Autophagy Pengantaraan Chaperone dalam Penyakit Neurodegeneratif Dan Penghinaan Neurologi Akut dalam Sistem Saraf Pusat Bahagian 2

4. Alat Penyelidikan Eksperimen untuk Menguji Aktiviti CMA

Dalam bahagian ini, kami menerangkan alat penyelidikan eksperimen yang tersedia untuk menguji aktiviti CMA secara in vitro dan in vivo. Kaedah yang biasa digunakan untuk mendapatkan maklumat yang berkaitan dengan aktiviti CMA serta ujian fungsi CMA.

CMA (Akauntan Pengurusan Bertauliah) ialah pensijilan akauntan pengurusan profesional, yang bertujuan untuk memperakui orang yang mempunyai kemahiran operasi yang mencukupi dan pengetahuan profesional dalam bidang perakaunan pengurusan. Ingatan, keupayaan otak manusia, merujuk kepada keupayaan untuk mengingati maklumat, pengetahuan, atau pengalaman.

Terdapat hubungan tertentu antara CMA dan ingatan. Pertama sekali, peperiksaan CMA memerlukan calon mengingati sejumlah besar mata dan konsep pengetahuan, dan pada masa yang sama memerlukan calon menguasai kemahiran untuk menggunakan mata pengetahuan ini. Oleh itu, ingatan yang sangat baik akan memainkan peranan yang sangat penting dalam mencapai keputusan yang baik dalam peperiksaan CMA.

Kedua, ingatan boleh dipertingkatkan melalui pembelajaran dan latihan, yang juga membantu untuk belajar untuk peperiksaan CMA. Sebagai contoh, dengan berulang kali menyemak mata pengetahuan, mempelajari dan menghafal maklumat dengan cara yang berbeza, dan menggunakan teknik ingatan, anda boleh meningkatkan ingatan dan membantu calon menguasai mata pengetahuan dan kemahiran yang diperlukan untuk peperiksaan CMA dengan lebih baik.

Akhir sekali, mempelajari CMA bukan sekadar peperiksaan, tetapi juga peningkatan dalam kualiti profesional. Dalam pembangunan kerjaya, jika anda ingin menggunakan keupayaan profesional anda dengan lebih baik, anda sememangnya memerlukan keupayaan ingatan tertentu untuk membantu diri anda menyelesaikan tugas kerja anda dengan lebih baik.

Ringkasnya, terdapat hubungan rapat antara CMA dan ingatan. Cuba untuk meningkatkan ingatan anda bukan sahaja akan membantu anda mendapat gred yang baik tetapi juga membantu anda menyelesaikan tugasan kerja anda dengan lebih baik dan menyedari nilai peribadi dan pencapaian kerjaya anda semasa kerjaya anda berkembang. Ia dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan kita, dan Cistanche deserticola boleh meningkatkan ingatan dengan ketara kerana ia mempunyai kesan antioksidan, anti-radang dan anti-penuaan, yang boleh membantu mengurangkan pengoksidaan dan keradangan dalam otak, dengan itu melindungi kesihatan sistem saraf. Selain itu, Cistanche deserticola juga boleh menggalakkan pertumbuhan dan pembaikan sel saraf, dengan itu meningkatkan ketersambungan dan fungsi rangkaian saraf. Kesan ini boleh membantu meningkatkan ingatan, keupayaan pembelajaran, dan kelajuan berfikir, dan juga boleh mencegah berlakunya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik Tahu untuk meningkatkan kuasa memori

4.1. Analisis Berguna untuk Memantau Aktiviti CMA

Menilai perubahan dalam jumlah komponen molekul utama CMA boleh digunakan sebagai cara tidak langsung untuk menilai aktiviti CMA [46]. Di samping itu, bilangan dan pengedaran lisosom aktif CMA boleh dianalisis untuk membuat kesimpulan perubahan dalam aktiviti CMA [46].

Walau bagaimanapun, analisis ini hanya menyediakan data yang dikaitkan dengan status CMA. Oleh itu, analisis ini harus dilengkapkan dengan ujian berfungsi [47]. Imunoblotting dan pengimejan untuk menilai perubahan dalam komponen CMA utama ialah kaedah yang paling biasa digunakan untuk menilai aktiviti CMA.

