Bab2: Peroksisom Tubular Renal Boleh Dibuang Untuk Fungsi Ginjal Normal

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

Perbincangan

Kelimpahan peroksisom yang tinggi dalam tubul proksimal bersama-sama dengan kehadiran keabnormalan buah pinggang pada pesakit dengan ZSD telah sangat mencadangkan peranan penting peroksisom dalambuah pinggang. Selain itu, ungkapan khusus buah pinggang beberapa enzim peroksisom telah menyokong idea bahawa peroksisom buah pinggang mungkin mempunyai fungsi biologi yang sebahagiannya berbeza daripada yang terdapat dalam tisu lain (15). Untuk menguji hipotesis ini, kami memeriksafungsi buah pinggangpada tikus tanpa peroksisom khususnya dalamtubul renal. Antara model tetikus berbeza yang digunakan untuk mengkaji peranan peroksisom, kami memilih tikus yang membenarkan ketidakaktifan genetik bersyarat bagi pengekodan Pex5 faktor biogenesis peroksisom PEX5 penting untuk pembentukan peroksisom. Model ini dipilih kerana (i)Pex5-tikus null mempamerkan pelbagai keabnormalan biokimia dan fungsi yang mengingatkan mereka yang diperhatikan pada pesakit dengan ZSD(11) dan (i) spektrum besar model tetikus dengan ablasi khusus tisu Pex5 telah dianalisis (16), dengan itu membolehkan kita membandingkan akibat fungsi kekurangan peroksisom dalam tubul renal dengan yang diperhatikan dalam tisu lain. Seperti yang ditunjukkan oleh Baes et al., tikus Pex5-null mempamerkan terencat pertumbuhan intrauterin, kecacatan otak dan hipotonia yang teruk dan mati dalam tempoh 72 jam pertama kehidupan (11). Analisis biokimia mendedahkan beberapa ciri ZSD, termasuk kekurangan plasmalogens dalam hati dan otak dan peningkatan kuat dalam paras plasma VLCFA. Tiada sista renal kortikal ditemui dalam buah pinggang Pex{{1{11}}}}null tikus pada P0.5, tetapi keterlambatan dalam kematangan intrauterin glomeruli telah diperhatikan. Kehadiran mendapan kalsium oksalat tidak disiasat.

Klik di sini untuk mengetahui manfaat herba cistanche

Dalam tikus cKOm, ablasi biogenesis peroksisom dalam tubul renal tidak menyebabkan sebarang jenis fenol utama, kecuali penurunan KW dan BW pada tikus cKOm bayi dan penurunan nisbah KW/BW pada tikus cKOm dewasa. Dalam cKOf tikus, pengasingan tidak lengkap alel Pex5 floxed bersama-sama dengan kesan yang lebih ringan daripada penghapusan Pex5 pada transkriptom dan metabolom buah pinggang mencadangkan bahawa beberapa peroksisom sisa mungkin kekal dalam tubul renal. Walau bagaimanapun,sekskekhususan fungsi peroksisom dalam buah pinggang tidak boleh diketepikan juga. Kami tidak menemui sebarang perbezaan morfologi yang ketara dalam buah pinggang tikus cKOm yang boleh menjelaskan nisbah KW atau KW/BW yang lebih rendah. Walau bagaimanapun, kecenderungan untuk mengurangkan lebar sel proksimal mungkin menjadi punca perbezaan ini. Yang penting, fungsi homeostatik buah pinggang dikekalkan dalam tikus cKOm walaupun terdapat perubahan ketara dalam tahap ekspresi transkrip pengekodan protein yang terlibat dalam pengangkutan transepithelial ion, air, asid amino, anion dan kation organik, fosfat, urat, dan dalam multili-mediated megalin. laluan endositik gand. Nota, majoriti pengangkut yang dikodkan transkrip yang dikurangkan dinyatakan dalam tubul proksimal manakala kebanyakan pengangkut yang dikodkan transkrip terkawal dinyatakan di bahagian yang lebih distal nefron. Sebagai contoh, peningkatan ekspresi transkrip Nkcc2, Clc-Kb, Ncc, dan ENaC mencadangkan peningkatan regulasi pampasan dalam penyerapan semula natrium pasca proksimal. Analisis bersepadu transkriptom dan metabolom buah pinggang mendedahkan perubahan mendalam dalam pelbagai laluan selular yang berkaitan dengan metabolisme selular, komposisi membran lipid, dan homeostasis redoks. Dalam buah pinggang tikus cKOm, kira-kira 8 peratus transkriptom dan kira-kira 24 peratus metabolit yang dikesan menunjukkan tahap yang berbeza berbanding dengan tikus Ctrl. Seperti yang dijangkakan, kebanyakan transkrip dan metabolit ini berkaitan dengan fungsi peroksisom. Pengurangan dramatik diperhatikan dalam kelimpahan plasmalogens fosfolipid eter yang disintesis dalam peroksisom (~ 67 peratus dalam tikus cKOm dan ~ 50 peratus dalam cKOf tikus, jumlah tidak bertimbang semua spesies plasmalogen yang dikesan). Plasmalogen ialah fosfolipid membran sel utama dengan semakin banyak fungsi yang dikaitkan, termasuk integriti membran, isyarat selular dan pertahanan antioksidan. Dalam buah pinggang, plasmalogens mewakili kira-kira 20 peratus daripada jumlah fosfolipid (17), dengan itu menunjukkan bahawa sekurang-kurangnya 10 peratus daripada komposisi fosfolipid berbeza dalam buah pinggang tikus cKOm dan cKOf daripada kawalan masing-masing. Pengurangan plasmalogens berpotensi dikompensasi oleh peningkatan kelimpahan fosfatidillethanolamin (PE) yang serupa secara struktur dan oleh fosfatidilkolin (PC), yang mempamerkan pengayaan yang besar dalam buah pinggang kedua-dua cKOm dan cKOf tikus. Daripada nota, peningkatan pampasan yang sama bagi PE dan PC diperhatikan dalam buah pinggang pesakit dengan ZSD (17).

