Meningkatkan Aktiviti Antikanser Aspergillus Favus "endophyte Of Jojoba" Taxol Melalui Konjugasi Dengan Nanopartikel Emas yang Diantarai Oleh ‑Penyinaran

Taxol Alternatif Herba Cina Cistanche

Kata kunci:Aspergillus favus · Jojoba · Kulat endofit · Nanozarah emas · Taxol · -Penyinaran · Pengoptimuman pemakanan

pengenalan

Taxol ialah salah satu spektrum luas yang paling dikomersialkanubat antikanser[1]. Aktiviti Taxol menghuraikan daripada kekhususannya yang unik untuk mengikat dengan tubulin selular -subunit heterodimer, menggalakkan pempolimeran tubulin, sekali gus mengganggu pembahagian mitosis sel tumor [2]. Taxol menunjukkan aktiviti yang kuat terhadap payudara, paru-paru, kepala, dan leher, kanser rahim, dan bentuk lanjut sarkoma Kaposi [3]. Taxol pertama kali dihasilkan daripada kulit pokok yew Taxus brevifolia "family Taxaceae" [4, 5]; bagaimanapun, hasil yang lebih rendah bagi Taxol makhluk itu<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asma,keradangan, danbarah[32]. Oleh itu, objektif utama kerja ini adalah untuk meneroka pengasingan kulat baru dari tumbuhan jojoba dengan kestabilan metabolik yang unik untuk pengeluaran Taxol, untuk menilai pendekatan yang berbeza untuk memaksimumkan hasil Taxol mereka, serta, untuk meningkatkan aktiviti antiproliferatif sebatian Taxol yang diekstrak. melalui konjugasi dengan nanopartikel emas, dimediasi oleh penyinaran gamma.

Bahan dan Kaedah

Pengasingan dan Pembiakan Kulat Endofit

Bahagian jojoba (Simmondsia chinensis) yang berbeza sebagai daun, kulit kayu, ranting, dan tunas dikumpulkan dari Fakulti Pertanian, Universiti Kaherah, dan digunakan sebagai sumber kulat endofit. Bahagian tumbuhan dikumpulkan dan dibasuh di bawah air paip yang mengalir, permukaan disterilkan dengan 70 peratus etanol selama 1 minit dan kemudian dibilas dengan air steril [28]. Bahagian tumbuhan yang disterilkan permukaan dipotong menjadi kepingan kecil di bawah keadaan steril dan diletakkan di atas pinggan medium agar-agar dekstrosa kentang (PDA), Czapek's-Dox, dan medium agar ekstrak malt [33-36], dan plat diinkubasi pada 30 darjah untuk 10 hari. Keberkesanan pensterilan permukaan bahagian tumbuhan dinilai dengan mengemparkan air bilasan, kemudian 500 ul air steril ditambah kepada mendakan dan disalut ke dalam medium PDA [37]. Pengasingan kulat endofit yang telah dimurnikan telah diinokulasi pada serong PDA selama 7 hari dan disimpan pada suhu 4 darjah.

Penyaringan, Pengekstrakan, dan Kuantifikasi Taksol daripada Kulat Endofit

Kulat endofit yang mendiami jojoba yang pulih telah disaring untuk pengeluaran Taxol dengan tumbuh pada sup dekstrosa kentang (PDB) [38]. Satu palam setiap 7 hari pengasingan fun gal telah disuntik ke dalam 100 ml PDB/250 ml tugas Erlenmeyer, diinkubasi selama 15 hari pada 30±1 darjah , dalam keadaan goncang (120 rpm). Selepas pengeraman, kultur ditapis, dan turasan dipinda dengan 0.2 peratus natrium bikarbonat untuk memendakan asid lemak. Taxol telah diekstrak dengan diklorometana, dan fasa organik dikumpul dan disejat hingga kering, dan sisa-sisa dilarutkan semula dalam metanol [17, 39]. Taxol dipisahkan dan dikenal pasti oleh TLC menggunakan plat gel silika prasalut Merck 1 mm (20×20 cm) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Jerman), dikesan oleh pencahayaan UV pada 254 nm [39]. Tompok-tompok yang diduga Taxol telah dikikis daripada plat gel silika TLC dan dilarutkan dalam metanol, dipusingkan dengan kuat selama 10 minit, dan disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 minit. Zarah silika termendak telah dikeluarkan dan supernatan telah diambil untuk pengiraan Taxol dan semakan ketulenan oleh HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) bagi lajur fasa terbalik C18 (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3.5 μm, Cat. # 959,963–902). Fasa bergerak yang digunakan ialah metanol/asetonitril/air (25:35:40, v/v/v) pada kadar fow 1.0 ml/min selama 20 minit [40], dan pecahan Taxol diukur pada 227 nm, dan identiti dan kepekatan kimia telah disahkan dari masa pengekalan dan kawasan puncak penyerapan berbanding dengan sampel tulen.

