795 Waters (Guyancourt, Perancis) yang dilengkapi dengan pengesan Dual λ 2487 Waters. Lajur, fasa mudah alih dan kecerunan adalah sama seperti yang diterangkan di atas untuk HPLC-DAD-ELSD. Kromatogram diperoleh pada 254 dan 28{16}} nm. Analisis jisim telah dijalankan pada pengionan elektrospray Bruker (Bremen, Jerman)/pengionan kimia tekanan atmosfera (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 tambah dalam kedua-dua mod positif dan negatif seperti berikut: gas perlanggaran, He; amplitud tenaga perlanggaran, 1.3 V; nebulizer dan gas pengeringan, N2, 7 L/min; tekanan gas nebulizer, 30 psi; suhu kering, 340 C; kadar aliran, 1.0 ml/min; nisbah perpecahan pelarut, 1:9; julat imbasan, m/z 100–1,000. Sampel disediakan pada kepekatan 10 mg/ml dalam MeOH, disentrifugasi pada 13,000 g selama 10 minit dan ditapis melalui penapis picagari membran polytetrafluoroethylene (PTFE) 0.45-μm sebelum suntikan (20 ul) untuk menghilangkan kesan daripada bahan terampai.

2.6 Pecahan EEP dengan kromatografi kilat

Pertama, 3.8 g BC1 (1), 3.5 g BC2 (2), atau 4.0 g CG (3) EEPs telah dibubarkan dalam jumlah minimum DCM dan aseton dan dicampur dengan gel silika (silika gel: nisbah ekstrak, 2:1). Bagi kesemuanya, pelarut dibiarkan sejat sehingga serbuk kering halus diperolehi. Untuk setiap EEP, pecahan kemudiannya dilakukan dengan menggunakan radas CombiFlash Teledyne ISCO (Lincoln, NE, USA) dengan lajur gel silika (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Perancis) pada kadar alir 25 ml/min dengan sikloheksana (pelarut A) dan etil asetat (EtOAc) (pelarut B) menggunakan elusi kecerunan berikut: (1) untuk BC1 EEP, 5 peratus B (0–10 min), 5–20 peratus B (10–30 min), 20–30 peratus B (30–60 minit), 30–50 peratus B (60–85 minit), dan 50–100 peratus B (85–110 min); 160 tiub 20 ml dikumpul dan digabungkan menjadi 14 pecahan (BC1_F1 hingga BC1_F14) berdasarkan profil kromatografi TLC mereka (nisbah sikloheksana:EtOAc, 90:10 hingga 50:50 ); (2) untuk BC2 EEP, 5 peratus B (0–10 min), 5–10 peratus B (10–20 min), 10–30 peratus B (20–40 minit), 30–40 peratus B (40–55 min), dan 40–100 peratus B (55–70 min); 100 tiub 20 ml dikumpul dan digabungkan menjadi 8 pecahan (BC2_F1 hingga BC2_F8) berdasarkan profil kromatografi TLC mereka (nisbah sikloheksana:EtOAc, 90:10 hingga 60:40 ); (3) untuk CG EEP, 5 peratus B (0–10 min), 5–10 peratus B (10– 30 min), 10–20 peratus B (30–50 min), 20–40 peratus B (50–70 min), 40–60 peratus B (70–80 min), dan 60–100 peratus B (80–90 min); 135 tiub 20 ml dikumpul dan digabungkan menjadi 23 pecahan (CG_F1 ke CG_F23) berdasarkan profil kromatografi TLC mereka (nisbah sikloheksana:EtOAc, 80:20 hingga 60:40 ).

Langkah pecahan tambahan telah dilakukan pada pecahan BC{{0}}F7: 200 mg telah dibubarkan dalam isipadu minimum MeOH dan dicampur dengan C18-gel silika (C18-silika gel: nisbah ekstrak, 2:1). Pemisahan direalisasikan pada lajur C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Perancis) pada kadar aliran 15 ml/min dengan air (pelarut A) dan MeOH (pelarut B) menggunakan elusi kecerunan berikut: 50– 70 peratus B (0–30 min) dan 70–100 peratus B (30–40 min); 80 tiub 8 ml dikumpul dan digabungkan menjadi 5 pecahan (BC2_F7-1 hingga BC2_F7-5) berdasarkan profil HPLC-UV (280 nm) mereka .