Metabolisme tubul proksimal terutamanya bergantung pada pengoksidaan asid lemak, yang dicirikan oleh ROS generasi tinggi yang dihasilkan dalam mitokondria dan peroksisom. Dalam tikus cKO, laluan yang berkaitan dengan degradasi / biosintesis asid lemak telah dikawal dengan ketara, berpotensi mencadangkan peningkatan pampasan pengeluaran tenaga mitokondria daripada substrat ini. Oleh kerana salah satu fungsi utama peroksisom ialah detoksifikasi ROS, kami membuat hipotesis bahawa ablasi biogenesis peroksisom akan mendorongtekanan oksidatifdalam buah pinggang tikus cKO. Walau bagaimanapun, analisis molekul tidak mendedahkan perubahan dalam kapasiti antioksidan dan biomarker tekanan oksidatif. Cabaran dengan HFD tidak menyebabkan perubahan dalam fenotip berfungsi, kecuali peningkatan sederhana dalam jumlah air kencing dan perkumuhan air kencing kalsium dan urat dalam tikus cKOm. Analisis transkriptom dan metabolom bersepadu membenarkan pengenalpastian laluan glutation sebagai mekanisme pampasan yang mungkin untuk mengekalkan kapasiti antioksidan keseluruhan dalam sel tubul proksimal buah pinggang yang tidak mempunyai peroksisom.

Pemadaman bersyarat Pex5 dalam hati janin(12), dalam sel pankreas(18), dan dalam jenis sel berlainan sistem saraf pusat (disemak dalam ref.16) menyebabkan kemerosotan fungsi khusus organ yang berubah-ubah tetapi kebanyakannya serius. Ini tidak berlaku pada buah pinggang. Dalam kajian ini, kami mengenal pasti beberapa mekanisme buah pinggang intrinsik yang berpotensi membenarkan mengatasi kekurangan peroksisom. Oleh kerana buah pinggang adalah organ yang menunjukkan kadar perfusi darah yang tinggi, kemungkinan lain terletak pada asal ekstrarenal sekurang-kurangnya sebahagian daripada metabolit yang tidak dihasilkan oleh buah pinggang tanpa ketiadaan peroksisom tetapi yang diperlukan untuk fungsi buah pinggang yang normal. Secara kolektif, data kami mencadangkan bahawa peroksisom tiub buah pinggang boleh diketepikan untuk fungsi buah pinggang yang normal dan perubahan patofisiologi dalam buah pinggang pesakit dengan ZSD adalah berasal dari extrarenal.

Kaedah

Haiwan. Prosedur yang digunakan untuk menjana Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre tetikus telah diterangkan sebelum ini (13). 3 garisan tetikus yang digunakan dalam kajian ini ialah strain inbred, dibiakkan berdasarkan latar belakang genetik tikus C57BL/6J (The Jackson Laboratory). Sebelum semua percubaan, tikus telah disesuaikan dengan kitaran 12-jam terang/12-jam gelap. Semua percubaan dilakukan pada masa sirkadian ZT3(ZT0ialah masa lampu dihidupkan dan ZT12 ialah masa lampu dimatikan).

Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 tiga kali tikus jantan atau betina transgenik (dirujuk sebagai cKOm dan cKOf) dan Pex5l/a tikus (dirujuk sebagai Ctrl atau Ctrl) telah digunakan. Penggabungan semula Pex5 pada bayi baru lahir dilakukan dengan penambahan 0.2 peratus DOX dan 2 peratus sukrosa dalam air minuman tikus betina hamil selama 2 minggu, bermula dari hari kehamilan ke-14 mereka. Untuk penggabungan semula Pex5 dalam tikus dewasa, DOX dan sukrosa telah ditambahkan pada air minuman 8-tikus berumur seminggu. Struktur dan fungsi buah pinggang dinilai 4 minggu selepas tamat rawatan DOX dalam4-tikus bayi berumur seminggu atau 14-tikus dewasa berumur seminggu. Selepas penyapihan mereka pada 3 minggu, tikus diberi makan dengan diet kawalan standard yang mengandungi 4.2 peratus lemak (Hidu diet kawalan rendah lemak) atau apabila disebut, selama 4 minggu dengan HFD sepadan yang mengandungi 20.7 peratus lemak (kebanyakannya LCFA).

Sangkar metabolik dan kimia darah dan air kencing. Tikus ditempatkan dalam sangkar metabolik individu (Tecniplast). Pengumpulan air kencing dilakukan selepas 3-tempoh penyesuaian hari. Kimia air kencing dan darah telah dianalisis seperti yang diterangkan sebelum ini (19). Komposisi plasma dan air kencing diukur di Laboratoire Central de Chimie Clinique, Hospitalier Hospitalier Universitaire Vaudoise University Hospital (Lausanne, Switzerland).

Mikroskopi elektron. Sampel buah pinggang dipotong kira-kira 1 mm³dan difikatkan dalam larutan glutaraldehid (EMS)2.5 peratus dalam penimbal fosfat(PB,0.1 M pH7.4)(MilliporeSigma) selama 2 jam pada suhu bilik(RT). Kemudian, mereka dibilas 3 kali, 5 minit setiap satu, dalam penimbal PB dan kemudian dipasang dengan campuran segar osmium tetroksida 1 peratus (EMS) dengan 1.5 peratus kalium ferrocyanide (MilliporeSigma) dalam PB selama 2 jam di RT. Sampel kemudian dibasuh 3 kali dalam air suling dan dehidrasi dalam larutan aseton (MilliporeSigma) pada kepekatan berperingkat (30 peratus 90 minit; 70 peratus 90 minit; 100 peratus 120 minit; 100 peratus 240 minit). Ini diikuti dengan penyusupan dalam resin Epon(MilliporeSigma) pada kepekatan berperingkat (Epon/acetone [1/3; v/v] 4 jam; Epon/acetone [3/1;v/v] 4 jam, Epon/acetone [1 /1;v/v] 8 jam; Epon/acetone [1/1; v/v] 24 jam) dan akhirnya pempolimeran selama 48 jam pada 60 darjah dalam ketuhar. Bahagian ultranipis 50 nm telah dipotong pada Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) dan diambil pada grid slot kuprum, 2×1 mm(EMS), disalut dengan filem polistirena (MilliporeSigma). Bahagian telah dicemari dengan uranyl acetate (MilliporeSigma)2 peratus dalam H, O selama 10 minit, dibilas beberapa kali dengan H, O diikuti oleh Reynolds plumbum sitrat selama 10 minit, dan dibilas beberapa kali dengan H, O.

Stereologi. Untuk analisis stereologi, 3 keping korteks buah pinggang setiap tetikus dianalisis, 15 mikrograf setiap sampel dengan saiz piksel 4.08 nm, menggunakan pensampelan rawak seragam sistematik dengan mikroskop elektron penghantaran (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) pada voltan pecutan 80 kV dengan kamera digital TVIPS TemCam-F416 (TVIPS GmbH).

