Beta Vulgaris Rubra L. (Ubi bit) Ekstrak Metanol Kulit Mengurangkan Tekanan Oksidatif Dan Merangsang Pembiakan Sel Melalui Peningkatan Ekspresi VEGF dalam Sel Endothelial Urat Urat Manusia Bertekanan Oksidatif H2O2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

Abstrak:Kapasiti antioksidan polifenol dan flavonoid yang terdapat dalam agen pemakanan membantu dalam menangkap perkembangan spesies oksigen reaktif (ROS) dan melindungi sel otot licin endothelial daripada tekanan oksidatif/nekrosis yang disebabkan. Ubi bit (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) ialah sayuran yang biasa dimakan mewakili sumber antioksidan yang kaya. Sebatian bioaktif kulit bit dan peranannya dalam sel endothelial vena umbilical manusia (HUVECs) masih kurang diselidiki. Dalam kajian ini, ekstrak metanol kulit bit (BPME) telah disediakan, dan kesannya terhadap bio-efikasi, integriti nuklear, potensi membran mitokondria, pertumbuhan sel vaskular, dan tahap ekspresi gen yang berkaitan dengan imunoregulasi dalam HUVEC dengan tekanan oksidatif teraruh telah dianalisis. . Keputusan spektroskopi jisim kromatografi gas(GC-MS) mengesahkan bahawa BPME mengandungi 5-hidroksimetilfurfural (32.6 peratus ), metil piruvat (15.13 peratus ), furfural (9.98 peratus ), dan 2,3-dihidro{{ 14}},5-dihidroksi-6-metil-4H-Pyran-4-satu (12.4 peratus ). Ekstrak BPM berkesan meningkatkan percambahan sel dan disahkan oleh ujian MTT; integriti nuklear telah disahkan oleh ujian pewarnaan propidium iodide （PI）; potensi membran mitokondria（Aψm） telah disahkan oleh ujian pewarnaan JC-1. Ujian Annexin V mengesahkan bahawa HUVEC yang dirawat BPME menunjukkan 99 peratus sel berdaya maju, tetapi hanya 39.8 peratus daya maju ditunjukkan dalam HUVEC yang dirawat dengan H2O2 sahaja. Selain itu, rawatan BPME terhadap HUVEC selama 48 jam mengurangkan ekspresi mRNA lipid peroksida(LPO) dan meningkatkan NOS-3, Nrf-2, GSK-3 , GPX, sintase nitrik oksida endothelial (eNOS ), dan tahap ekspresi mRNA faktor pertumbuhan sel vaskular (VEGF). Kami mendapati bahawa rawatan BPME mengurangkan proinflamasi (faktor nuklear-k (Fk ), faktor nekrosis tisu- (TNF- ), reseptor seperti tol-4(TLR-4), interleukin-1 ( IL-1 ))dan keradangan vaskular (molekul lekatan intraselular (ICAM), molekul lekatan sel vaskular (VCAM), ekspresi mRNA berkaitan EDN, IL-1). Kesimpulannya, rawatan kulit ubi bit berkesan meningkatkan faktor pertumbuhan sel licin vaskular dan perkembangan mikrotubulus, manakala ia mengurangkan pengawal selia keradangan vaskular. BPM mungkin bermanfaat untuk penjanaan semula sel licin vaskular, pembaikan tisu, dan potensi anti-penuaan.

Kata kunci:ubi bit; tekanan oksidatif; mitokondria; angiogenesis; keradangan

1. Pengenalan

Angiogenesis ialah proses fisiologi vasculogenesis daripada vaskular sedia ada badan [1. Ia penting bukan sahaja untuk perkembangan dan pembiakan embrio tetapi juga untuk kitaran sel dan pembaikan tisu [2,3]. Walau bagaimanapun, ia dikaitkan dengan patogenesis pelbagai penyakit, seperti pertumbuhan tumor, artritis reumatoid, dan pelbagai penyakit iskemia dan keradangan [3-5]. Endothelium vaskular memainkan peranan penting dalam mengekalkan hemostasis vaskular dengan mengawal nada saluran darah dan tindak balas imun dan keradangan [6,7].puritans vitamin cSel endothelial (EC) adalah lapisan monoselular nipis yang melapisi semua permukaan dalaman saluran darah dan menghasilkan pelbagai molekul yang bertindak secara tempatan atau di tapak yang jauh [7]. Endothelium adalah asas untuk homeostasis badan, dan sebarang perubahan dalam tindak balas sel endothelium membawa kepada kejadian utama proses penyakit radang dan vaskular, seperti aterosklerosis dan hipertensi [6,8,9]. Penyakit ini menyebabkan tekanan oksidatif, yang mengubah struktur EC dan integriti fungsi dan membawa kepada disfungsi endothelial [9]. EC vena umbilical manusia (HUVECs) telah digunakan secara meluas sebagai model untuk kajian berkaitan endothelium vaskular manusia. Selain itu, mereka mewakili model yang berguna untuk mengkaji laluan biologi utama yang terlibat dalam fungsi endothelium [10].