2.7 1 Analisis H dan 13C NMR

Spektrum NMR (1D dan 2D) bagi pecahan propolis (7–58 mg) atau kadangkala NP direkodkan dalam kloroform yang telah dideuterated (CDCl3) atau metanol yang telah dideuterated (CD3OD) (500 ul) pada spektrometer JEOL NMR pada 400 MHz selama 1 H dan 100 MHz untuk 13C. Percubaan NMR (1 H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 dan 2D NMR) pada pecahan dan NP tulen dilakukan pada 298 K pada spektrometer JEOL 400 MHz H (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, Perancis) dilengkapi dengan kuar 5-mm songsang (ROYAL RO5). Anjakan kimia (δH dan δC) dinyatakan dalam nilai ppm dan J dalam Hz.

Untuk spektrum 13C NMR (100 MHz), jujukan penyahgandingan WALTZ-16 telah digunakan dengan masa pemerolehan 1.04 s (32,768 titik data kompleks) dan kelewatan kelonggaran selama 2 saat. Antara 1,500 dan 11,000 imbasan dikumpulkan untuk mendapatkan nisbah S/N yang memuaskan. Penapis peluasan garis eksponen 1 Hz digunakan pada setiap pereputan aruhan bebas (FID) sebelum transformasi Fourier. Spektrum secara manual berfasa dan diperbetulkan garis dasar menggunakan perisian MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Sepanyol) dan dirujuk pada resonans pusat pelarut deuterated pada δC 77.16 ppm (CDCl3) dan δC 49.00 ppm (CD3OD). Untuk peningkatan tanpa herotan oleh eksperimen pemindahan polarisasi (DEPT), antara 512 dan 5,500 imbasan diperlukan dan penjajaran dengan spektrum 13C dibuat menggunakan δC yang diberikan. Ambang keamatan minimum kemudiannya digunakan untuk mengumpulkan isyarat 13C NMR dan DEPT-90 positif dan isyarat DEPT-135 positif dan negatif secara manual sambil mengelakkan artifak hingar yang berpotensi.

Propolis DB1 mula-mula dibina dengan mencari sebatian yang diterangkan dalam propolis pada SciFindern, 47 menghasilkan DB sebanyak 1,471 NP; Nilai δC diramalkan menggunakan peramal NMR Pembangunan Kimia Lanjutan (ACD) (C, H). Daripada DB sedemikian yang mengandungi NP bersama-sama dengan nilai δC-SDF mereka, rutin CTypeGen yang disertakan dalam MixONat mencipta DB yang sesuai: Ia membaca fail data spatial (SDF) dan mengisih anjakan kimia mengikut jenis karbon. SDF jenis c yang diperlukan kemudiannya dicipta, iaitu, Propolis jenis c DB1.43,44

Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 telah dicipta. Carian bahan menggunakan kata kunci stilbenoids dan phenanthrenes dalam LOTUS DB yang mengandungi 276,518 NPs48 (LOTUS, 2022) membolehkan mendapatkan Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 sebanyak 2,681 NPs sebagai SDF. Flavanones DB3 kemudiannya dicipta: Carian pada SciFindern47 menggunakan 2-fenilchroman-4-satu substruktur yang dibenarkan untuk memilih 56,679 molekul. Ia dikurangkan lagi kepada 2,893 merujuk kepada "Kejadian produk semulajadi" menggunakan analisis bahan dengan penapis "Peranan rujukan" yang dicadangkan oleh SciFindern. Selepas penapisan tambahan dengan langkah penapisan berdasarkan jangkaan berat molekul (MW) (iaitu, 340 hingga 424 Da), semua flavanon yang berkaitan kemudiannya dieksport sebagai SDF untuk mendapatkan NP daripada Flavanones DB3 (684 NP). Bagi setiap NP DB2 dan DB3, nilai δC-SDF telah diramalkan menggunakan perisian peramal ACD NMR (C, H) serta metodologi yang diterangkan sebelum ini oleh Nuzillard46 untuk mendapatkan SDF jenis c yang sedia untuk digunakan oleh MixONat secara langsung. Yang terakhir ini mengandungi untuk setiap sebatian DB nilai δC yang diramalkan yang disusun sebagai metil, metilena, metin atau karbon kuaternari.

