Bab2: Faktor seperti Krϋppel 15 Menekan Pembiakan Sel Mesangial Glomerular Renal Melalui Meningkatkan Konjugasi P53 SUMO1

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

3 KEPUTUSAN

3.1|Pemeriksaan gen pengikat KLF15-melalui ChIP-Seq dalam MC glomerular renal primer

Untuk mengenal pasti gen pasangan mengikat langsung KLF15, kami melakukan analisis ChlP-Seq dan akhirnya menyaring 2478 gen. Analisis GO terhadap gen ini melalui alat di laman web www.uniprot.org (Rajah 1A, B) mendedahkan istilah fungsi molekul yang dikaitkan dengan 1941 gen, istilah komponen selular yang berkaitan dengan 1662 gen dan istilah proses biologi yang berkaitan dengan 1766 gen. Memandangkan matlamat kami adalah untuk mengetahui cara KLF15 mempengaruhi MC, kami menumpukan pada gen berkaitan proses sel. Antara 1315 gen berkaitan proses sel, 74 gen didapati mengambil bahagian dalam proses kitaran sel; khususnya, gen ini mengambil bahagian dalam kitaran sel mitosis, peralihan fasa kitaran sel dan proses lain (Rajah 1C, D). Tambahan pula, kami menganalisis gen yang terlibat dalam pertumbuhan dan mendapati bahawa ia berkaitan dengan pertumbuhan perkembangan, pertumbuhan sel dan jenis pertumbuhan lain (Rajah 1E).

3.2|Pemeriksaan gen yang dikawal secara berbeza dalam KLF15-mengekspresikan MC glomerular renal yang berlebihan menggunakan SILAC dan LC/MS

Analisis SILAC dan LC / MS HRMC yang mengekspresikan KLF15 secara berlebihan berbanding sel ibu bapa membawa kepada pengenalpastian 1357 protein. Kami menggunakan DAVID dan IPA untuk memperoleh domain GO dan laluan yang diperkaya dengan protein terkuantiti yang dikenal pasti oleh SILAC. Menariknya, banyak istilah berkaitan fungsi biologi protein adalah antara 30 istilah GO yang diperkaya dengan ketara, termasuk pengawalseliaan proses metabolik asid amino selular, kompleks proteasom, pengikatan protein, dan istilah transkripsi dan terjemahan, yang semuanya berkait rapat dengan ubiquitination (Rajah 2A). Rajah 2B menunjukkan 30 terma laluan yang diperkaya dengan ketara. Beberapa istilah proses biologi, termasuk istilah penyakit proteasome dan neurodegenerative, juga berkaitan dengan ubiquitination.

Klik untuk mengetahui tentangcistancheuntuk dijual dengan butiran

3.3|Analisis bioinformatik gen pengikat KLF15-yang berpotensi dikaitkan dengan percambahan MC glomerular renal

Untuk menerokai15-gen pengikat KLF yang berpotensi dikaitkan dengannyaglomerular buah pinggangProliferasi MC, kami melakukan analisis bioinformatik bagi data ChIP-Seq dan data SILAC-LC/MS. Lima puluh dua gen telah disaring (Jadual 2 dan Rajah 2C), dan lima daripada gen ini, termasuk SUMO1, faktor perencatan migrasi makrofaj (MIF), faktor permulaan eukariotik (EIF), faktor pertumbuhan seperti insulin (IGF) dan reticulocalbin (RCN). ), berkait rapat denganpercambahan sel. Oleh kerana analisis GO dan laluan bagi protein yang dinyatakan secara berbeza mencadangkan bahawa gen yang disaring berkaitan terutamanya dengan proses ubiquitination, kami menyimpulkan bahawa SUMO1, ahli keluarga protein ubiquitin-like (UBL), mengambil bahagian dalam pengubahsuaian pasca terjemahan yang serupa dengan ubiquitination sebagai gen sasaran KLF15.

Jumlah bukti yang semakin meningkat telah menunjukkan bahawa HG adalah salah satu faktor utama yang mendorong perkembangan nefropati diabetik, dan ia menggalakkan percambahan MC dan peningkatan sintesis matriks secara in vitro.25Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa PDGF-BB adalah penting untuk percambahan MC sebelum perkembangan glomerulosclerosis dalam glomerulonephritis eksperimen.26 Selepas mengesahkan bahawa MC telah dirangsang oleh HG atau PDGF-BB in vitro, kami mengesan perubahan dalam ekspresi KLF15 dan SUMO1 pada kedua-dua RNA dan protein.

tahap dan mendapati bahawa molekul ini mempunyai arah aliran yang sama (Rajah 2D-l). Akhirnya, kami menentukan SUMO1 sebagai gen sasaran KLF15.