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Sebatian bioaktif dan fitokimia banyak ditemui dalam buah-buahan, sayur-sayuran, herba hijau, dan banyak tumbuhan, yang mempamerkan banyak manfaat kesihatan, seperti sifat anti-radang, antioksidan, antikarsinogenik dan angiogenik [11-13]. Dalam hal ini, ubi bit merah (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) tergolong dalam keluarga Amaranthaceae dan diklasifikasikan sebagai salah satu sumber terbaik tahap antioksidan yang tinggi [14,15. Khususnya, ia mengandungi pelbagai fitokimia yang aktif secara biologi, termasuk betalain, flavonoid, polifenol, enzim terapeutik, asid askorbik, asid dehidroaskorbik (DHAA) dan nitrat tak organik (NO3)[16-18]. Selain itu, ia menyediakan nutrien penting yang berharga, seperti kalium, kalsium, magnesium, natrium, besi, zink, fosforus, tembaga, dan mangan [19]. Beberapa kajian telah melaporkan bahawa ekstrak ubi bit merah (akar) mempunyai banyak kesan berfaedah kerana sifat hipoglisemik, penurun lipid, anti-radang, antihipertensi dan antiproliferatifnya [20-22].sistancheSifat berfaedah ini semuanya boleh dikaitkan dengan kebolehan memusnahkan radikal bebas sebatian bioaktif. Oleh itu, pengambilan ubi bit merah telah dikaitkan dengan pelbagai manfaat pemakanan dan kesihatan. Kerana nilai pemakanannya, ia boleh digunakan sebagai sumber makanan berfungsi terhadap tekanan oksidatif yang mendorong penyakit metabolik kronik, seperti diabetes jenis 2 dan penyakit kardiovaskular [23].

Berdasarkan kajian literatur, Beta vulgaris mempunyai sifat antioksidan, imunoregulasi dan angiogenik yang kuat. Apigenin telah ditemui dalam daun bit; ia mempunyai kesan antiproliferatif dalam sel hati dan usus, dan ia boleh meningkatkan komorbiditi obesiti yang disebabkan oleh diet tinggi lemak melalui pengaktifan AMPK [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] mengenal pasti bahawa Beta vulgaris melindungi EC vaskular daripada tekanan oksidatif akibat luaran, yang mungkin disebabkan oleh kesan gabungan beberapa sebatian bioaktif yang terdapat dalam tumbuhan ini. Sehingga kini, tindakan mekanistik untuk percambahan EC dan kesan angiogenesis kulit akar Beta vulgaris kurang diteliti. Oleh itu, kami berhasrat untuk menjalankan kajian ini untuk mengkaji percambahan sel vaskular, perkembangan mikrotubulus, tekanan oksidatif, dan kapasiti angiogenesis yang berkaitan dengan kulit akar Beta vulgaris menggunakan morfologi selular dan analisis ekspresi gen dalam HUVECs. Kesan angiogenik ekstrak metanol kulit bit merah yang dikaitkan dengan integriti nuklear, pembangunan mikrotubule, kecekapan mitokondria, dan rangsangan kitaran sel dalam EC vaskular manusia diterokai.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1.Penyediaan Ekstrak Metanol Bit (Beta vulgaris rubra L.)

Sampel ubi bit segar (Beta Vulgaris var. Rubra L.; BVr.) pada mulanya diperoleh daripada kedai sayur-sayuran, di Riyadh, Kerajaan Arab Saudi(KSA). Ubi bit segar telah dibasuh dengan air suling untuk menghilangkan batang dan bahan cemar. Kulit luar dikupas untuk dikeluarkan dan dipotong menjadi kepingan kecil. Sampel dikeringkan di dalam ketuhar udara panas pada suhu 40 darjah dan kemudian dikisar hingga menjadi serbuk menggunakan pengisar elektronik. Kemudian, 500 g serbuk telah diekstrak dalam botol steril yang mengandungi 1 L metanol (Sigma, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 24 jam pada suhu bilik pada shaker dan diulang tiga kali. Selepas itu, penapis Whatman (Whatman, Clifton, NJ, USA) telah digunakan untuk menapis ekstrak. Akhirnya, dengan mengurangkan tekanan, pelarut dipisahkan daripada ekstrak, dan ekstrak dikumpulkan sebagai bahan kering pepejal selepas penyejatan metanol. Sampel yang diekstrak disimpan di dalam peti sejuk pada suhu 4C sehingga digunakan selanjutnya.