Pengenalpastian Morfologi dan Molekul Kulat Endofit yang Dipulihkan

Pengasingan kulat endofit telah dikenal pasti kepada tahap spesies mereka berdasarkan ciri makro dan mikro-morfologi mereka dengan berkembang pada PDA, Czapek's-Dox, dan media ekstrak malt mengikut kekunci rujukan [33-36]. Identiti isolat kulat penghasil Taxol yang paling mujarab telah disahkan secara molekul berdasarkan jujukan spacer transkripsi dalaman (ITS) [41, 42]. DNA genom kulat (gDNA) telah diekstrak dengan menghancurkan miselia (~0.2 g) dalam nitrogen cecair, kemudian mendispens dalam 1 ml penimbal pengekstrakan CTAB (2 peratus CTAB, 2 peratus PVP40, { {21}}.2 peratus 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl dalam 100 mM Tris−HCl, pH 8.0). Set primer PCR ialah ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ dan ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Tindak balas PCR mengandungi 10 ul campuran induk 2×PCR (i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul gDNA, 1 ul setiap primer (10 pmol/ul), dan dilengkapkan hingga 20 ul dengan suling steril air. PCR telah diprogramkan kepada denaturasi awal pada 94 darjah selama 2 minit, denaturasi pada 94 darjah selama 30 saat, penyepuhlindapan pada 55 darjah selama 10 saat, lanjutan pada 72 darjah selama 30 saat untuk 35 kitaran, dan lanjutan akhir pada 72 darjah selama 2 min. Amplikon PCR dianalisis dengan 1.5 peratus gel agarose dalam penampan 1×TBE (Ambion Cat# AM9864), menggunakan tangga DNA 1 kb (Cat. # PG010-55DI) dan divisualisasikan oleh sistem dokumentasi gel. Amplikon telah disucikan dan disusun oleh Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Versi 6.0 dengan set primer yang sama. Urutan yang diperolehi BLAST dicari secara tidak berlebihan pada pangkalan data NCBI, diimport ke dalam perisian MEGA 6.0, dan diselaraskan dengan algoritma otot Clustal W [43] dan pokok filogenetik telah dibina dengan kaedah penyambung jiran MEGA 6.0 [44].

Struktur Kimia Taxol yang Diekstrak

Tompok-tompok yang diduga Taxol telah dikikis daripada plat gel silika TLC dan disucikan, dan ketulenan dan kepekatan ditentukan oleh analisis UV-Vis pada λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Series) berbanding dengan Taxol tulen [39]. Media kosong di bawah keadaan yang sama digunakan sebagai garis asas negatif untuk analisis spektrofotometri. Spektrum FT-IR bagi sampel Taxol yang telah dimurnikan dianalisis oleh spektrofotometer JASCO FT-IR 3600. Sampel Taxol dikisar dengan pelet KBr, ditekan ke dalam cakera di bawah vakum, dan penyerapan diukur dalam rantau 400 hingga 4000 cm−1 [3], berbanding dengan yang tulen. Struktur kimia Taxol yang diekstrak telah disahkan daripada spektroskopi HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) berbanding dengan Taxol tulen. Sampel telah diselesaikan dalam CDCl3, anjakan kimia diberikan dalam ppm (skala δ), dan pemalar gandingan dinyatakan dalam hertz (Hz).

Kesan Pelbagai Jenis Media Terhadap Pengeluaran Taxol

Dua palam agar (9 mm) daripada kultur berumur 7 hari bagi setiap pengasingan kulat telah diinokulasi dalam tiga kali ganda ke dalam 100 ml medium/250 ml kelalang Erlenmeyer dekstrosa kentang (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D, dan ekstrak malt (ME ) media kuah. Kawalan tanpa inokulasi daripada setiap media yang bebas daripada spora kulat digunakan sebagai kawalan negatif, diinkubasi pada 30 darjah selama 15 hari di bawah keadaan yang sama. Selepas pengeraman, kultur kulat ditapis, dan Taxol diekstrak dan ditentukan seperti yang dinyatakan di atas.

Pengoptimuman Bioproses Keadaan Pemakanan untuk Memaksimumkan Hasil Taxol

Pengoptimuman komposisi sederhana untuk memaksimumkan hasil Taxol oleh pengasingan fun gal yang kuat telah dijalankan dengan metodologi permukaan tindak balas menggunakan reka bentuk Placket-Burman diikuti oleh reka bentuk komposit pusat [17–20, 45]. Daripada reka bentuk RSM, pembolehubah positif dan signifikan yang mempengaruhi pengeluaran Taxol oleh pengasingan kulat yang kuat telah dinilai menggunakan pakej perisian statistik oleh Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Setiap eksperimen dijalankan dalam tiga replika biologi dan nilai min telah dipertimbangkan. Selepas pengeraman pada keadaan yang dikehendaki, biojisim kulat ditapis, dan Taxol diekstrak dan dikira oleh TLC dan HPLC seperti yang diterangkan di atas.