3.4|KLF15 mengawal selia ekspresi gen SUMO-1 dengan mengikat pada rantau promoter CACCCA-SUMO-1 16 bp dan motif kaya C plus A

Kami menggunakan suite MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)untuk mencirikan motif pengikat KLF15-bagi 52 gen yang disaring daripada data KLF15 ChlP-Seq dan mengenal pasti motif pengikat KLF (Rajah 3A).Selain itu, kami selanjutnya menganalisis lebih daripada seribu pangkalan hulu penganjur SUMO1 dan mendapati bahawa KLF15 boleh mengecam dan mengikat kepada jujukan 16 bp (nukleotida -205~-199)termasuk - CACCCA-(Rajah 3B).ChIP-PCR mengesahkan bahawa KLF15 terikat kepada promoter SUMO1, dan keputusan menunjukkan ekspresi SUMO1 yang jauh lebih tinggi dalam kumpulan antibodi anti-KLF15 berbanding kumpulan kawalan latar belakang (Rajah 3C).

Tambahan pula, kami melakukan ujian wartawan dwi-luciferase untuk mengesahkan hubungan penyasaran antara SUMO1 dan KLF15. Kumpulan promoter SUMO1 jenis liar menunjukkan aktiviti luciferase yang lebih tinggi daripada vektor pGL3 dan kumpulan mutan dalam HRMC, dan aktiviti itu meningkat dengan ketara oleh overexpression KLF15. Peningkatan dalam aktiviti luciferase telah diterbalikkan dengan pemindahan dengan plasmid yang menyatakan kawasan promoter mutan (Rajah 3D). Diambil bersama, data ini mencadangkan bahawa SUMO1 ialah sasaran transkrip langsung KLF15.

3.5 |Penyaringan P53 sebagai substrat SUMOilasi SUMO1

Pengubahsuaian SUMO dinyatakan secara meluas pengubahsuaian pasca terjemahan dalam eukariota. Konjugasi boleh balik pengubahsuaian ini kepada protein substrat juga dikenali sebagai SUMOylation, yang memainkan peranan penting dalam mengawal selia fungsi protein sasaran dan seterusnya mengambil bahagian dalam pelbagai proses biologi, seperti pengangkutan nukleositoplasma, peraturan transkrip, apoptosis, penstabilan protein, tindak balas tekanan dan perkembangan kitaran sel.27 Untuk meneroka molekul isyarat hiliran yang dikonjugasikan secara langsung oleh SUMO1, kami melakukan analisis rangkaian SUMO1 menggunakan pangkalan data IPA, dan data menunjukkan bahawa SUMO1 boleh terus menggabungkan kepada P53, APP, JUN dan AKT, antara lain. protein (Rajah 4A-C). Kami pada mulanya memilih P53 sebagai molekul hiliran SUMO1 kerana ia merupakan protein terkenal yang berkait rapat dengan percambahan sel.28.29 Tambahan pula, kami menggunakan perisian SUMOsp untuk meramalkan kemungkinan jujukan SUMOylation bagi P53invariousspesies dan mendapati bahawa P53 mempunyai jujukan SUMOylation（ Rajah 4D）. Untuk menentukan sama ada P53 sememangnya diubah suai oleh SUMOylation, kami mentransfeksi HRMC secara sementara dengan plasmid overexpression SUMO1 atau siRNA SUMO1. Kedua-dua keputusan IP dan Western blot mendedahkan trend dalam perubahan ekspresi SUMO1-P53dan P53 yang konsisten dengan perubahan dalam SUMO1 (Rajah 4E-J). Data ini menunjukkan bahawa P53 ialah substrat SUMOylation SUMO1.