2.2. Kromatografi Gas & Analisis Spektroskopi Jisim

Ekstrak metanol kulit bit(BPME) telah disuntik ke dalam lajur kapilari silika (30 m ×0.25 mm ID ×0.25 um ketebalan filem) instrumen GC-MS(Agilent 6890N/5973I , California, CA, USA) dengan pengesan selektif jisim untuk mengesan komposisi kimia. Suhu instrumen telah ditetapkan sebagai 70 darjah awal, memegang2min, hingga305 darjah pada 20 darjah/min, diikuti dengan menahan selama 1 minit. Jumlah masa berjalan GC ditetapkan kepada 45 minit dengan gas helium (99.999 peratus ) sebagai gas pembawa (kadar aliran malar 1.2 mL/min), 250 darjah sebagai suhu penyuntik, dan 230 darjah sebagai suhu sumber ion. Berdasarkan spektrum GC-MS, peratusan relatif komponen yang sepadan telah dikira dan spektrum jisim komponen yang tidak diketahui telah dikenal pasti melalui perbandingan dengan corak 62,000 yang diketahui yang terdapat di Institut Standard dan Teknologi Kebangsaan perpustakaan komputer (NIST08).

Cistanche boleh anti-penuaan

2.3. Bahan dan Bahan Kimia Kultur Sel

HUVEC dibeli daripada American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Bahan kultur sel seperti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, trypsin, dan lain-lain diperoleh daripada Gibco (Paisley, UK). Penicillin-streptomycin (PS) dan fetal bovine serum (FBS) telah dibeli dari Hyclone Laboratories, Amerika Syarikat.apa itu cistancheBahan kimia yang digunakan dalam eksperimen biologi molekul diperolehi daripada Sigma-Aldrich, terutamanya, MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide], PI dan pewarnaan JC-1. Campuran Master PCR Hijau SYBR dan kit sintesis cDNA diperoleh daripada Qiagen (Hilden, Jerman).

2.4.HUVEC

HUVEC telah dikultur dalam DMEM dan ditambah dengan 1 peratus PS dan 10 peratus kompleks FBS. Sel-sel telah diinkubasi dalam suasana lembap pada 37C, 5 peratus CO, dan subkultur kira-kira setiap 3 hari.

2.5. Daya Tahan Sel dan Percambahan Sel oleh MTT Assay

HUVEC(1×104 sel/telaga) telah dikultur dengan medium penyelenggaraan dan dibenarkan melekat semalaman dalam 96-plat kultur telaga. Kemudian, medium telah digantikan dengan medium kultur baharu yang mengandungi peningkatan kepekatan BPME(0,0.05,{{10}}.1,0.2 ,0.4,0.8,1.6 dan 3.2ug/mL) mengikut peta plat ujian MTT dan diinkubasi selama 24 dan 48 jam; sel yang tidak dirawat digunakan sebagai kawalan. Selepas tempoh inkubasi, sel eksperimen dirawat dengan 20 μL/telaga 5 mg/mL MTT （3-【4,5-dimethylthiazol-2-yl】-2, 5-difeniltetrazolium bromida yang telah dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO)) dan juga diinkubasi selama 4 jam pada 37 darjah . Kemudian, medium dibuang, dan formazan ungu yang dihasilkan dibubarkan dalam 100μL 100 peratus DMSO. Penyerapan larutan diukur menggunakan pembaca plat mikro (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) pada panjang gelombang 570 nm. Peratusan( peratus )percambahan sel dikira dengan persamaan berikut:(penyerapan sampel/min penyerapan kawalan)× 100.

2.6. Reka bentuk eksperimen

Ujian percambahan sel sekarang menguji kepekatan BPME ({{0}} yang lebih rendah.1 dan 0.2 ug/mL) dan menunjukkan HUVEC yang membiak dan morfologi mikrotubulus tanpa ketoksikan. Isipadu 0.1 dan 0.2 ug/mL dos BPME telah dipilih dan dirawat dengan HUVEC normal dan 10 mM HUVEC bertekanan oksidatif yang disebabkan oleh H, O, selama 48 jam untuk menentukan percambahan sel, anti-radang , potensi angiogenik dan apoptosis (Rajah 1). Kawalan kenderaan juga dikekalkan selama 48 jam dalam kedua-dua kumpulan. Quercetin （10 μM） digunakan sebagai kawalan rujukan dalam kedua-dua kumpulan eksperimen.Cistanche anti penuaanSelepas pengeraman, sel yang tidak dirawat dan eksperimen dianalisis untuk morfologi sel dan nuklear dan potensi membran mitokondria menggunakan Kit BDM MitoScreen (C-1); apoptosis ditentukan oleh kaedah pengisihan sel berasaskan Annexin V/apoptosis dalam sitometri aliran. Tekanan oksidatif, dan tahap ekspresi gen berkaitan proinflamasi dan angiogenesis telah disiasat.

2.7.Ujian Pewarnaan Propidium iodide untuk Kerosakan Nuklear

Morfologi selular untuk kerosakan nuklear ciri, pyknosis atau perubahan morfologi apoptosis selepas rawatan dengan {{0}}}.1 dan 0.2 ug/mL BPME(dengan atau tanpa H, O2) dalam HUVEC ditentukan menggunakan analisis pewarnaan PI di bawah mikroskop pendarfluor terbalik, seperti yang diterangkan oleh Leite et al. [27].