Oleh kerana tahap lisosom LAMP2A adalah terhad untuk CMA [48], perubahan dalam banyaknya LAMP2Aprotein dalam lisosom biasanya berkait rapat dengan aktiviti CMA. Oleh itu, dalam penilaian imaginasi, kehadiran LAMP2A pada membran lisosom perlu dianalisis [47].

Immunoblotting untuk LAMP2A menggunakan pecahan diperkaya lisosom atau sekurang-kurangnya pecahan sel membran adalah lebih bermaklumat daripada menggunakan jumlah lisat sel keseluruhan [46]. Tahap lisosom-hsc70 juga berkaitan dengan aktiviti CMA [49].

Walau bagaimanapun, hsc70 adalah salah satu pendamping selular yang paling banyak, dan pecahan yang terletak dalam lisosom adalah jumlah yang kecil. Oleh itu, immunoblotting untuk hsc70 dalam jumlah lisat selular tidak bermaklumat untuk CMA [46]. Kolokalisasi hsc70 dengan penanda lisosom (cth, LAMP1) boleh digunakan untuk mengesan lisosom aktif CMA [49].

Bilangan lisosom ini dikolokalisasikan denganhsc70 mengikut kadar keseluruhan kolam lisosom meningkat apabila CMA diaktifkan [12]. Di samping itu, analisis mikroskopik elektron menggunakan pewarnaan immunogold untuk hsc70 juga boleh memberikan maklumat tentang kumpulan lisosom aktif CMA [49].

Dalam analisis menggunakan lisosom terpencil daripada sel atau tisu, peningkatan tahap substrat CMA yang terkenal (cth, GAPDH) boleh menunjukkan penurunan aktiviti CMA [46].

Ingeneral, substrat CMA cepat terdegradasi selepas translokasi [6]. Oleh itu, perbandingan aras lisosom substrat CMA dalam sel atau haiwan antara model yang dirawat atau dirawat dengan perencat protease lisosom (iaitu, leupeptin) membolehkan pengukuran fluks dalam nilai CMA [24].

4.2. Ujian Fungsian

Beberapa ujian berfungsi membolehkan penjejakan aktiviti CMA dari semasa ke semasa dalam sel, tisu dan organel terpencil.

4.2.1. Penilaian Kemerosotan Protein Intraselular

Kira-kira 30% daripada jumlah protein sitosol boleh didegradasi oleh CMA [9]. Walau bagaimanapun, pecahan sebenar protein sitosol yang terdegradasi oleh CMA berbeza-beza bergantung pada jenis sel dan keadaan selular [6].

Oleh itu, pengukuran kumpulan protein selular yang mengalami degradasi melalui CMA adalah kaedah biasa untuk menentukan keseluruhan aktiviti laluan CMA [46].

Eksperimen nadi dan kejar menggunakan asid amino berlabel radio dan perencat sama ada protease lisosom atau laluan autofagik lain boleh digunakan untuk mendiskriminasi protein yang mengalami degradasi CMA daripada yang diuruskan oleh laluan lain [50].

4.2.2. Wartawan CMA boleh tukar foto

Di samping itu, kaedah memantau persatuan lisosom wartawan CMA pendarfluor buatan juga berguna untuk mengesan penghantaran substrat dan degradasi melalui CMA [51].

Menggunakan wartawan pendarfluor fototukar [51], adalah mungkin untuk mengesan perkaitan protein yang ditukar foto dengan lisosom dalam saluran pendarfluor yang berbeza. Peningkatan bilangan puncta pendarfluor setiap sel akan menjadi penunjuk yang baik untuk pengaktifan CMA [46].

4.2.3. Analisis In Vitro CMA Menggunakan Lisosom Terpencil

Perbincangan silang antara laluan autofagik yang berbeza menjadikannya sukar untuk menilai dengan tepat aktiviti CMA dalam sel utuh [41]. Oleh itu, kita mesti menganalisis secara berasingan semua langkah fungsi yang terlibat dalam proses degradasi dinamik laluan CMA [46,49].