3.6 |KLF15 menghalang percambahan MC dengan mempromosikan ekspresi SUMO1 dan P53 SUMOylation

Untuk mewujudkan peraturan P53 SUMOylation dan proliferasi MC oleh KLF15 dan SUMO1, kami campur tangan dengan ekspresi KLF15 atau SUMO1 dalam HRMC dan merawat HRMC dengan PDGF-BB. Antara HRMC yang dirawat PDGF-BB, sel yang ditransfeksi dengan plasmid ekspresi berlebihan KLF15 menunjukkan ekspresi SUMO1-P53, P53, KLF15 dan SUMO1 yang lebih tinggi daripada sel yang ditransfeksi dengan plasmid kawalan KLF15. Perubahan yang sama dalam SUMO1-P53, P53 dan SUMO1 ditemui dalam sel transfeksi plasmid ekspresi berlebihan SUMO1, manakala ungkapan KLF15 tidak berubah dalam sel ini (Rajah 5A-F). PDGF-BB adalah salah satu faktor pertumbuhan MC yang paling berkesan yang diterangkan setakat ini, dan tindak balas proliferatif HRMC kepada PDGF-BB diperhatikan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5G, H, peratusan sel EdU-positif meningkat dengan ketara oleh pentadbiran PDGF-BB rekombinan. Keputusan pewarnaan EdU menunjukkan bahawa kedua-dua ekspresi berlebihan KLF15 dan SUMO1 menghalang percambahan sel yang disebabkan oleh PDGF-BB (Rajah 5G, H).

Untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang peranan KLF15 dan SUMO1 dalam membiak HRMC, kami mengalihkan sel dengan hanya SUMO1 siRNA atau mentransfeksikannya dengan SUMO1 siRNA dan plasmid overexpression KLF15. Peraturan turun SUMO1 tidak menjejaskan ekspresi KLF15, tetapi tahap ekspresi SUMO1-P53 dan P53 jelas menurun selepas pemindahan siRNA SUMO1(Rajah6A-C). Di samping itu, apabila ungkapan SUMO1 dihalang, paras ekspresi SUMO1-P53 dan P53 turut ditindas walaupun dalam sel yang terlalu mengekspresikan KLF15 (Rajah 6D-F). Kemudian, percambahan MC dinilai menggunakan ujian pewarnaan EdU. SUMO1 RNAi meningkatkan kesan proliferatif HRMC PDGF-BBon, dan kumpulan yang ditransfeksi dengan plasmid overexpression KLF15 dan siRNA SUMO1 mempunyai lebih banyak sel EdU-positif daripada kumpulan yang ditransfeksi dengan plasmid overexpression dan kawalan jujukan hibrid siRNA (Rajah 6G, H) . Oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa KLF15 menyekat percambahan MC dengan meningkatkan P53 SUMOylation.

3.7|Ekspresi SUMO1 dan P53 global dalam MC glomerular dikaitkan secara negatif dengan percambahan MC dalam nefritis-1 tikus

Nefritis anti-Thy1 ialah model klasik glomerulonefritis proliferatif mesangial terhad sendiri dengan fasa proliferatif dan fasa pemulihan. Kami menyuntik antibodi Thy1 ke dalam tikus Wistar untuk mencipta model ini. Kedua-dua serum urea nitrogen dan kreatinin tidak mempunyai perubahan ketara antara tikus kawalan dan tikus model (Rajah S1). Percambahan mesangial yang ketara dan pengumpulan ECM diperhatikan semasa fasa proliferatif (hari 5 dan 7) dalam tikus model, dan bilangan MC menurun semasa fasa pemulihan pada hari 10 (Rajah 7A). Kami juga mengesan perubahan ekspresi dalam penanda percambahan sel PCNA oleh IHC (Rajah 7A, B). Tahap PCNA meningkat pada hari ke-5, memuncak pada hari ke-7 dan menurun pada hari ke-10 (Rajah 7F). Analisis Western blot menunjukkan bahawa ekspresi protein P53, SUMO1 dan KLF15 dalam glomeruli terpencil adalah lebih rendah dalam kumpulan model berbanding kumpulan kawalan (Rajah 7C, D), selaras dengan keputusan imunohistokimia (Rajah 7E, F). Keputusan ini menunjukkan bahawa percambahan abnormal MC dalam tikus model anti-Thy1 berkaitan dengan ekspresi peringkat rendah KLF15 dan SUMO1. Mengganggu ekspresi molekul ini dijangka dapat mengurangkan fenotip patologi dalam tikus.

