Ciri Profil HPLC–MS Bagi Granules Formula Cistanche Deserticola
Oct 13, 2025
Pengarang: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Gabungan: Institut Kawalan Makanan dan Dadah Shanghai; Makmal Utama NMPA untuk Kawalan Kualiti Ubat Tradisional Cina, Shanghai 201203, China
Abstrak
Kaedah pemprofilan kromatografi ciri untuk butiran formula Cistanche deserticola telah ditubuhkan berdasarkan HPLC-MS. Menggunakan kepingan rebusan Cistanche deserticola yang disahkan dan bahan rujukan echinacoside sebagai rujukan, sepuluh kelompok sampel telah diekstrak terus dengan 50% metanol dan dianalisis oleh HPLC. Pemisahan dilakukan pada lajur Phenomenex Luna C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) dengan kecerunan asid formik asetonitril-0.1% pada 1.0 mL/min, 30 darjah, dan pengesanan UV pada 330 nm. Kromatogram ciri rujukan dengan sembilan puncak biasa telah dibina, antaranya lima puncak dikenal pasti oleh LC/Q‑TOF‑MS. Sepuluh kelompok menunjukkan persamaan Lebih besar daripada atau sama dengan 0.981. Metrik ketepatan, kestabilan dan kebolehulangan profil ciri adalah memuaskan. Kaedahnya mudah, berkesan mengenal pasti butiran formula Cistanche deserticola, dan boleh digunakan untuk penilaian kualiti.
Kata kunci: Cistanche deserticola; butiran formula; kromatogram ciri; echinacoside; verbascoside (acteoside); HPLC; LC–Q‑TOF‑MS; faedah cistanche; cistanche terbaik untuk dijual
Pengenalan Cistanche
Cistanche (Rou Cong Rong)ialah ubat tradisional Cina (TCM) tonik yang terkenal dengan kesan pengetonan buah pinggang, esen-berkhasiat dan julap. Ia pertama kali direkodkan dalam Shennong's Classic of Materia Medica dan disenaraikan sebagai ubat gred unggul. Pharmacopoeia Republik Rakyat China (Bahagian I) edisi 2020 mentakrifkan sumber tulen sebagai batang kering, bersisik, berdaging Cistanche deserticola YC Ma atau Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, dengan kaedah pemprosesan termasuk produk mentah dan produk yang diproses wain. Komponen kimia utama termasuk phenylethanoid glycosides (PhGs), iridoid, lignans, dan gula, menyokong aktiviti farmakologi seperti neuroprotection, anti-penuaan, hepatoprotection, dan laxation; prospek aplikasi klinikal adalah luas. Antaranya, PhG adalah juzuk yang paling aktif.
Butiran formula Cistanche deserticola ialah butiran herba tunggal yang disediakan daripada C. deserticola yang diproses menggunakan teknik pembuatan moden untuk digunakan dalam preskripsi klinikal. Pada masa ini tiada standard kebangsaan untuk kawalan kualiti mereka. Kajian terdahulu melaporkan kaedah penentuan kandungan atau cap jari untuk butiran formula C. tubulosa, tetapi tiada literatur tentang kromatogram ciri khusus untuk butiran formula C. deserticola. Dalam kajian ini, sepuluh kelompok telah dikumpulkan untuk mewujudkan, buat kali pertama, profil ciri HPLC untuk butiran formula C. deserticola, dengan lima puncak yang dikenal pasti oleh LC-MS. Profil ini menyediakan asas yang berkesan dan saintifik untuk kawalan kualiti yang ketat bagi butiran formula C. deserticola.