2.8.Ujian Potensi Membran Mitokondria （△中m） oleh JC-1 Pewarnaan Pewarna

Potensi membran mitokondria (△!m) ditentukan oleh ujian JC{{0}} untuk menilai kecekapan mitokondria dalam kawalan kenderaan dan 0.1 dan 0.2 ug/mL HUVEC yang dirawat BPME (dengan dan tanpa H2O2). Secara ringkas, larutan pewarnaan JC-1 dicampurkan dengan isipadu medium kultur yang serupa dan kemudian ditambahkan pada HUVEC eksperimen dan diinkubasi dalam gelap selama 20 minit pada 37 darjah . Kemudian, pewarna JC-1 yang tidak terikat dibasuh dua kali dengan lembut menggunakan 200 μL penimbal pencuci pewarna JC-1 pada 4 darjah . Selepas itu, pengumpulan j-agregat terhadap pewarnaan JC{16}} telah diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor menggunakan mikroskop pendarfluor dan imej telah ditangkap. Selain itu, potensi membran mitokondria diukur dalam sitometri aliran menggunakan Kit BDIM MitoScreen (JC-1).

2.9. Analisis Vlapoptosis Annexin Menggunakan Sitometri Aliran

Kaedah pengesanan Annexin V/PI berasaskan sitometri aliran (Sigma Chemicals, USA) telah digunakan untuk mengukur sel yang berdaya maju, proapoptotik, apoptosis awal dan sel nekrotik. HUVEC akibat tegasan oksidatif(1×10 darjah /telaga) disalut dalam 24-plat perigi dan diinkubasi dengan BPME（0.1 dan 0.2 ug/mL）atau kawalan kenderaan untuk 48 jam Selepas pengeraman, sel telah diinkubasi dalam 400 μL 5 μL Annexin V-fluorescein isothiocyanate （FITC） dan 5 μL PI yang mengandungi penimbal pengikat; berikutan ini, sel disimpan selama 15 minit pada suhu bilik (RT) dalam gelap. Sel-sel telah dianalisis oleh sitometri aliran (BD Biosciences, San Jose, CA, Amerika Syarikat) untuk mengenal pasti sel apoptosis (PInegatif dan Annexin V positif) dan sel apoptosis lewat (PI-positif dan Annexin V positif) [28].

2.10. Analisis PCR Masa Nyata Kuantitatif

Fastlane@ Cell to cDNA kit (Qiagen, Hilden, Jerman) digunakan untuk mengekstrak jumlah RNA dan mensintesis cDNA daripada kawalan kenderaan, HUVEC yang dirawat BPME (dengan dan tanpa H-O2) menggunakan instrumen separa automatik PCR (qPCR) kuantitatif (Applied Biosystems). , Foster City, CA, Amerika Syarikat). Tahap ekspresi tekanan oksidatif termasuk (lipid peroksida, NOS-3), antioksidan (Nrf-2, GSK-3 dan GPx), proinflamasi (faktor nuklear-k (NF-k ), faktor nekrosis tumor- (TNF- ), interleukin-1 (IL-1 ), faktor pertumbuhan sel vaskular (VEGF), reseptor seperti tol-4(TLR-4), dan keradangan vaskular (molekul lekatan intraselular (ICAM), molekul lekatan sel vaskular (VCAM), gen berkaitan EDN1 dan endothelial nitric oxide synthase (eNOS)) dan gen rujukan, -actin, dianalisis dalam HUVEC dan dikira dengan kaedah Yuan et al. [29]. Nilai amplifikasi (ACt) dikira dengan perbezaan antara Ct (dirawat) dan Ct (kawalan). Ekspresi gen telah diplot menggunakan ungkapan 2-nilai AACt.

2.11.Analisis Statistik

Semua eksperimen telah direplikasi, dan data yang terhasil dinyatakan sebagai nilai min ± sisihan piawai (SD). Analisis statistik perbezaan antara kumpulan dilakukan dengan analisis varians sehala (ANOVA) menggunakan perisian SPSS (Versi 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).cistanche beefíciosKemudian, ujian perbandingan berganda Tukey dijalankan sekiranya terdapat perbezaan yang signifikan. Semua keputusan telah dibentangkan sebagai min ± SD untuk enam ulangan dalam setiap kumpulan. Nilai-p < 0.05="" dianggap="" penting="">

3. Keputusan

3.1.Molekul Bioaktif dalam BPME

Juzuk kimia BPME telah disahkan menggunakan GC-MS(Turbomass, PerkinElmer)Komposisi kimia ekstrak kulit ubi bit ditentukan dengan membandingkan spektrum jisim yang tersedia dengan pangkalan data Spektrum Institut Standard dan Teknologi Kebangsaan (NIST). Keputusan GC-MS mengesahkan bahawa BPME mengandungi hydroxyacetone (8.18), 5-hydroxymethylfurfural (32.6 peratus ), metil piruvat(15.13 peratus ),beta-d-alopyranose(1.48 peratus ), furfural (9.98 peratus ),{ {15}}hydroxy-gamma-butyrolactone (1.32 peratus ),dan 2,3-dihydro-3.5-dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran{ {27}}satu(12.4 peratus ;Rajah 2a,Jadual 1).