Triterpenes DB4 dibina daripada PNMRNP3 DB49,50 yang diimport sebagai SDF dalam perisian ACD NMR predictors (C, H) dengan mencari triterpenes dengan MW antara 100 dan 500 Da (iaitu, Data Carian: triterpenes; Carian MW: 100 hingga 500) untuk terus mendapatkan DB sebanyak 6,623 triterpena dalam format fail jenis c yang diperlukan.

Alk(en)yl resorcinol dan derivatif fenol DB5 dibina daripada PNMRNP3 DB49,50 yang diimport sebagai SDF dalam perisian ACD NMR predictors (C, H) dengan mencari NPs dengan perancah fenol m-alk(en)yl dan dikelaskan sebagai fenol (iaitu, 3-(heksadek-8-en-1-yl)pencarian Substruktur fenol; Cari kelas Classyfire: phenol) untuk terus mendapatkan DB sebanyak 44 NP dalam format fail jenis c yang diperlukan.

2.8 13C dereplikasi berasaskan NMR menggunakan perisian MixONat

Senarai puncak dan data intensiti yang diperoleh daripada setiap spektrum percubaan (13C NMR, DEPT-135 dan DEPT-90) telah dieksport sebagai . csv menggunakan perisian Microsoft Excel (Microsoft 16.45) dan digunakan sebagai fail input dalam perisian MixONat. Fail sedemikian terdiri daripada senarai nilai δC yang disusun dalam susunan menurun yang dikaitkan dengan keamatannya pada baris yang sama, dipisahkan dengan koma.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Selepas itu, data eksperimen NP dengan skor terbaik dibandingkan dengan kesusasteraan.

2.9 Pemurnian

2.9.1 HPLC Persediaan

Pembersihan pecahan BC{{0}}F6 dan BC1_F8 (40 mg dalam 2 ml MeOH) telah dijalankan menggunakan persediaan Shimadzu LC-20AP kromatografi cecair dilengkapi dengan pengesan UV–vis SPD-40 (Noisiel, Perancis), gelung suntikan 2 ml dan pengumpul pecahan FRC-10A, menggunakan lajur persediaan C18 (25{{39 }} mm 21.2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Perancis) pada kadar aliran 21.24 ml/min. Fasa mudah alih terdiri daripada 0.1 peratus asid formik dalam air (pelarut A) dan metanol (pelarut B) dan pengasingan dilakukan menggunakan kecerunan berikut: (1) untuk BC1_F6, 40 peratus B (0–5 min), 40–70 peratus B (5–20 min), dan 70–90 peratus (20–30 min); (2) untuk BC1_F8, 40–70 peratus B (0– 15 min) dan 70–90 peratus (15-25 min). Kromatogram diperoleh pada 254 dan 280 nm.

2.9.2 Pengekstrakan fasa pepejal (SPE)

Untuk mendapatkan pecahan paling polar BC2-EPP (200 mg dalam 5 ml MeOH dicampur dengan 350 mg C18-gel silika selepas penyejatan), penulenan telah dijalankan menggunakan lajur pengekstrakan fasa pepejal C18 (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Perancis) dengan air: MeOH 7:3 (10 ml) dan air: MeOH 6:4 (10 ml). Tiub 4–10 telah digabungkan untuk membentuk pecahan kutub BC2 (BC2_SPE) berdasarkan profil HPLC-UV (330 nm) mereka.