Eksperimen cistanche
1.1 Instrumen dan reagen
Agilent 1100 HPLC dengan pengesan UV–Vis dan ChemStation (Agilent, USA)
Agilent 1290 Infinity HPLC dan Agilent 6530 Q‑TOF MS dengan sumber ESI (Agilent, USA)
Imbangan elektronik Sartorius (Instrumen Saintifik Sartorius, Beijing, China)
Pembersih ultrasonik Elmasonic P (Elma, Jerman)
Kepingan merebus rujukan Cistanche deserticola, dan bahan rujukan echinacoside dan verbascoside (acteoside) telah dibeli daripada National Institutes for Food and Drug Control (Nos kelompok. 121101‑201603, 111670‑201907, 111530‑14). Cistanoside A, tubuloside A dan isoverbascoside diperoleh daripada Shanghai Tauto Biotech (Nos kumpulan. 21040621, 20061231, 21040824). Acetonitrile (gred HPLC) adalah daripada Merck; reagen lain ialah gred analitik (Reagen Kimia Shanghai Lingfeng). Sepuluh kelompok butiran formula C. deserticola (PFKL1–PFKL10), tiga kelompok keping rebusan C. deserticola (YP1–YP3), dan tiga kelompok rebusan standard C. deserticola (BZTJ1–BZTJ3) dibekalkan oleh Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.
1.2 Penyediaan penyelesaian
1.2.1 Penyelesaian rujukan
Penyelesaian herba rujukan: Timbang 1 g kepingan rebusan C. deserticola yang disahkan ke dalam kelalang kon bersumbat, tambah 25 mL metanol 50%, sonicate (250 W, 35 kHz) selama 30 minit, sejuk, gaul dan emparan. Gunakan supernatan sebagai penyelesaian herba rujukan.
Penyelesaian bahan rujukan: Sediakan echinacoside pada 0.2 mg/mL dalam 50% metanol.
1.2.2 Penyelesaian ujian
Kisar sampel; timbang dengan tepat kira-kira 1 g ke dalam kelalang volumetrik ambar 100 mL. Tambah 50 mL metanol 50%, penyumbat, goncang, timbang, rendam selama 30 minit, dan sonikasi selama 40 minit (250 W, 35 kHz). Biarkan sejuk, timbang semula, dan lengkapkan berat yang hilang dengan 50% metanol. Campurkan, diamkan, tapis dan kumpulkan turasan seterusnya untuk analisis.
1.3 Keadaan instrumental
Keadaan kromatografi: Fenomena Luna C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); fasa mudah alih A: asetonitril; fasa mudah alih B: 0.1% asid formik dalam air; elusi kecerunan: 0–5 min, 12% A; 5–15 min, 12%→20% A; 15–30 min, 20%→30% A. Kadar aliran 1.0 mL/min; pengesanan panjang gelombang 330 nm; suhu lajur 30 darjah; isipadu suntikan 10 μL. Plat teori, yang dikira pada puncak echinacoside, hendaklah Lebih besar daripada atau sama dengan 5000.
Nota: Teks asal menyenaraikan "15–30 min, 20%→30% A" dua kali; ini ditafsirkan sebagai satu langkah.
Keadaan spektrometri jisim: ESI dalam mod ion positif; julat imbasan m/z 50–1200. Tetapan sumber: nebulizer (N2) 35 psi; gas pengeringan (N2) 15 L/min pada 200 darjah ; gas sarung (N2) 12 L/min pada 350 darjah ; kapilari 3.5 kV; pemecah 125 V; Tenaga perlanggaran MS/MS (CID) pada 10, 20, dan 40 eV.
Keputusan dan perbincangan
2.1 Sampel prarawatan dan pengesanan panjang gelombang
Pelarut pengekstrakan (metanol, 75% metanol, 50% metanol, 25% metanol), mod pengekstrakan (ultrasonik, refluks), dan masa (10, 20, 40, 60 min) dibandingkan. Prarawatan yang optimum ialah 50% metanol dengan ultrasonik selama 40 minit. Oleh kerana PhG dalam C. deserticola menunjukkan penyerapan UV maksimum pada 330 nm, 330 nm telah dipilih untuk pengesanan.
2.2 Pemilihan keadaan kromatografi
2.2.1 Lajur
Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5‑C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) dan Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) menyediakan kesesuaian sistem yang mencukupi; masa pengekalan relatif (RRT) bagi puncak ciri adalah dalam ±10% daripada nilai yang ditentukan. Makmal boleh memilih antara ini.
2.2.2 Fasa mudah alih
Metanol–0.1% asid formik menghasilkan pemisahan yang lemah untuk kebanyakan puncak kecuali echinacoside; oleh itu, asid formik asetonitril–0.1% telah diterima pakai dan dioptimumkan kepada kecerunan dalam Bahagian 1.3, memberikan resolusi optimum, nombor plat dan garis asas yang stabil. Oleh kerana tiada lagi puncak yang dielusi selepas 30 minit, keseimbangan semula dimulakan pada komposisi awal.