4. PERBINCANGAN

Theglomeruliialah unit penapisan bagibuah pinggang. Gangguan fungsi glomerular boleh disebabkan oleh patologi glomerular primer atau boleh menjadi sekunder kepada penyakit sistemik. Perubahan mesangial dilihat berikutan kecederaan glomerular termasuk hiperproliferasi MC diikuti oleh pengeluaran berlebihan ECM (pengembangan mesangial) dan pengeluaran chemoattractant untuk sel radang. Oleh itu, modulasi tindak balas MC, terutamanya percambahan tidak normal, adalah pendekatan terapeutik baru. KLF15 ialah protein yang memainkan peranan pengawalseliaan sebagai faktor transkripsi dengan mengikat urutan DNA tertentu. Banyak kajian telah melaporkan bahawa KLF15 terlibat dalam pengawalseliaan percambahan sel. Sebagai contoh, didapati bahawa KLF15 mengambil bahagian dalam perencatan laluan isyarat berkaitan proliferasi MC, 15, 30 tetapi gen sasaran langsungnya tidak dilaporkan dalam kesusasteraan. Oleh itu, kajian ini melibatkan penyaringan bersama tahap transkripsi dan terjemahan untuk mengenal pasti gen sasaran langsung KLF15.

KLF15 mengawal gen yang berbeza dalam spesies yang berbeza dan dalam tisu dan organ yang berbeza. Dalam proses mengawal selia percambahan MC, KLF15 mempengaruhi ekspresi pelbagai gen dan mengambil bahagian dalam pelbagai laluan.131,32 Untuk meneroka gen sasaran langsung KLF15, kami menggunakan ChIP-Seg.Klein RH dan rakan-rakannya menggunakan ChlP-seq teknologi untuk mengkaji peraturan KLF7 mengenai pembezaan sel epitelium kornea.33 Ying M et al menggunakan teknik ini untuk mengkaji kesan perencatan KLF9 terhadap pluripotensi glioblastoma.34Berbanding dengan cip ChlP, ChIP-Seq membolehkan analisis genom keseluruhan yang benar dengan resolusi yang lebih tinggi, sensitiviti pengesanan yang lebih tinggi dan permintaan saiz sampel yang lebih rendah.35 Kami menggunakan ChP untuk mendapatkan serpihan DNA yang terikat secara langsung oleh KLF15, dan selepas perbandingan dan analisis dengan GenBank, kami menyaring 2478 kemungkinan gen sasaran. Melalui analisis GO dan laluan, kami mengenal pasti banyak gen sasaran yang terlibat dalam kitaran sel dan proses percambahan.

Eksperimen ChlP-Seq memerlukan PCR untuk penguatan isyarat pengesanan, dan beberapa tahap bias semasa proses penguatan tidak dapat dielakkan. Di samping itu, ChIP-Seq hanya memperoleh gen yang boleh diikat oleh KLF15 dan tidak menunjukkan perubahan yang berlaku dalam ekspresi gen ini apabila ekspresi KLF15 berubah. Kami menggunakan analisis proteomik SILAC-LC/MS untuk mengimbangi kekurangan ini. Teknik ini memberikan maklumat tentang semua protein yang ekspresinya berubah mengikut peraturan oleh KLF15, termasuk protein yang dikawal secara langsung oleh KLF15 dan protein yang dikawal secara tidak langsung atau diubah suai selepas terjemahan. HRMC dibiakkan menggunakan SILAC, dan KLF15 diekspresikan secara berlebihan dalam sel melalui pemindahan plasmid. Protein telah dikumpulkan untuk pengesanan LC / MS, dan 1357 protein yang dinyatakan secara berbeza diperolehi. Analisis GO dan laluan mendedahkan bahawa beberapa protein yang dinyatakan secara berbeza terlibat dalam ubiquitination. Data gen dan protein bersilang. Gen yang tidak berkaitan dengan tujuan penyelidikan dan gen yang tidak dikawal secara langsung oleh KLF15 telah dikeluarkan; akhirnya, 52 gen telah disaring. Di antara ini, lima gen dengan perbezaan ekspresi paling jelas yang paling berkait rapat dengan percambahan telah dipilih. Memandangkan hasil gabungan analisis laluan, analisis ekspresi SUMO1 dan KLF15 dalam HRMC yang membiak, ujian wartawan ChlP-PCR dan dwi-luciferase, protein SUMO1 telah dipilih sebagai gen sasaran KLF15.