3.2.Percambahan Sel

Potensi percambahan sel in vitro BPME terhadap HUVEC dibentangkan dalam Rajah 2b. Tiada perencatan pertumbuhan sel yang ketara diperhatikan dalam kumpulan eksperimen berbanding dengan kawalan kenderaan. Ia telah disahkan oleh kajian ini bahawa meningkatkan kepekatan BPME yang dirawat dengan HUVEC menyebabkan peningkatan percambahan dan daya maju sel selepas 48 jam (112 peratus) jika dibandingkan dengan 24j (103 peratus) rawatan. Di samping itu, imej mikroskopik cahaya HUVEC yang dirawat BPME selepas 48 jam mengesahkan sel normal dengan bentuk seragam morfologi sel yang melekat, peningkatan bilangan sel yang membiak (replikasi) tanpa sebarang kerosakan adalah jelas (Rajah 2c).

3.3.Analisis Morfologi Sel dan Nuklear, Pembentukan Mikrotubul dan JC-1 Kekal dalam HUVECS

Rajah 3 menunjukkan morfologi perkembangan mikrotubul dalam imej mikroskopik pendarfluor. HUVEC bertekanan oksidatif yang disebabkan oleh H2O2-menunjukkan percambahan yang lemah dan morfologi sel yang tidak teratur berbanding dengan HUVEC kawalan. HUVEC biasa yang dirawat dengan 0.2 ug/mL BPME menunjukkan sel membiak melalui replikasi atau neogenesis dengan morfologi mikrotubulus. Sementara itu,0.1 ug/mL dos sel yang dirawat BPME menunjukkan 1{{10}}0 peratus sel melekat dengan peringkat awal mikrotubul. HUVEC bertekanan oksidatif yang dirawat dengan 0.2 ug/mL BPME mengenal pasti sel baru yang membiak dengan morfologi mikrotubulus dan mengurangkan kerosakan sel oksidatif. Di samping itu, 0.1 ug/mL BPME juga meningkatkan morfologi sel vaskular normal dengan sel yang membiak.

Rajah 4a menunjukkan morfologi normal struktur nuklear, dengan bentuk sfera, dalam kawalan dan HUVEC yang dirawat BPME（0.1 atau 0.2 ug/mL）. Rajah 4b menunjukkan imej untuk pewarnaan PI bagi normal dan HUVEC dengan tegasan oksidatif yang disebabkan oleh H, O. H2O2-HUVEC yang dirawat menunjukkan nukleus dengan bentuk yang tidak sekata, menunjukkan pemeluwapan dan pyknosis selepas 3{{10} } min. Walau bagaimanapun,0.2 ug/mL rawatan BPME untuk HUVEC di bawah tekanan oksidatif menunjukkan nukleus bulat dengan morfologi normal. Berbanding dengan 0.2 ug/mL ekstrak BPME, 0.1 ug/ml BPME mempunyai kesan perlindungan yang lebih rendah terhadap tekanan oksidatif akibat H2O2-dalam HUVEC.

Rajah 5a menunjukkan hasil pewarnaan JC-1 untuk HUVEC, termasuk kawalan dan sel yang dirawat BPME; angka itu menggambarkan sel-sel yang sihat dengan mitokondria aktif, seperti yang disahkan oleh pengambilan mitokondria bercas negatif daripada JC kationik lipofilik ekstramitokondria -1(warna hijau) dan agregat J yang ditukar dengan warna merah intramitochon-benar-benar. Rajah 5b menunjukkan hasil pewarnaan JC-1 untuk 0.2 ug/mL BPME yang diberikan kepada HUVEC dengan tegasan oksidatif yang disebabkan oleh H2O2; keputusan mengesahkan hampir 94 peratus mitokondria bercas negatif menukarkan JC kationik lipofilik-1(warna hijau) kepada agregat J warna merah jika dibandingkan dengan 0.1 ug/mL rawatan BPME (61.4 peratus ) atau

Tekanan oksidatif yang disebabkan oleh H O, dalam HUVEC (2 peratus). Potensi membran mitokondria (MMP) diperhatikan lebih tinggi dalam sel yang dirawat BPME berbanding dengan quercetin ubat rujukan.