Reka bentuk Placket-Burman

Reka bentuk placket-Burman telah kerap digunakan untuk pengoptimuman komponen media untuk pertumbuhan kulat dan pengeluaran metabolit sekunder bioaktif, menilai pembolehubah penting yang mempengaruhi pengeluaran Taxol [18, 20, 46]. Pemilihan faktor adalah berdasarkan media yang digunakan dalam saringan kualitatif dan kuantitatif. Sebelas faktor telah dimasukkan; ekstrak malt, pepton, sukrosa, soya, glutamin, ekstrak daging lembu, dan suhu, pH, masa pengeraman, dan nilai dan faktor kelajuan goncangan dipelbagaikan dalam dua peringkat, dan julat tahap minimum dan maksimum telah dipilih. Statistik Reka Bentuk-Pakar 7.0 digunakan untuk menjana satu set 12 eksperimen. Bagi setiap eksperimen, pengeluaran Taxol ditentukan dalam tiga replika biologi, dan purata hasil Taxol telah dipertimbangkan.

Analisis regresi data dijalankan menggunakan perisian statistik. Kesan setiap pembolehubah dikira (Biometrika, 2020), menggunakan persamaan berikut:

di mana, E ialah kesan pembolehubah ujian, M tambah, dan M− ialah kepekatan Taxol bagi percubaan di mana parameter masing-masing berada pada tahap yang lebih tinggi dan lebih rendah, dan N ialah bilangan eksperimen yang telah dijalankan. Kesan setiap pembolehubah ke atas pengeluaran ditentukan dengan mengira nilai-E masing-masing.

Di mana Tot tinggi ialah jumlah respons pada tahap tinggi, Tot rendah ialah jumlah respons pada tahap rendah, dan Tidak ialah bilangan percubaan.

Reka Bentuk Komposit Pusat dan Interaksi Antara Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Pengeluaran Taxol

Faktor positif yang paling ketara mempengaruhi pengeluaran Taxol oleh iso lewat kulat terpilih telah dioptimumkan menggunakan reka bentuk eksperimen model CCD jenis permukaan tindak balas [47]. Dengan menggunakan CCD, kepekatan komponen sederhana telah dioptimumkan, dan interaksi yang dikaji mereka digunakan untuk menghasilkan sejumlah 20 eksperimen untuk tiga pembolehubah. Untuk menentukan tahap optimum pembolehubah bagi pengeluaran Taxol daripada pengasingan kulat yang kuat, lengkung permukaan tindak balas tiga dimensi (3D) telah diplot untuk mengkaji interaksi antara pelbagai faktor dan untuk menentukan keadaan pembolehubah setiap faktor yang mempengaruhi pengeluaran Taxol. Graf 3D telah dijalankan dengan memegang tiga pemalar faktor dalam tahap yang ideal dan memplotkan tindak balas yang diperolehi hasil Taxol untuk pelbagai tahap dua faktor yang lain.

Kesan Penyinaran Gamma terhadap Hasil Taxol

Pengasingan endofit yang kuat yang menghasilkan Taxol telah terdedah kepada -penyinaran dengan 60sumber Kobalt (sel Gamma 4000-A-India) pada dos sinaran gamma yang berbeza (0.25–3.0 kGy) berbanding kepada kawalan budaya yang tidak disinari; kadar dos 1.2 kGy/j pada masa eksperimen. Media yang dioptimumkan telah diinokulasi oleh kultur yang disinari di bawah keadaan budaya standard, berbanding dengan inokulum spora yang tidak disinari sebagai kawalan. Kultur diinkubasi pada suhu 30±2 darjah selama 15 hari pada penggoncang berputar (120 rpm). Selepas pengeraman, kultur ditapis dan Taxol diekstrak, disucikan, dan dikira oleh TLC dan HPLC seperti yang diterangkan di atas.

Sintesis dan Pencirian Nanozarah Emas (AuNPs); Konjugasi dengan Taxol

Aktiviti Antikanser Taxol

Aktiviti konjugasi Taxol dan Taxol-PVP-AuNP yang telah dimurnikan terhadap karsinoma hati (HPG2), dan karsinoma payudara (MCF7) ditentukan oleh 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-ujian diphenyl tetrazolium bromide (MTT) [48]. Plat telaga 96-dibenih dengan 103 sel setiap telaga, dan diinkubasi semalaman pada 37 darjah , kemudian kepekatan ubat yang berbeza ditambah, dan plat diinkubasi semula selama 48 jam. Reagen MTT (25 ul) telah ditambah, dan diinkubasi selama 2 jam, dan warna ungu kompleks formazan yang dibangunkan diukur pada λ570 nm. Nilai IC50 dinyatakan dengan jumlah ubat yang mengurangkan pertumbuhan 50 peratus daripada bilangan awal sel tumor yang menormalkan kepada kawalan positif.