Pendekatan yang paling boleh dipercayai untuk menganalisis aktiviti CMA diperolehi melalui penyusunan semula in vitro CMA dengan lisosom terpencil [52]. Pengasingan pecahan khusus lisosom yang aktif dalam CMA membolehkan analisis kandungan substrat CMA endogen dalam petak CMA [47].

Lisosom terpencil juga membenarkan penyusunan semula CMA secara in vitro untuk mengikuti langkah-langkah yang terlibat dalam pengikatan substrat-proses CMA, pengambilan lisosom, dan degradasi lisosom [50].

Rawatan dengan perencat protease lisosom diikuti dengan pengeraman dengan substrat CMA akan membolehkan pengukuran substrat terikat dan ditranslokasikan ke dalam lisosom (mengikat dan mengambil) [39].

Dengan mendiskaunkan jumlah substrat yang terikat kepada lisosomesin yang proteolisis tidak dapat dihalang, maka ia mungkin untuk mengira pengambilan [39,53].

Pecahan lisosom yang terpencil juga membolehkan perbandingan langsung perubahan dalam kandungan, pengubahsuaian selepas translasi, dan organisasi komponen CMA pada membran telisosomal. Pengurangan dalam tahap LAMP2A atau lys-hsc70 lisosom dalam lisosom terpencil menunjukkan penurunan aktiviti CMA [54,55], manakala peningkatan dalam LAMP2Alevels mencadangkan pengawalseliaan aktiviti CMA [56].

Di samping itu, nisbah LAMP2A lisosom yang dipasang ke dalam kompleks multimerik pada masa tertentu boleh ditentukan menggunakan elektroforesis bluenative lisosom terpencil dan imunoblot untuk LAMP-2A [57].

5. Penyakit Neurodegeneratif dan CMA

Neuron adalah sel pasca-mitotik dan memerlukan jentera degradasi protein yang cekap untuk mengekalkan homeostasis selular di bawah keadaan tekanan [58,59]. Kemerosotan proses penguraian protein dalam CNS menyebabkan pengagregatan protein yang menyimpang atau rosak, yang merupakan ciri tersendiri bagi banyak penyakit neurodegeneratif.

Bukti besar telah dikumpulkan bahawa disfungsi CMA dikaitkan dengan patologi yang berbeza dalam pelbagai penyakit neurodegeneratif yang menjejaskan CNS [1,14].

Dalam penyakit ini, pelbagai protein patogen telah dikenal pasti sebagai substrat CMA, seperti -synuclein dalam PD [60], Tauprotein dalam AD [61], huntingtin (Htt) dalam HD [62,63] dan TDP{{5} } dalam ALS dan FTLD [64,65].

5.1. Penyakit Parkinson

PD adalah salah satu gangguan neurodegeneratif yang paling biasa. Ciri-ciri patologi utama PD ialah kehilangan neuron dopaminergik secara beransur-ansur dalam substantia nigra dan pengagregatan protein-sinuklein dalam badan Lewy.

Banyak kajian telah menunjukkan bahawa kemerosotan CMA berkaitan dengan patogenesis utama PD [4,66]. Pada pesakit denganPD, tahap protein LAMP2A menurun di otak, menunjukkan bahawa aktiviti CMA dilemahkan [67,68].

Banyak kajian terdahulu telah mencadangkan bahawa perencatan laluan CMAdegradasi menyebabkan pengumpulan -synuclein, yang dikaitkan dengan kehilangan neuron dopaminergik secara beransur-ansur [8].

Yang penting, bentuk mutan A53T danA30P -synuclein yang dikenal pasti dalam PD keluarga tidak boleh didegradasi oleh CMA. Tambahan pula, bentuk mutan ini mengikat ketat kepada LAMP2A pada membran lisosom dan seterusnya menghalang degradasi normal substrat CMA lain secara in vitro [60,69]. Mutasi G2019S dalam protein kinase 2 ulangan yang kaya dengan leucine (LRRK2) boleh menjadi punca patologi PD keluarga. [70].