3.4. Potensi Membran Mitokondria Bantuan FACS (△pm; BD MitoScan) dan Analisis Annexin V/apoptosis dalam HUVEC

Figure 6 shows the mitochondrial membrane potential capacity in BD MitoScan analysis after 0.2 ug/mL of BPME treatment of normal HUVECs and HUVECs with oxidative stress induced by H>O, Kami mendapati bahawa 0.2 ug/mL rawatan BPME meningkatkan MMP(Aum) kepada 92.7 peratus ± 3.7 peratus jika dibandingkan dengan HUVEC yang dirawat dengan HO2 sahaja (27.9 peratus ±7.2 peratus ). Sebaliknya, sel yang dirawat kuersetin menunjukkan peratusan peningkatan MMP (Aum) sebanyak 41.4 peratus ±1.6 peratus jika dibandingkan dengan HUVEC yang dirawat dengan BPME dan H2O2 atau H2O2 sahaja.

3.5. Kuantifikasi Tahap Ekspresi Gen dalam HUVEC

Tekanan oksidatif(LPO3), antioksidan (NOS-3, Nrf-2, GSK-3 dan GPX), proinflamasi (IL-1 , TNF- , NF-band TLR{ {7}}), dan tahap ekspresi mRNA yang berkaitan dengan VCAM, ICAM, EDN, eNOS) dan VEGF dikira dalam kawalan kenderaan,0.1 dan 0.2 ug/mL daripada HUVEC yang dirawat BPME dan quercetin （10 μM） selepas 48 jam （Rajah 8）. Kami mendapati dengan ketara (hlm<0.001) increased="" levels="" of="" lpo,="" nos-3,="" and="" nf-kb.il-1.tnf-α,="" vcam,="" icam,="" edn,="" and="" enos="" expression="" and="" decreased="" nrf-2,="" gsk-3β,="" and="" gpx="" levels="" in="" ho,-induced="" huvecs.="" treatment="" with="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme="" significantly="" decreased="" oxidative="" stress="" and="" vascular="" inflammation="" and="" increased="" antioxidant="" factor-related="" mrna="" expression="" when="" compared="" with="" oxidative-stressed="" huvecs.="" vegf="" expression="" levels="" showed="" a="" significant="" two-fold="" increase="" in="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme-treated="" cells="" only="" when="" compared="" to0.1="" ug/ml="" of="" bpme.="" vegf="" expression="" was="" not="" detected="" in="" huvecs="" with="" oxidative="" stress="" induced="" by="" h2o2.="" the="" observed="" effect="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" 0.1="" ug/ml="" bpme="" or="" quercetin="" (10="">

4. Perbincangan

Apabila tekanan ekstraselular atau intraselular, bioavailabiliti spesies oksigen reaktif (ROS) mengatasi pertahanan antioksidan, dan tekanan oksidatif mengganggu isyarat dan kawalan redoks [31]. Perkembangan tekanan oksidatif dikaitkan dengan patogen dari gangguan kronik, seperti penyakit neurodegeneratif, diabetes, dan aterosklerosis. Seperti, tekanan oksidatif memulakan disfungsi endothelial dan menggalakkan keradangan sistemik dan pengambilan makrofaj [32]. Sel imun yang diaktifkan berhijrah ke dalam vasculature dan membebaskan sitokin dan kemokin yang berkaitan dengan vasoconstriction dan pembentukan semula saluran darah sel otot licin dan keradangan yang menjejaskan sel otot licin vaskular dan dinding vaskular [33]. Peningkatan tekanan oksidatif vaskular berakhir dengan kerosakan vaskular, kekejangan sel otot licin, dan keabnormalan elastin struktur. Di samping itu, tekanan oksidatif vaskular telah dirangsang dalam keadaan patologi lain, seperti obesiti visceral atau aterosklerosis, kerana peningkatan aktiviti NADPH oxidase (NOX-2) dalam tisu adipos perivaskular [34]. Tekanan oksidatif vaskular menyebabkan perubahan epigenetik utama yang berlaku semasa penuaan, dan ia berakhir dengan proses penuaan awal [35].

Perkembangan pengeluaran ROS dan tekanan oksidatif dalam sistem biologi sebahagian besarnya bergantung kepada disfungsi mitokondria, sebagai tambahan kepada NOX-2, endothelial xanthine oxidase, eNOS tidak berganding, dan lipoxygenase [36]. Sifat antioksidan agen pemakanan boleh meneutralkan penjanaan ROS melalui peningkatan kapasiti antioksidan [26]. Ekstrak Ginkgo Biloba melindungi daripada perkembangan aterosklerosis dengan mengurangkan penjanaan ROS dan aktiviti lipoxygenase dalam disfungsi endothelial yang disebabkan oleh OxiLDL [37]. Di samping itu, pelbagai sebatian fenolik dan flavanoid daripada tumbuhan dan bijirin yang boleh dimakan mempunyai sifat untuk menghilangkan ROS dan peroksidasi lipid [38]. Ekstrak metanol kulit ubi bit (Beta vulgaris) mempunyai potensi antioksidan kerana ketersediaan serat yang tinggi, anthocyanin, dan flavonoid seperti vitexin dan betanin [39]. Dalam kajian ini, BPME telah dipilih untuk mengenal pasti pendekatan mekanistik yang bergantung kepada mitokondria untuk mengetahui kesannya terhadap potensi membran mitokondria, pelindapkejutan LPO, dan perencatan tahap ekspresi mRNA yang berkaitan dengan keradangan vaskular.