Aktiviti Antimikrob Konjugat Taxol dan Taxol‑AuNPs

Aktiviti antimikrob konjugat Taxol dan Taxol-AuNPs dinilai terhadap pencilan bakteria yang berbeza; Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, dan Enterobacter agglomerans, sebagai tambahan kepada Candida albicans. Sel-sel bakteria yang diuji telah digantung dalam air pepton steril untuk mendapatkan inokulum piawai ~0.5 McFarland (1–1.5) × 1{{10}}8 CFU/ ml pada λ6{{18 }}0 nm. Perencatan pertumbuhan (mm) pertumbuhan patogen mikrob dinilai dengan kaedah penyebaran cakera agar. Cakera antibiotik standard steril dengan diameter 6.0 mm digunakan sebagai kawalan positif. Cakera antibiotik steril (6.0 mm) dimuatkan dengan 20 ul metanol dan asid amoxicillin-clavulanic (AMC) sebagai kawalan negatif dan positif. Cakera dimuatkan dengan kepekatan Taxol, Taxol-PVP-AuNPs yang sama dan AuNPs (1.0 ug/ml). Tiga replika biologi telah disediakan. Plat diinkubasi pada 37 darjah selama 24 jam, dan zon perencatan diukur. Asid clavulanic amoxicillin (AMC) dan nystatin digunakan untuk menormalkan aktiviti antimikrob Taxol. Zon perencatan pertumbuhan ditentukan oleh angkup vernier (mm).

Analisis Statistik

Pengenalpastian Morfologi dan Molekul Pengeluar Taxol Yang Ampuh

Ciri-ciri morfologi pengasingan kulat kuat yang menghasilkan Taxol telah diperiksa mengikut kekunci deskriptif makroskopik dan mikroskopik, seperti yang diterangkan dalam Bahan dan Kaedah, dan mendedahkan kedekatan morfologinya dengan A. favus (Rajah 2). Pengasingan kulat telah ditanam pada PDA pada suhu 30 darjah selama 10 hari dan ciri makroskopik dan mikroskopik mendedahkan identitinya seperti kepala konidial, cara percabangan, identiti stigma, dan ontologi konid, dan pembentukan badan berbuah, menurut universal. kunci morfologi [33], dan didapati sama dengan Aspergillus favus. Pengasingan kuat yang menghasilkan Taxol A. favus dikenal pasti lagi berdasarkan urutan ITS mereka, menggunakan gDNA sebagai templat. Amplikon PCR (~ 550 bp) A. favus telah diselesaikan, disucikan dan disusun (Rajah 2). Urutan A. favus ITS adalah carian letupan tidak berlebihan pada pangkalan data NCBI, memaparkan 99 peratus persamaan dengan A. favus, dengan nilai sifar E. dan 95 peratus liputan pertanyaan. Oleh itu, daripada analisis mikroskopik dan molekul, pengasingan sasaran telah disahkan sebagai A. favus dan didepositkan pada GenBank dengan nombor penyertaan MW485934.1, serta, pengasingan telah didepositkan di Pusat Mikologi Universiti Assiut (AUMC), Mesir dengan nombor pemendapan AUMC13892. Pengasingan semasa mempunyai 99 peratus persamaan dengan pengasingan A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Rajah 1 Pandangan morfologi tumbuhan jojoba. B Kultur plat kulat endofit penghasil Taxol yang kuat; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23), dan A. oryzae Bd (25) pada PDA selepas 8 hari o pengeraman pada 30 darjah . Pengasingan kulat telah ditanam pada PDB, dan diinkubasi pada keadaan standard, dan Taxol diekstrak dan diperiksa oleh TLC (C). D Kromatogram HPLC Taxol daripada pencilan kulat yang kuat. E Hasil Taxol seperti yang dikira daripada HPLC. F, analisis spektrum UV-Vis bagi Taxol yang diekstrak daripada pencilan kulat. Analisis G FT-IR bagi Taxol yang diekstrak berbanding dengan yang sahih

Rajah 2 A Ciri makromorfologi A. favus an endofit jojoba selepas 3, 5, dan 8 hari pertumbuhan pada PDA. Ciri mikro-morfologi, kepala konid A. favus dengan pembesaran 400X. Amplikon C PCR bagi rantau A. favus ITS sebanyak 500 bp, menormalkan kepada tangga 1 kb (Cat.#. SM0312). D Analisis filogenetik ITS A. favus dengan kaedah kemungkinan maksimum [44]