Mutan G2019S menghalang pemasangan dinamik kompleks translokasi CMA pada membran lisosom, menyebabkan disfungsi CMA dalam model amouse PD dan otak pesakit LRRK2 PD mutan [25]. Di samping itu, bentuk mutan patogen LRRK2 mengikat kepada Hsc70 sitosol dan berinteraksi secara tidak normal dengan komponen CMA, menyekat kemerosotan substrat CMA lain dan homeostasis protein neuron secara in vitro [25,71].

Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) berinteraksi secara fizikal dengan LAMP-2A,Hsc70 dan Hsp90 dan terlibat dalam mekanisme pengawalseliaan laluan CMA [72].Dalam kajian terdahulu, bentuk mutan I93M UCH-L1 telah dikenalpasti dalam satu PDfamily [73].

Ia juga telah dilaporkan bahawa mutasi I93M dalam UCH-L1 secara tidak normal meningkatkan interaksi dengan kawasan sitosolik LAMP2A, menghalang laluan CMA secara in vitro [74]. Tambahan pula, ungkapan bentuk mutan I93M sel inmammalian UCH-L1 mendorong peningkatan berkaitan perencatan CMA dalam jumlah synuclein [74].

Penemuan ini mencadangkan bahawa interaksi menyimpang bentuk mutan I93M UCH-L1 dengan jentera CMA mungkin mendasari patogenesis PD yang dikaitkan dengan pengagregatan -synuclein. Protein penyakit Parkinson 7 (PARK7), juga dikenali sebagai DJ-1, ialah protein pelbagai fungsi yang terlibat dalam pelbagai aktiviti selular, termasuk rintangan pengoksidaan [75].

PARK7/DJ-1mempunyai peranan penting dalam mengekalkan homeostasis mitokondria [75]. Telah dilaporkan bahawa mutasi dalam gen DJ-1 menjadi pengantara autosomal resesif dan bentuk awal PD [76]. Kekurangan DJ-1 mempercepatkan degradasi LAMP2A dalam lisosom, yang membawa kepada pengagregatan -synuclein [77 ].

Sebaliknya, DJ-1 dapat menghalang pengumpulan -synuclein dengan mengawal selia CMA [78]. Secara keseluruhannya, pelbagai mekanisme molekul yang menyebabkan disfungsi CMA dianggap mendasari patogenesis PD.

Walau bagaimanapun, mekanisme patologi yang dikaitkan dengan CMA masih tidak jelas. Kajian lanjut akan diperlukan untuk menjelaskan hubungan antara proses CMA dan patologi sebenar PD.

5.2. Penyakit Alzheimer

AD adalah penyakit neurodegeneratif yang paling biasa di kalangan orang tua. Patogenesis utama AD ialah pembentukan amiloid-plak dan agregasi Tau yang disebabkan oleh kemerosotan homeostasis protein. Beberapa protein yang berkaitan dengan AD telah dikenal pasti sebagai substrat CMA. Degradasi CMA substrat protein ini telah ditunjukkan terjejas pada pesakit dengan AD [45,61,79].

Pengumpulan progresif amiloid-oligomer adalah peristiwa toksik pusat pada AD [80,81]. Satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa penandaan amyloid-oligomer dengan berbilang motif KFERQ menggalakkan kemasukan mereka ke dalam endosom dan lisosom, melindungi neuron kortikal kultur primer manusia daripada neurotoksisiti [82]. Protein prekursor amiloid (APP) ialah molekul patogenik yang penting dalam AD kerana ia boleh diproses untuk menghasilkan. amiloid- [83].

APP mengandungi motif seperti KFERQ di Cterminusnya. Motif ini penting untuk pemprosesan biasa dan degradasi APP untuk mengelakkan pengumpulan serpihan terminal APP-C [84]. Kajian baru-baru ini mendedahkan bahawa APP ialah substrat CMA yang mengikat Hsc70 [85].

Perencatan degradasi CMA APP meningkatkan sitotoksisitinya. Tambahan pula, pengaktifan CMA oleh Hsc70 overexpression atau Metformin mengurangkan terkumpul paras amiloid-plak otak dan membalikkan fenotip AD molekul dan tingkah laku dalam model tetikus AD [85]. Tau ialah protein sitosolik yang biasanya menstabilkan mikrotubul dalam sel neuron.