2.10 Ujian antioksida dan anti-AGE

2.10.1 Penghapusan radikal DPPH

Penilaian pemusnahan radikal DPPH bagi Beninese EEPs telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini.51 Secara ringkas, sampel yang diuji telah dicairkan dalam EtOH mutlak pada 0.02 mg/ml daripada larutan stok pada 1 mg/ml dalam dimetilsulfoksida (DMSO). Aliquot (100 ul) daripada larutan yang dicairkan ini diletakkan dalam 96-plat perigi dalam tiga kali ganda. Kira-kira 25 ul larutan DPPH yang baru disediakan (1 mM) telah ditambah kepada 75 ul EtOH mutlak menggunakan penyuntik pembaca plat mikro (Infinite® 200, Tecan, Perancis) untuk mendapatkan isipadu akhir 200 ul setiap telaga. Selepas 30 minit dalam gelap pada suhu ambien, penyerapan ditentukan pada 517 nm. EtOH digunakan sebagai kosong, manakala penyelesaian 10, 25, 50, dan 75 μM Trolox (analog hidrofilik -tokoferol) digunakan untuk lengkung penentukuran. Satu sampel larutan etanolik asid klorogenik (0.02 mg/ml) telah digunakan sebagai piawai kawalan kualiti. Keputusan dinyatakan sebagai setara Trolox (mikromole TE per g ekstrak).

2.10.2 Ujian anti-AGE

Kesan ekstrak propolis dan lima derivatif naringenin terpencil utama pada pembentukan AGE telah ditentukan seperti yang diterangkan sebelum ini.51 Secara ringkas, albumin serum lembu (BSA) (10 mg/ml) diinkubasi dengan D-ribose ({{ 13}}.5 M) bersama-sama dengan sebatian yang diuji (3 μM hingga 3 mM) atau ekstrak (1 ug hingga 1 mg) dalam penimbal fosfat 50 mM pada pH 7.4 (NaN3, 0.02 peratus ). Penyelesaian telah diinkubasi dalam 96-plat mikrotiter telaga pada 37 darjah C selama 24 jam dalam sistem tertutup sebelum pengukuran pendarfluor AGE. Pendarfluor daripada sampel diinkubasi dalam keadaan yang sama tanpa D-ribose telah ditolak untuk setiap pengukuran. Pentosidine seperti (pengujaan pada 335 nm, pelepasan pada 385 nm) pendarfluor AGE diukur dengan fluorometri.52 Nilai IC50 ditakrifkan sebagai jumlah ekstrak (ug/ml) atau kawalan positif (μM) yang diperlukan untuk mengurangkan pembentukan AGE sebanyak 50 peratus berbanding dengan kawalan negatif. Menurut ujian pengesahan statistik,53 analisis tunggal adalah mencukupi untuk penentuan IC50 yang tepat.

3. KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

3.1 Pemprofilan kromatografi

Pemprofilan LC am bagi lapan Beninese dan EPP Congo menggunakan pengesan ELSD kuasi-universal menunjukkan bahawa semua sampel mengandungi sebatian bukan kutub, yang dielusi pada penghujung kromatogram (Rajah 1). BC1 juga membentangkan sejumlah besar sebatian polar, dan BC2 mempamerkan beberapa sebatian polar sederhana dalam jumlah yang lebih kecil. Sebatian bukan kutub dalam CG EEP kelihatan agak berbeza daripada sebatian Benin.

Oleh itu, pemprofilan ELSD membawa kepada tiga sampel yang berbeza dan asli yang komposisinya disiasat selanjutnya: BC1, BC2, dan CG.

Pertama, analisis GC-MS telah dijalankan, membandingkan pemecahan MS dengan NIST DB, untuk mencirikan kelas kimia dan, jika boleh, untuk mengenal pasti konstituen. Pengenalpastian putatif (berdasarkan peratusan padanan dengan NIST DB) dan kelas kimia sebatian dibentangkan dalam Jadual 2 (GC–jumlah data pemprofilan arus ionik [TIC] ditunjukkan dalam Rajah SI-2).

Semua EEP Beninese membentangkan profil sebatian bukan kutub yang sama, dilabelkan sebagai huruf A hingga F, tetapi jumlahnya mungkin berbeza-beza. Mereka telah dikenal pasti sebagai - atau -amrinone (A), -amyrin (B), lupenone (C), -amyrin (D), - atau -amyrin acetate (E), dan lupeol acetate (F) (rujuk Rajah SI. -3), sudah diterangkan sebagai NP utama dalam propolis Mexico.54 Zhang et al. (2014) dan Tamfu et al. (2020) juga menyifatkan triterpenoid sebagai amyrin/lupeol dan amyrin/lupeol asetat dalam pelbagai sampel propolis Afrika.41,55 Hanya BC1 yang membentangkan NP tambahan yang dielusi antara Rt 10 dan 15 minit yang dicadangkan sebagai stilbenoid atau fenantrina metoksil mengikut corak pemecahan mereka. EEP Congo mempamerkan profil yang berbeza daripada yang Benin, dengan ester asid C16 dan C18 sebagai sebatian yang lebih meruap dikaitkan dengan skor padanan yang baik sebanyak 94 peratus , terbitan fenol pada Rt 13.1 min, tiga terbitan resorsinol dalam julat 14– 17 min, dan pelbagai jenis derivatif triterpene selepas Rt 21 min.

