Penyedutan Ringkas Sevoflurane Boleh Mengurangkan Pembentukan Parut Glial Selepas Kecederaan Otak Hypoxic-iskemik dalam Tikus Neonatal Bahagian 2

PCR masa nyata

Jumlah RNA diekstrak daripada tisu hippocampal anak anjing pada 12, 24, dan 48 jam selepas pembedahan menggunakan TRIzolreagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat). DNA pelengkap telah disintesis menggunakan kit RT-PCR Superscript II lanjutan (Invitrogen).

Kecederaan hipoksik-iskemia merujuk kepada keadaan patologi yang disebabkan oleh iskemia serebrum, hipoksia, gangguan metabolik, dan kerosakan sel saraf akibat gangguan sistem kardiovaskular dan serebrovaskular. Dengan kemajuan sosial dan perubahan gaya hidup, kecederaan hipoksik-iskemia menjadi semakin biasa. Keadaan ini boleh menyebabkan banyak kemudaratan kepada kesihatan manusia, termasuk menjejaskan kecerdasan dan ingatan seseorang.

Walaupun hipoksia dan iskemia boleh menyebabkan kemerosotan dalam fungsi otak, ia tidak bermakna ingatan akan terjejas secara negatif. Sebaliknya, kita boleh meningkatkan daya ingatan dan meningkatkan kecekapan otak melalui kaedah yang betul. Berikut ialah beberapa cara untuk membantu meningkatkan ingatan anda:

1. Pemakanan yang sihat: Kesan diet terhadap ingatan adalah sangat penting. Makanan yang kaya dengan protein, vitamin dan mineral boleh membantu mengekalkan sistem saraf dan fungsi pemikiran yang sihat.

2. Banyakkan bersenam: Senaman fizikal boleh menggalakkan peredaran darah, meningkatkan aliran oksigen, meningkatkan imuniti badan, dan mengurangkan risiko penyakit. Melalui senaman, anda boleh meningkatkan keupayaan ingatan anda.

3. Mengukuhkan keyakinan diri: Keyakinan adalah faktor penting dalam ingatan seseorang. Jika anda percaya bahawa anda boleh menyelesaikan tugas tertentu, anda akan mencapai hasil yang anda inginkan dengan mudah, dan anda juga boleh meningkatkan ingatan anda dengan berkesan.

Dapat dilihat bahawa kecederaan hipoksik-iskemia bukanlah satu keadaan yang pasti akan menjejaskan ingatan manusia. Selagi kita menguasai kaedah yang betul dan menjaga otak kita dengan baik, kita boleh menerima masa depan yang sihat dengan sikap yang positif. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche deserticola boleh meningkatkan ingatan dengan ketara, kerana Cistanche deserticola mempunyai kesan antioksidan, anti-radang dan anti-penuaan, yang boleh membantu mengurangkan pengoksidaan dan tindak balas keradangan dalam otak, dengan itu melindungi kesihatan sistem saraf. Selain itu, Cistanche deserticola juga boleh menggalakkan pertumbuhan dan pembaikan sel saraf, sekali gus meningkatkan ketersambungan dan fungsi rangkaian saraf. Kesan ini boleh membantu meningkatkan ingatan, pembelajaran, dan kelajuan pemikiran, dan mungkin juga menghalang perkembangan disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik tahu cara untuk meningkatkan fungsi otak

Pewarna SYBR Green I pendarfluor (Campuran PCRMaster Hijau SYBR, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dan 1μL DNA pelengkap transkripsi terbalik telah digunakan untuk mengesan sintesis DNA oleh PCR masa nyata dengan primer khusus HIF-1 -.

Dalam sistem penguatan DNA masa nyata gen rotor (Corbett Research, Sydney, Australia), PCR dilakukan dengan kitaran berikut: denaturasi pada 95 darjah selama 15 minit; 40 kitaran 95 darjah (20 saat), penyepuhlindapan pada 58 darjah selama 25 saat , dan tarik ke bawah pada 72 darjah selama 35 saat. Pemantauan produk pendarfluor telah dijalankan untuk masa lanjutan pada 72 darjah.