Tauprotein mempunyai motif penargetan CMA dan boleh direndahkan oleh laluan CMA [79]. Pengagregatan protein Tau mutan yang mengakibatkan hiperfosforilasi Tau dan pembentukan kusut neurofibril adalah ciri AD dan tauopati yang berkaitan [86,87].

Di samping itu, protein Tau temutan boleh berinteraksi secara tidak normal dengan LAMP2A dan menghalang translokasi ke dalam lumen lisosom, menjejaskan aktiviti CMA [79]. Pengawal selia calcineurin 1 (RCAN1) ialah substrat CMA [45] dan dinaikkan pada pesakit dengan AD [88].

RCAN1 adalah perencat defosforilasi protein Tau yang bergantung kepada calcineurin. Yang penting, aktiviti CMA boleh dihalang dengan meningkatkan tahap RCAN1, dengan itu menjejaskan degradasi substrat lain CMA [45].

5.3. Penyakit Huntington

HD ialah gangguan neurodegeneratif lewat yang dicirikan oleh pergerakan yang tidak terkawal, demensia, dan gangguan emosi. HD ialah penyakit yang diwarisi secara dominan disebabkan oleh pengumpulan dan pengagregatan protein Htt mutan dalam neuron striatal dan kortikal.

Htt mengandungi saluran poliglutamin (polyQ) terminal-N yang berkembang secara tidak normal [62,63,89]. Disfungsi degradasi Htt dicadangkan sebagai patogenesis utama HD.

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa CMA terlibat dalam degradasi Htt mutan dalam model selular dan tetikus HD [62]. Htt mempunyai motif KFERQ yang diduga dan berinteraksi dengan komponen utama CMA, Hsc70 dan LAMP2A. Di samping itu, Htt mutan dengan pengembangan saluran poliQ memaparkan penyerapan terjejas oleh CMA secara in vitro [89].

Bukan sahaja CMA tetapi makroautofagi terlibat dalam degradasi Htt [90]. Htt boleh mengikat kedua-dua LAMP2A dan protein berkaitan makroautophagy Atg7 dalam proses degradasi [89,91,92].

Aktiviti CMA dilaporkan dikawal dalam model selular dan haiwan HD pada peringkat awal penyakit ini. Walau bagaimanapun, aktiviti CMA berkurangan semasa peringkat akhir penyakit [91]. Penemuan ini menunjukkan bahawa peningkatan awal dalam aktiviti CMA mungkin merupakan peraturan pampasan sebagai tindak balas kepada ketidakcekapan makroautophagy. Penurunan tahap LAMP2A lisosom menunjukkan bahawa terdapat kehilangan fungsi CMA dalam fasa akhir HD [91].

5.4. Sklerosis Lateral Amyotrophic dan Degenerasi Lobar Frontotemporal

ALS dan FTLD adalah penyakit neurodegeneratif dengan banyak ciri klinikal dan patologi yang serupa [93]. Tindak balas transaktivasi protein pengikat DNA 43 kDa (TDP-43) ialah protein ribonuklear yang mengawal banyak aspek metabolisme RNA.

Pengumpulan serpihan TDP-43 C-terminal dalam sel neuron kerap dikesan pada pesakit dengan ALS dan FTLD [65]. Oleh itu, pengumpulan TDP{3}} secara meluas dianggap sebagai ciri penyakit ini.

Protein TDP-43 mengandungi motif seperti KFERQ yang mengikat Hsc70 dan boleh direndahkan melalui proses CMA [94,95]. Ekspresi Hsc70 dilaporkan berkurangan dalam limfomonosit pesakit ALS sporadis dan menyumbang kepada pengumpulan TDP-43 [64].

Mutasi dalam motif seperti KFERQ dalam TDP-43 boleh mengganggu degradasinya melalui CMA, mendorong pengumpulan TDP-43 dan perencatan CMA dalam sel kultur [94]. CMA boleh membantu mengawal pusing ganti bentuk fisiologi dan patologi TDP-43 [94].

For more information:1950477648nn@gmail.com