Selain itu, EPP telah dianalisis oleh HPLC-DAD-MS untuk menggambarkan NP tidak meruap (rujuk Rajah SI-4). Pemprofilan yang berbeza menunjukkan bahawa BC1 EEP mempamerkan sejumlah besar sebatian kutub sederhana dengan kromofor yang menyerap pada 280 nm, serta BC2 dalam perkadaran yang lebih kecil, dan CG mempunyai profil UV yang sangat lemah pada 280 nm.

3.2 Komposisi kimia BC1 dan BC2

Untuk mengenal pasti NP utama mereka menggunakan dereplikasi 13C NMR berdasarkan MixONat dan DB yang sesuai, pecahan kasar BC1 dan BC2 EEP kemudiannya dicapai dengan kromatografi kilat. Sesungguhnya, untuk BC1, analisis GC-MS mendedahkan kehadiran stilbenoid atau phenanthrenes methoxylated, yang membimbing kami untuk membina Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 khusus. Untuk BC2, kecuali untuk sebatian yang lebih polar pada Rt 3.8 min, semua sebatian menunjukkan spektrum UV flavonol flavanones-dihydro, yang mencadangkan mencipta Flavanones DB3.

Seperti yang digambarkan dalam Jadual 3, dihydrophenanthrenes 1 dan 3-5, phenanthrenes 2 dan 6, dan dihydro stilbene 7 (Rajah 2) telah dicadangkan dalam BC1 EEP oleh MixONat dan disahkan dengan perbandingan dengan data literatur (rujuk maklumat sokongan). Apabila perlu, penapis MW digunakan berdasarkan data HPLC-MS.

Lebih tepat lagi, antara 9,10-derivatif dihydrophenanthrene daripada 2,681 NP dalam DB2, MixONat mencadangkan 6-methoxycoelonin (2,7-dihydroxy-3,5-dimethoxy{ {10}},10-dihydrophenanthrene; 3, pangkat 1, skor 0.75, Angka SI-13 dan SI-14) dalam BC{{ 18}}F5 dan kehadirannya telah disahkan dengan perbandingan dengan data NMR yang diterbitkan. Ia masih belum dikenal pasti daripada spesies Combretaceae56 dan dalam orkid Bulbophyllum vaginatum; 57 dan 2,7-dihydroxy-3,4,6-trimethoxy- 9,10-dihydrophenanthrene (4, pangkat 1, skor 0.88, Angka SI{{33 }} dan SI-16) telah dihipotesiskan dalam BC1_F2. Kompaun 4 telah pun diterangkan dalam propolis58 Senegal dan kehadirannya telah disahkan berdasarkan data yang dilaporkan oleh Pettit et al. daripada pokok Afrika Combretum caffrum59 dan oleh Lu et al. daripada Dioscorea nipponica Makino.60

Proses dereplikasi berasaskan 13C NMR juga meramalkan 2,6-dihydroxy-3,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrophenanthrene (5, pangkat 8, skor 0.76, Angka SI-15 dan SI-16) dalam BC1_F2 dan 2,6,7-trihidroksi{{20 }},4-dimetoksi-9,10-dihydrophenanthrene (1, pangkat 2, skor 0.5, Angka SI-5 dan SI-6 ) dalam BC{{30}}F6-1 apabila penapis molekul pada MW 288 Da digunakan. Untuk 1, markah agak rendah (0.5); oleh itu, eksperimen NMR 2D tambahan (korelasi kuantum berbilang heteronuklear [HMQC], sambungan berbilang ikatan heteronuklear [HMBC], spektroskopi kesan Overhauser nuklear [NOESY], rujuk Rajah SI-7–SI-10) adalah dilakukan untuk mengesahkan struktur; untuk 5, skor adalah 0.76, iaitu, lebih tinggi daripada 0.70. Kedua-dua NP (1 dan 5) ini pertama kali disebut oleh Letcher et al. dalam spesies Combretum61,62 dan 1 telah pun ditemui dalam propolis Senegal.58