2.3 Ketepatan, kebolehulangan dan kestabilan
Menggunakan kumpulan PFKL1, larutan ujian yang disediakan mengikut Seksyen 1.2.2 disuntik enam kali di bawah syarat Seksyen 1.3. RSD RRT dan kawasan puncak relatif untuk sembilan puncak ciri semuanya<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4 Penubuhan kromatogram ciri dan parameter teknikal
2.4.1 Kromatogram ciri rujukan
Sepuluh kelompok butiran formula C. deserticola secara konsisten memaparkan sembilan puncak ciri yang sepadan dalam masa pengekalan kepada sembilan puncak dalam larutan herba rujukan (Rajah 1–2). Lima puncak telah ditetapkan mengikut piawaian sebagai echinacoside, cistanoside A, tubuloside A, verbascoside (acteoside), dan isoverbascoside. Puncak echinacoside menyumbang bahagian yang besar dan stabil bagi jumlah kawasan puncak dan dipilih sebagai bahan rujukan. Tingkah laku kromatografi merentas sepuluh kelompok pada asasnya konsisten.
A. Penyelesaian kosong; B. Echinacoside; C. Penyelesaian ujian; D. Cistanchedeserticola; E. Kromatogram ciri rujukan.
Senarai Spesifikasi Cistanche Tubulosa
2.4.2 Pengenalan puncak
Penyelesaian ujian (Bahagian 1.2.2) dianalisis oleh LC–MS dalam kedua-dua mod ESI positif dan negatif; mod positif memberikan maklumat puncak yang lebih kaya dan digunakan (Rajah 3). Sembilan sebatian telah dikenal pasti secara keseluruhan; lima telah disahkan oleh jisim tepat, masa pengekalan, dan serpihan MS/MS menggunakan piawaian (Jadual 1). Memandangkan PhG ialah bahan aktif utama dalam C. deserticola dan butiran formula disediakan melalui pengekstrakan akueus, LC/Q‑TOF‑MS mengesahkan PhG sebagai juzuk utama. Sehubungan itu, sembilan puncak ciri telah dikatalogkan, dan lima puncak dengan tindak balas yang agak kuat telah dianotasi dalam kromatogram rujukan.
Rajah.2 HPLCreferencecharacteristicchromatogram 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulosideA; 6:Acteoside;7:Isoacteoside.
Rajah.3 Pengekstrakan semasakromatogrampenyelesaian 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulosideA;6:Acteoside;7:Isoacteoside.
2.4.3 Masa pengekalan relatif yang ditentukan
Berdasarkan sepuluh kelompok, purata RRT (berbanding dengan puncak S, iaitu, echinacoside) ialah: 0.77 (Puncak 1), 0.86 (Puncak 2), 1.00 (Puncak 3, S), 1.17 (Puncak 4), 1.27 (Puncak 5), 1.32 (Puncak 5), 1.32 (Puncak 5), 1.32 (Puncak 7), 1.32 (Puncak 7). (Puncak 8), dan 1.81 (Puncak 9). Setiap RRT puncak hendaklah berada dalam ±10% daripada nilai yang ditentukan.
Jadual 1. Parameter Spektrometri Jisim Puncak Kromatografi Berkaitan denganCistanche deserticolaButiran Formula
| Puncak | Nama | Formula Molekul | m/z | Masa Pengekalan (min) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Tidak diketahui | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Tidak diketahui | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Ekinakosid | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanoside A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubuloside A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Akteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | Isoacteoside | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Tidak diketahui | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Tidak diketahui | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Penilaian persamaan
Kromatogram daripada sepuluh kelompok telah diimport ke dalam "Sistem Penilaian Kesamaan untuk Cap Jari Kromatografi TCM (2012A)." Menggunakan sampel S1 sebagai rujukan, kaedah median, tetingkap masa 0.5-min, penentukuran berbilang titik, dan padanan data menghasilkan cap jari rujukan (Rajah 4) dengan sembilan puncak biasa. Nilai kesamaan untuk kesemua sepuluh kelompok adalah Lebih besar daripada atau sama dengan 0.981 (0.981–0.999), menunjukkan persamaan antara kelompok yang tinggi.