Sebagai tambahan kepada ubiquitin, peningkatan bilangan UBLprotein, 3637 termasuk SUMO, 38 yang diekspresikan sel prekursor saraf, 8(NEDD8) 3940 yang dikawal secara perkembangan dan gen 15 (ISG15), 41 yang dirangsang interferon sedang dikenal pasti. Protein pengubahsuaian ini berkuasa mengawal pelbagai proses biologi. Penambahan kovalen SUMO kepada substrat, dipanggil SUMOylation, ialah pengubahsuaian pasca terjemahan yang terlibat dalam satu siri proses selular, termasuk pengangkutan nuklear-sitosol, peraturan transkrip, apoptosis, kawalan kestabilan protein, tindak balas tekanan dan perkembangan kitaran sel.27SUMO lazimnya melekat pada residu lisin penerima substrat protein yang mempunyai jujukan konsensus dan menyumbang kepada pengawalseliaan interaksi protein-protein serta kepada petak subselular dan kestabilan protein.2 sUMO1, sebagai ahli keluarga SUMOS, boleh menjejaskan percambahan sel dengan mengubah suai substrat dan menstabilkan protein kawal selia kitaran sel.43 Oleh itu, digabungkan dengan laporan literatur dan keputusan pemeriksaan dan analisis yang komprehensif, kami memberi tumpuan kepada cara KLF15 mengawal kesan SUMO1 pada percambahan sel mesangial.

Untuk mengenal pasti substrat SUMO1, kami melakukan analisis rangkaian SUMO1 menggunakan pangkalan data IPA dan perisian SUMOsp. Digabungkan dengan penyelidikan yang diterbitkan pada P53, data saringan awal kami mencadangkan P53 sebagai molekul hiliran SUMO1 dengan jujukan SUMOylation YKxD/E. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa P53 adalah substrat SUMOylation,45 dan konjugasi P53 SUMO1 yang dipertingkatkan menggalakkan kestabilan dan aktiviti P53 dan induksi se-nescence.46 Dalam kajian kami, gangguan terhadap ekspresi SUMO1 dalam HRMC menghasilkan trend perubahan yang sama dalam SUMO1-P53 dan P53, menunjukkan bahawa P53 ialah substrat SUMOilasi SUMO1.

Bukti yang muncul menunjukkan bahawa SUMOylation dan de-SUMOylation memainkan peranan dalam pelbagai penyakit nefropati, seperti disgenesis buah pinggang, karsinoma buah pinggang, penyakit glomerular, apoptosis podosit dan hipertonisitas medula buah pinggang, kecederaan buah pinggang akut dan nefrolitiasis.7-51 Untuk menjelaskan masalah ini. hubungan antara KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation dan proliferasi MC, kami melakukan satu siri rawatan transfeksi pada sel yang telah mengalami percambahan yang disebabkan oleh PDGF-BB. Ekspresi berlebihan KLF15 mengawal selia ekspresi SUMO1, manakala ekspresi berlebihan SUMO1 tidak menjejaskan ekspresi KLF15. Sama ada ekspresi berlebihan KLF15 atau SUMO1 meningkatkan SUMOylation P53 dan menentang percambahan sel yang disebabkan oleh PDGF-BB. Apabila ekspresi SUMO1 dihalang, SUMOylation P53 juga dihalang, dan KLF15 kehilangan kesan antagonisnya pada percambahan sel. Dalam vivo. percambahan MC secara beransur-ansur meningkat dengan keterukan nefritis proliferatif mesangial, manakala ekspresi KLF15, SUMO1 dan P53 menurun dengan ketara. Memandangkan pemerhatian bersepadu dalam sel dan tisu, kami membuat kesimpulan awal bahawa KLF15 mengawal SUMOylation P53 melalui SUMO1, dengan itu menghalang percambahan MC.

5 KESIMPULAN

Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa KLF15 memainkan peranan penting dalam mengawal selia percambahan MC. Dalam kerja ini, kami meneroka mekanisme penindasan proliferasi MC yang dimediasi oleh faktor transkripsi ini. Kami mengenal pasti SUMO1 sebagai sasaran utama KLF15 dalam MC melalui analisis bioinformatik yang melibatkan ChIP-Seq dan SILAC-LC/MS. Tambahan pula, dengan bantuan pangkalan data IPA dan perisian SUMOsp, kami menentukan bahawa P53 adalah substrat langsung SUMO1. Eksperimen in vitro dan in vivo mengesahkan bahawa KLF15 boleh mempromosikan ekspresi SUMO1 dan SUMOylation P53 kemudian menghalang percambahan MC (Rajah S2). Keputusan ini menyumbang kepada pemahaman tentang peranan pengawalseliaan KLF15 dalam percambahan MC dan menyediakan asas teori untuk mencari rawatan baharu untuk penyakit buah pinggang yang berkaitan dengan percambahan MC.