Antara terbitan phenanthrene, MixONat membuat hipotesis 2,6,7-trihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene (2, pangkat 1, skor 0.88, Angka SI-11 dan SI{{10}}) dalam BC1_F8-1, yang disahkan melalui perbandingan dengan data spektrumnya yang diterangkan oleh Letcher et al. dalam Combretum apicultum. 61 2,7-Dihydroxy-3,4,6-trimethoxyphenanthrene (6, kedudukan 5, skor 0.94, Angka SI-17 dan SI-18) sebelum ini diasingkan daripada Photolida Chinensis63 telah dicadangkan dalam BC1_F4.

Combretastatin B{{0}} (7), dihydro stilbene, telah dicadangkan oleh MixONat dalam kedudukan pertama (skor 1.0, Angka SI-17 dan SI-19) dalam BC1 EPP apabila menggunakan penapis MW (MW 304 Da) dan disahkan dengan perbandingan dengan data NMR yang diterangkan oleh Pettit et al. dalam Combretum caffrum. 59

Sebatian 2, 6, dan 7 telah dikenal pasti dalam propolis Senegal.58

Data 1 H dan 13C NMR 1–7 tersedia dalam maklumat sokongan.

Untuk BC2, tujuh sebatian telah dikenal pasti kepunyaan dua kelas struktur polifenol, derivatif chromone-C-glucoside dan prenylflavanone (8-14), beberapa daripadanya telah diterangkan buat kali pertama dalam propolis (Rajah 3).

Proses berasaskan 13C NMR menggunakan MixONat dan DB1 kepada DB5 tidak memberikan hasil yang relevan yang mencadangkan NP asal. Dua produk utama (8–9) telah dicirikan sepenuhnya sebagai campuran menggunakan spektrum jisim dan data 1D dan 2D NMR (1 H, 13C, HMQC, HMBC, rujuk Rajah SI-20–SI-23) dan dikenal pasti sebagai florin (8) dan isobiflorin (9), dua chromanone-Cglucosides yang baru diterangkan dalam propolis, masing-masing diterangkan dalam Pancratium biflorum64 dan cengkih Eugenia caryophyllata.65

Berkenaan derivatif flavanone, antara 688 NP dalam DB3, MixONat mencadangkan 6-prenylnaringenin (10, kedudukan 1, skor 0.95, Angka SI- 24 dan SI{{8 }}) sudah diterangkan dalam propolis66 merah Nigeria pada SM{{10}}F7-1. 6,8-Diprenylaromadendrin (12, pangkat 1, skor 1.0, Angka SI-28 dan SI-29) dan 6,8-diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13, kedudukan 10, skor 0.84, Angka SI-30 dan SI-31), sebelum ini ditemui dalam sampel propolis Cameroon,42 telah disahkan dalam SM2_F{ {30}} dan BC2_F5, masing-masing. 6-Geranylnaringenin (14, kedudukan 1, skor 0.84, Angka SI-32 dan SI-33), yang sebelum ini diterangkan dalam propolis dari Kepulauan Solomon,67 telah dihipotesiskan dan disahkan dalam SM{{41 }}F7-5. Akhir sekali, 6-dimethylallyl naringenin (11) telah dicadangkan di kedudukan kedua oleh MixONat dalam BC2_F6 (kedudukan 2, skor 0.65, Angka SI-26 dan SI- 27). Isomer dalam kedudukan 8 telah dicadangkan pada kedudukan pertama, tetapi perbandingan dengan data literatur 68,69 menunjukkan bahawa ia adalah isomer dalam kedudukan 6. Kompaun 11 adalah baru dalam propolis tetapi telah diterangkan dalam ekstrak organik Monotes africanus. 70 1 Data H dan 13C NMR 8– 14 tersedia dalam maklumat sokongan.

【Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】