Perisian analisis gen pemutar (Corbett Research) telah digunakan untuk menyeragamkan gen pengemasan GAPDH dan mengukur ekspresi gen relatif. Semua jujukan primer ditunjukkan dalam Jadual 1.

pewarnaan Nissl
Otak tikus telah disediakan menjadi kepingan 28 hari selepas pembedahan seperti yang dinyatakan di atas untuk imunohistokimia. Setiap otak dipecahkan secara berturut-turut, dan tiga bahagian otak yang serupa telah dipilih untuk pewarnaan Nissl.

Menggunakan kamera mikroskop digital Nikon C1 (Nikon Corporation, Tokyo, Jepun), mikrofotograf tipikal hippocampal CA1, CA3 dan DGareas telah ditangkap. Beberapa sel yang dikira dalam setiap tiga bahagian telah dilakukan secara buta menggunakan perisianImageJ.

Ujian tingkah laku

Tikus telah disapih pada 3 minggu, dibahagikan kepada tiga hingga lima kumpulan, dan disimpan dalam sangkar mengikut tugasan kumpulan. Ujian tingkah laku telah dijalankan pada tikus P28-P33 (iaitu 21-26 hari selepas pembedahan), seperti yang diterangkan sebelum ini (Wang et al., 2019a). )tetapi dengan sedikit pengubahsuaian. Untuk mengecualikan pengaruh kitaran theestrous pada tingkah laku tikus, hanya tikus jantan telah diuji.

labirin air Morris

Ujian maze air Morris digunakan untuk menilai kebolehan pembelajaran ruang dan ingatan tikus P28-P33 (Wang et al., 2019a).

Pengujian terdiri daripada dua fasa termasuk bahagian latihan dan ujian pencarian spatial. Selama 5 hari berturut-turut, empat bahagian latihan telah dilaksanakan setiap hari bermula jam 8:00pagi. Untuk ujian pengesanan platform, 10 tikus daripada setiap kumpulan diletakkan secara individu ke dalam air di pelbagai lokasi, secara stokastik, menghadap dinding kolam.

Jika seekor tikus berjaya mengesan platform dalam masa 90 saat, ia terpaksa berada di platform selama 20 saat dan masa yang diambil untuk mengesan platform itu direkodkan sebagai latensi melarikan diri. Setiap pusingan ujian adalah 90 saat, dan kependaman melarikan diri diukur sebagai masa dari tikus diletakkan di dalam air hingga berjaya menaiki pelantar.

Jika tikus gagal menjumpai pelantar dalam masa 90 saat, rakaman dihentikan dan pembelajaran serta bimbingan ingatan dilakukan (penguji menggunakan joran panjang untuk membimbing tikus ke pelantar dan membenarkan mereka berada di atas pelantar selama 20 saat untuk belajar). Semasa ujian, kependaman melarikan diri tikus yang gagal memasuki pentas direkodkan sebagai 90 saat.

Dalam ujian kuar ruang yang dilaksanakan pada hari keenam ujian, platform telah dikeluarkan dan tikus diletakkan di kuadran bertentangan dan dibenarkan berenang selama 90 saat. Kelajuan berenang, kependaman melarikan diri dan kekerapan mereka melintasi tempat di mana platform berada sebelum ini telah dirakam oleh sistem penjejakan video (Shanghai MobileDatum Ltd., Shanghai, China).

Ujian penggantungan

Ujian penggantungan dilakukan ke atas tikus P28–P32 untuk menilai fungsi motor mereka, bermula jam 3 petang setiap hari. Tali plastik ahorizontal dengan 0.5 cm diameter diletakkan pada jarak 45 cm dari tanah, dan tikus dibimbing untuk memegang tali plastik dengan kedua-dua anggota atas, pada ketika itu masa sehingga tikus jatuh diukur sebagai kependaman penggantungan.Ujian berakhir jika: (i) tikus itu terjatuh; (ii) kependaman penggantungan adalah lebih daripada 60 saat; atau (iii) tali itu ditangkap oleh anggota belakang.