Ujian MTT mengesahkan bahawa BPME meningkatkan percambahan sel dengan ketara, seperti yang disahkan oleh peningkatan integriti nuklear dalam pewarnaan PI dengan dos berkesan {{0}}.2 ug/mL BPME berbanding diuji 0. 1 ug/mL BPME. Pengenalpastian dos berkesan dengan kepekatan rendah dan aktiviti tertinggi boleh dianggap sebagai selamat dari segi fisiologi. Kami menjumpai pewarnaan mikroskopik pendarfluor JC-1, dan potensi membran mitokondria telah dipulihkan dalam kedua-dua normal dan H O, yang disebabkan oleh HUVEC bertekanan oksidatif yang dirangsang secara luaran selepas 0.2 ug/mL rawatan BPME. Disfungsi mitokondria mengubah fosforilasi oksidatif, yang gagal mengubah radikal oksigen (O,.-) kepada H, O, dan H, Oby glutathione peroxidase. Kerana detoksifikasi ROS yang tidak mencukupi atau pengeluaran ROS yang tidak terkawal, peningkatan tekanan oksidatif mitokondria dikaitkan dengan aterosklerosis [40]. Ekstrak kulit ubi bit berkesan memulihkan potensi membran mitokondria, yang berjaya meningkatkan detoksifikasi ROS dan penjanaan H2O2. Analisis pewarnaan Annexin V / PI mengesahkan bahawa rawatan BPME mengekalkan peratusan sel yang berdaya maju dan meningkatkan peringkat percambahan sel kedua-dua dalam HUVEC dan HUVEC normal dengan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh H O. Dalam konteks ini, Choo et al. [41] mengesahkan bahawa selepas penjanaan ROS berlebihan atau H O eksogen, di tapak iskemia, sel stem mesenchymal (MSC) yang ditanam secara transplan boleh menjejaskan percambahan diri dan kapasiti berbilang keturunan. Dalam perubatan regeneratif, sel otot licin vaskular adalah pengawal selia utama arteri nada kontraktil melalui mengekalkan rintangan periferi arteri, pengawal selia tekanan darah, aliran darah, dan pembaikan arteri [42]. Selain itu, modulasi fenotip yang disebabkan oleh umur EC adalah dikaitkan dengan penurunan kontraktiliti selular dan peningkatan penuaan sel. Apabila tekanan berterusan atau kerana mekanosensitiviti yang berkurangan, penurunan penyesuaian isyarat persekitaran mikro dikenal pasti dalam sel otot licin yang berumur[43]. Keputusan sekarang mengesahkan bahawa rawatan BPME mengekalkan populasi sel yang berdaya maju, seperti yang dibuktikan oleh kapasiti angiogenesis.

Kapasiti percambahan BPME yang dikenal pasti pada HUVEC telah disokong oleh pengurangan dalam LPOexpression dan peningkatan ekspresi gen antioksidan. ROS dan LPO pada mulanya dijana daripada kompleks mitokondria(I dan I) dan NOX-4 semasa percambahan atau pembezaan sel [44]. ROS yang berlebihan bertindak balas dan merosakkan biomolekul, terutamanya mengubah integriti DNA genomik, yang penting untuk percambahan dan fungsi selular [45]. Walau bagaimanapun, telah disahkan bahawa pengambilan diet polifenol antioksidan, seperti epigallocatechin dan tocopherol, melindungi sel daripada tekanan oksidatif dan meningkatkan kapasiti percambahan [46]. Dalam kajian kami, tahap ekspresi mRNA LPO menurun, dan NOS-3, Nrf-2, dan eNOS didapati meningkat dua kali ganda dalam HUVEC dengan tekanan oksidatif yang disebabkan oleh Hoo. eNOS ialah isoform utama NOS, bertanggungjawab untuk kebanyakan produk NO dalam sel otot licin dan tisu vaskular. TIDAK. meluaskan semua jenis salur vaskular dan melindungi pengagregatan platelet dan lekatan leukosit dalam EC[47]. Setakat ini, terdapat banyak laporan yang bercanggah tentang faktor risiko kardiovaskular, dan disfungsi endothelial telah dikaitkan dengan penurunan atau peningkatan ekspresi eNOS [48]. Ekspresi eNOS yang tinggi telah diperhatikan pada penyakit vaskular, yang mungkin merupakan akibat daripada pengeluaran berlebihan H-Oz. O2-7, produk dismutasi, boleh meningkatkan ekspresi eNOS melalui mekanisme transkrip dan selepas transkrip [49]. Patogenesis penyakit vaskular disertai dengan degradasi dipercepatkan NO. selepas tindak balas dengan O2-7, dan akhirnya, bentuk ONOO, yang membawa kepada penyahgandingan eNOS dan disfungsi enzim NOX [50]. Tekanan oksidatif telah ditindas oleh enzim antioksidan dan tahap mRNA GSK-3 dan GPX telah meningkat selepas rawatan BPME. BPME mengandungi pelbagai fitokimia yang aktif secara biologi, termasuk betalain, flavonoid, polifenol, enzim terapeutik, asid askorbik, asid dehidroaskorbik (DHAA), dan nitrat tak organik (NOg), dan ini mungkin terlibat dalam pengawalseliaan kapasiti antioksidan dalam HUVEC. Dalam konteks ini, Cha et al. (2014) [51] melaporkan bahawa asid klorogenik secara berkesan melindungi daripada kerosakan DNA yang disebabkan oleh tekanan oksidatif dalam keratinosit manusia.