Analisis transkriptomik. Semua data penjujukan tersedia secara terbuka melalui NIH Gene Expression Omnibus (nombor penyertaan GSE179202). Perpustakaan RNA-Seq telah disediakan menggunakan 200 ng jumlah RNA buah pinggang seperti yang diterangkan dalam Nikolaeva et al. (19). Reagen Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4 telah digunakan. Data penjujukan diproses menggunakan Mus musculus. GRCm38.86 anotasi gen, Analisis statistik telah dilakukan dalam R (versi 3.4.0). Transkrip dengan kiraan rendah telah ditapis mengikut peraturan 1 kiraan setiap juta(CPM) dalam sekurang-kurangnya 1 sampel. Saiz perpustakaan telah diskalakan menggunakan normalisasi TMM dan log diubah menjadi CPM menggunakan voom (20). Analisis komponen utama menunjukkan kebolehubahan kecil antara sampel replika. Ekspresi pembezaan antara tikus cKO dan Ctrl dikira ke dalam ujian 1 F menggunakan limma (21). Nilai P telah diselaraskan seperti yang diterangkan (22) ke dalam nilai FDR untuk dipertimbangkan untuk berbilang perbandingan, menggunakan keputusan semua transkrip dalam lelaki dan wanita atau keputusan pengangkut terpilih atau transkrip berkaitan peroksisom pada lelaki sahaja. Transkrip dengan FDR<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Analisis metabolik. Metabolit daripada sampel buah pinggang beku telah dikenal pasti oleh spektroskopi jisim kromatografi cecair berprestasi ultra tinggi dan dikira menggunakan AUC (Metabolon Inc). Nilai mentah telah diubah log dan dinormalisasi dari segi kiraan kawasan mentah. Ujian kontras ANOVA dua hala digunakan untuk mengenal pasti biokimia yang berbeza dengan ketara antara tikus cKO dan Ctrl kedua-dua jantina. Nilai P diselaraskan seperti yang diterangkan (22) ke dalam nilai FDR untuk dipertimbangkan untuk berbilang perbandingan, dan metabolit dengan FDR<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Analisis transkriptom-metabolom bersama. Analisis laluan metabolik bersepadu yang menggabungkan hasil yang diperoleh daripada ekspresi gen dan kajian metabolomik telah dijalankan menggunakan modul Analisis Laluan Bersama pada tapak web MetaboAnalyst 5.0(24). Nama kompaun metabolit dan simbol gen rasmi transkrip dengan ketara lebih kurang banyaknya (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

mengotorkan. Pewarnaan struktur buah pinggang global, deposit kalsium oksalat, atau pemendapan lipid neutral telah dilakukan pada kepingan buah pinggang melintang yang tebalnya 5 μm. Kecuali untuk pewarnaan lipid neutral, tikus telah dibius, dan buah pinggang kiri mereka diserap melalui aorta perut dengan larutan paraformaldehid 4 peratus sebelum penuaian tisu. Untuk analisis struktur buah pinggang global, hirisan buah pinggang yang tertanam dalam parafin telah dinyahparafin, dihidratkan semula, diwarnai dengan H&E, dehidrasi dan dipasang dalam ROTI Histokitt(Carl Roth GmbH). Lipid neutral telah diwarnakan dalam kepingan buah pinggang yang tertanam dalam sebatian OCT (Tisu-Tek) menggunakan larutan Minyak Merah O. Deposit kalsium oksalat telah diwarnakan mengikut kaedah yang diterangkan oleh Pizzolato (25). Secara ringkas, hirisan buah pinggang yang tertanam dalam parafin telah dinyahparafin dan dihidratkan semula, kemudian direndam dalam larutan perak nitrat 5 peratus w/v 1:1 dan hidrogen peroksida 30 peratus dan diletakkan di bawah mentol lampu 60 W selama 30 minit. Slaid telah dicuci bersih dalam air suling dan diwarnakan balas dengan Nuklear Fast Red (MilliporeSigma), kemudian dehidrasi sebelum dipasang diROTI Histokitt. Potongan buah pinggang membujur dari tetikus yang dirawat dengan diet yang disebabkan oleh nefropati kalsium oksalat (1.5 peratus kalsium ditambah 1.5 peratus hidroksiprolin yang dicampur dalam chow standard selama 3 minggu) berfungsi sebagai kawalan positif bagi mendapan kalsium oksalat buah pinggang. Keputusan dianalisis menggunakan Pengimbas Slaid Zeiss AxioScan.Z1 pada pembesaran asal 100× atau 200×.

Ujian ELISA dan Trolox.4-HNE diukur menggunakan Kit Ujian Peroksidaan Lipid(4-HNE) daripada Abcam (ab238538). Kapasiti antioksidan total dan nonenzimatik dinilai oleh kit ujian Trolox dari Abcam (ab65329).

Perangkaan. Semua data dinyatakan sebagai min ± SEM. Ujian statistik dan ambang untuk kepentingan diterangkan dalam legenda angka atau bahagian Kaedah yang sesuai. Analisis statistik dilakukan menggunakan pakej R atau perisian GraphPad Prism versi 8.2.1. Semua ujian-t adalah 2 ekor.

Kelulusan belajar. Semua eksperimen dengan haiwan telah dilakukan oleh garis panduan Switzerland untuk penjagaan haiwan, yang mematuhi garis panduan penjagaan haiwan Institut Kesihatan Nasional, dan diluluskan oleh kantonal Switzerland (Canton de Vaud) dan pihak berkuasa veterinar persekutuan (kebenaran 31827 kepada DF) (Direction generale de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Switzerland).

Penerbitan terdahulu: Sebahagian daripada karya ini telah diserahkan sebagai abstrak kepada Mesyuarat Tahunan 2021 American Society of Nephrology (4 November 2021.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021 /program-abstract.aspx?controlId=3605774).