Ujian lapangan terbuka

Ujian lapangan terbuka telah dijalankan ke atas tikus P28 menggunakan peralatan luar yang terdiri daripada kotak Plexiglas (100 cm × 100 cm;Borj Sanat, Tehran, Iran) yang dikelilingi oleh dinding setinggi 45-sm, dengan lantai terbelah kepada 16 petak. Kawasan tengah ialah kawasan 50 cm × 50 cm di tengah arena. Setiap tikus diletakkan secara individu di tengah-tengah arena dan dibenarkan meneroka tanpa had selama 10 minit.

Sistem penjejakan video (Borj Sanat) digunakan untuk merakam dan menganalisis keseluruhan jadual (sebagai penunjuk aktiviti senaman) dan masa yang dihabiskan di kawasan tengah (sebagai penunjuk tingkah laku kebimbangan) (Zhai etal., 2019).

Pewarnaan Golgi

Selepas selesai ujian tingkah laku (iaitu 26 hari selepas pembedahan), lima ekor tikus dipilih secara rawak daripada setiap kumpulan. Pewarnaan Golgi dilakukan pada bahagian otak beku 150-μm-tebal menggunakan Kit FD Rapid Golgi Stain (FDNeuroTechnologies, Columbia, MD, USA) mengikut protokol pengeluar.

Perisian ImageJ digunakan untuk menganalisis ketumpatan tulang belakang (nombor tulang belakang setiap 10 μm) setiap neuron. Duri dikira pada dua atau tiga segmen sekunderdendrit.

Analisis statistik

SPSS 17.0 untuk Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) telah digunakan untuk menganalisis data, yang ditunjukkan sebagai min ± ralat piawai bagi min (SEM). Ujian Shapiro-Wilk digunakan untuk menguji andaian kenormalan di kalangan semua pembolehubah selanjar. Di samping itu, analisis sehala bagi varians diikuti oleh ujian perbandingan berbilang post hoc Tukey telah didekati dalam astring eksperimen.

Jika data gagal memenuhi andaian normal, ujian Kruskal-Wallis H atau Mann-Whitney Utest telah dilengkapkan secara berasingan. Kependaman melarikan diri dianalisis berdasarkan analisis dua hala bagi varians untuk pengukuran berulang. Nilai P < 0.05 dianggap sebagai signifikan secara statistik.

Keputusan

SPC meningkatkan kehilangan sel neuron hippocampal

Hippocampus, termasuk tiga kawasan yang diperiksa, dikaitkan dengan pembelajaran dan ingatan (Jung et al., 2020). Ujian selepas tingkah laku, pewarnaan Nissl dilakukan untuk memeriksa seni bina hippocampal.

Dalam kumpulan HI, ketumpatan neuron yang berdaya maju telah dikurangkan berbanding dengan kumpulan palsu. Walau bagaimanapun, bilangan neuron telah meningkat pada haiwan yang terdedah kepada SPC; kesan ini telah diterbalikkan oleh YC-1, yang mengurangkan ketumpatan neuron (Rajah 1A). Fenomena ini diperhatikan di kawasan CA1, CA3, dan DG hippocampus (P< 0.05; Figure 1B–D).

SPC menambah baik dan mengurangkan ketumpatan tulang belakang dendritik di kawasan CA1 hippocampal

Pewarnaan Golgi digunakan untuk mengesan ketumpatan tulang belakang neuronaldendritik piramid CA1 (Rajah 2A). Oleh kerana saiz duri sangat berbeza-beza (cth, dendrit bercabang, nipis atau cendawan), kami hanya menentukan bahawa ketumpatan duri dendritik meningkat dengan ketara dalam kumpulan HIS berbanding kumpulan HI (P < 0.{{6 }}5), manakala ketumpatan duri dendritik dikurangkan dalam kumpulan HIS + YC-1 berbanding kumpulan HIS (P <0.01; Rajah 2B).
SPC memperbaiki ekspresi PSD95 dan GAP43 dalam hippocampus

Kami menilai ungkapan protein berkaitan sinapsGAP43 dan PSD95 untuk menentukan sama ada ia dihalang oleh parut glial. HI mengurangkan ekspresi protein PSD95 (P < 0 dengan ketara.01) danGAP43 (P <0.05) berbanding dengan kumpulan sham (Rajah 2C–E). Berbanding dengan kumpulan HIS, tahap ekspresi PSD95 dan GAP43 telah menurun dengan ketara selepas suntikan{12}}YC.