Endothelin-1 (Edn-1), vasokonstriktor yang berasal dari endothelium, melakukan penghijrahan sel otot licin dan bertindak sebagai faktor antiapoptosis dalam sel dengan tekanan yang disebabkan oleh nitrik oksida[52,53]. Proses pembentukan semula vaskular, penghijrahan, percambahan dan pengumpulan matriks ekstraselular telah dirangsang oleh kedua-dua Edn-1 dan NO [54,5]. Kami memerhatikan peningkatan ekspresi Edn-1 selepas rawatan BPME dalam HUVEC dengan tekanan oksidatif. Apabila tekanan oksidatif atau pengumpulan LPO, peringkat awal keradangan vaskular adalah lekatan leukosit ke sel otot licin endothelial, ia menonjol untuk kejadian kritikal iskemia dan aterosklerosis [56]. Ia dimediasi oleh ekspresi VCAM dan ICAM; ia telah dirangsang oleh kebanyakan ejen kemokin dan kemotaksis, seperti ungkapan NF-kB, IL-1 dan TNF[57]. Perencatan pengaktifan IL-1 diikuti dengan ekspresi molekul lekatan telah dicapai oleh asid ellagic sebatian fenolik pemakanan [58]. Rawatan dengan BPME kepada HUVEC yang dirangsang secara luaran dengan tekanan oksidatif telah mengurangkan dengan ketara faktor proinflamasi khusus sel vaskular, seperti tahap ekspresi VCAM, ICAM, NF-KB, IL-1 dan TNF-x. Dalam konteks ini, Crespo et al. [59]melaporkan bahawa kaempferol dan quercetin menghalang gen pro-radang, seperti ekspresi VCAM, ICAM, NF- kB, dan IL-1, masing-masing. Secara keseluruhannya, perencatan tekanan oksidatif dan potensi ekspresi gen yang berkaitan dengan keradangan vaskular BPME mengutamakan ekspresi faktor pertumbuhan sel vaskular dan berpotensi membantu percambahan dan pertumbuhan sel vaskular.

5. Kesimpulan

Penemuan sekarang mengesahkan bahawa peningkatan ekspresi gen antioksidan dikaitkan dengan pelindapkejutan tekanan oksidatif, membantu untuk mengatasi kemerosotan percambahan HUVEC dan angiogenesis. Bawang putih hitam yang mengandungi hydroxymethylfurfural menyekat kesan keradangan lekatan sel monosit yang disebabkan oleh TNF pada HUVEC dan seterusnya menyekat penjanaan ROS, ekspresi VCAM-1 dan pengaktifan NF-kB [60]. Selain itu, He et al. [61] mengesahkan bahawa hydroxymethylfurfural mempunyai potensi untuk melindungi daripada hipoksia. Kulit ubi bit juga telah dikenal pasti mengandungi komponen flavonoid, furan dan antioksidan, seperti 5-hidroksimetilfurfural, metil piruvat, furfural dan 2,3-dihidro-3,5- dihidroksi-6-metil-4H-Pyran-4-satu; komponen ini bertanggungjawab untuk kapasiti antioksidan yang dipertingkatkan dan penindasan molekul lekatan sel otot licin vaskular proinflamasi. Kulit ubi bit telah digunakan sebagai perangsang untuk kumpulan antioksidan untuk memadamkan rangsangan luar atau rangsangan patologi dalaman tekanan selular peroksidatif. Penemuan kami membuktikan bahawa komponen bantuan bit dalam mengurangkan tekanan metabolik dan keradangan dalam HUVEC, yang mungkin bermanfaat untuk percambahan sel vaskular dan angiogenesis.

Artikel ini diekstrak daripada Gen 2021, 12, 1380. https://doi.org/10.3390/genes12091380 https://www.mdpi.com/journal/genes