2.6 Pemindahan kuantiti dan kualiti daripada kepingan rebusan kepada rebusan standard dan butiran formula
Padanan puncak menunjukkan bahawa kepingan rebusan C. deserticola, rebusan standard dan butiran formula berkongsi sembilan puncak ciri, termasuk lima puncak yang ditetapkan (echinacoside, cistanoside A, tubuloside A, verbascoside dan isoverbascoside) (Rajah 5). Profil ciri sangat berkorelasi, dan peraturan pemindahan daripada kepingan rebusan → rebusan standard → butiran formula adalah jelas. Daripada kepingan rebusan kepada rebusan standard, luas Puncak 6 (verbascoside) menurun dengan ketara, selaras dengan kebolehan haba verbascoside.
Rajah.4 Tindanan Kromatogram Ciri HPLC bagi Formulagranules Cistanche deserticola
2.7 Perbandingan kromatogram ciri antara butiran formula C. deserticola dan C. tubulosa
Kedua-dua C. deserticola dan C. tubulosa mengandungi echinacoside, cistanoside A, verbascoside, isoverbascoside, dan tubuloside A. Walau bagaimanapun, kedua-dua spesies berbeza dengan ketara dalam kandungan echinacoside, dan cistanoside A hanya terdapat pada tahap surih dalam C. tubulosa. Oleh itu, echinacoside dan cistanoside A boleh berfungsi sebagai penanda diskriminasi untuk membezakan asal usul botani (C. deserticola vs. C. tubulosa).
Rajah.5 Perbandingan ciri-ciri kromatogram bagi cistanchedeserticoladecoctionpieces(A),standard decoction(B)andformulagranules(C) 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulosideA;6:Acteoside;7:Isoacteoside.
Kesimpulan (diubah suai seperti yang diminta: spesies mana yang mempunyai kandungan "lebih baik")
Dalam rangka kerja profil ciri HPLC–MS yang telah ditetapkan untukCistanche deserticolabutiran formula, dan mempertimbangkan perbandingan antara spesies,C. deserticolamempamerkan profil glikosida fenilethanoid yang lebih kaya dan seimbang: cistanoside A mudah dikesan dalam C. deserticola tetapi hanya dikesan dalamC. tubulosa, manakalaechinacosidemenunjukkan perbezaan antara spesies yang ditandakan. Oleh itu, untuk formulasi yang menyasarkan tahap agregat PhG utama yang lebih tinggi dan manfaat cistanche keseluruhan yang lebih kukuh, Cistanche deserticola disyorkan sebagai spesies yang lebih baik dari segi kandungan. Jika sesuatu produk menyasarkan secara khususechinacoside maksimum, kumpulan terpilih C. tubulosa akandipertimbangkan bergantung kepada ujian bekalan dan lot. Dalam amalan, "cistanche terbaik untuk dijual" harus ditentukan oleh ujian kuantitatif khusus kelompok echinacoside, verbascoside (acteoside), dan cistanoside A di bawah kaedah yang disahkan yang diterangkan di sini.
Rujukan
[1] Tang SW. Materia Medica Terkelas. Beijing: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Suruhanjaya Farmakope Cina. Farmakope Republik Rakyat China (Jilid. 1). Beijing: Akhbar Sains dan Teknologi Perubatan China, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et al. Ubat Tradisional dan Herba Cina, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, et al. Perubatan Tradisional Cina Moden, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Perubatan Lishizhen dan Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, et al. Jurnal China Materia Medica Cina, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X, et al. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, et al. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. Jurnal Sains Farmaseutikal China Barat, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et al. Jurnal China of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, et al. Perubatan Cina Moden, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, et al. Jurnal Bahan Perubatan Cina, 2017, 40(2):295.
Nota
Nama sebatian: echinacoside; cistanoside A; tubuloside A; verbascoside (acteoside); isoverbascoside.
Slip tipografi yang jelas merujuk kepada "pala" dalam sumber telah diterjemahkan sebagai "Cistanche" dalam terjemahan berdasarkan konteks.