Pembentukan astrogliosis dan parut glial merosakkan seni bina hippocampal selepas HI

Seterusnya, kami cuba mengesahkan sama ada sevoflurane meningkatkan pembelajaran dan fungsi ingatan dengan melindungi seni bina hippocampal dan melemahkan astrogliosis. Neonatal HIE menyebabkan apoptosis neuron dalam hippocampus, serta astrogliosis reaktif di kawasan infark yang kemudiannya berkembang menjadi parut glial (Rolls et al., 2009).

Dalam kumpulan HI, lapisan piramid CA1 dan CA3, dan rantau DG menunjukkan penurunan yang jelas dalam neuron (P < 0.01, P < 0.001; Rajah3E dan 4C), serta peningkatan bilangan astrosit dengan perubahan morfologi yang berbeza (P <0.001; Rajah 3C dan 4B). Kami menilai ekspresi GFAP dan NeuN dalam tiga kawasan hippocampus kiri menggunakan analisis imunohistokimia dan pembongkaran barat.

Keputusan kami menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan palsu, astrocytes telah diaktifkan dalam HIgroup, dimasukkan ke dalam lapisan piramida CA1 (Rajah 4A) dan CA3 (Rajah 3A), dan neuron dikelilingi dalam DG (Rajah3B). Astrogliosis yang berlebihan mengakibatkan lanjutan proses glial ke arah struktur neuron normal, membentuk jaring astrocyte seperti dinding yang menyimpang (Rajah 3A, B, dan 4A).

Selain itu, imunoreaktiviti GFAP (Rajah 3C, D dan 4B, E) dan tahap protein telah meningkat (P < 0.01; Rajah4E), manakala imunoreaktiviti NeuN berkurangan (P < {{7} }.01 atau P <0.001; Rajah 3E, F dan 4C). Untuk mengesahkan lagi pembentukan parut glial, kami menilai tahap ekspresi neurocanprotein dan imunoreaktiviti dalam hippocampus (Rajah 5A, B, dan 6A).

Keputusan imunofluoresensi pelabelan dua menunjukkan perbezaan ketara dalam keamatan pendarfluor neurocan+/GFAP+ imunostaining antara HI dan kumpulan palsu (P < 0.001, P < 0.05, P < 0.01; Angka 5G, H dan 6D), selaras dengan keputusan western blot (P< 0.01; Figure 6F).

SPC melemahkan astrogliosis dan pembentukan parut glial dalam hippocampus

Seterusnya, kajian kami menyiasat sama ada SPC melemahkan parut glial. Berbanding dengan kumpulan HI, imunoreaktiviti GFAP (Rajah 5C, D, dan 6C) dan neurocan (Rajah 5E, F, dan 6B) dalam kumpulan HIS telah dikurangkan dengan ketara dalam hippocampus (P < 0.{{6} }1 atau P < 0.001).

Sebaliknya, ekspresi GFAPdan neurocan dalam kumpulan HIS + YC-1 telah meningkat dengan ketara berbanding kumpulan HIS dan tidak berbeza daripada kumpulan HIS + YC-1 dan HI (P > 0.05; Rajah 6E dan F).

Di samping itu, imunopositif NeuN telah dikawal selia dan struktur kelihatan lebih teratur dalam kumpulan HIS berbanding dengan kumpulan HI, yang telah diterbalikkan oleh YC-1 (Rajah 3E, F, dan 4C).

For more information:1950477648nn@gmail.com